专利名称：黄芪、红芪有效部位的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物的应用，具体地，涉及黄芪、红芪有效部位的应用。
背景技术：
肺纤维化，即肺脏间质组织由胶原蛋白、弹性素及蛋白醣类构成，当纤维母细胞受到化学性或物理性伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，进而造成肺脏纤维化；即肺脏受到伤害后，人体修复产生的结果。肺纤维化多在40-50岁发病，男性多发于女性。呼吸困难是肺纤维化最常见症状。轻度肺纤维化时，呼吸困难仅在剧烈活动时出现，因此常常被忽视或误诊为其他疾病。当肺纤维化进展时，在静息时也发生呼吸困难，严重的肺纤维化患者可出现进行性呼吸困难。其 他症状有干咳、乏力。50%患者有杵状指和发绀，在肺底部可闻及吸气末细小跑裂音。早期虽有呼吸困难，但X线胸片可能基本正常；中后期出现两肺中下野弥散性网状或结节状阴影，偶见胸膜腔积液，增厚或钙化。肺组织纤维化的严重后果，导致正常肺组织结构改变，功能丧失。就是大量没有气体交换功能的纤维化组织代替肺泡，导致氧不能进入血液。患者呼吸不畅，缺氧、酸中毒、丧失劳动力、靠呼吸机生存，最后衰竭、死亡。目前，治疗肺纤维化的方法一般为西医药物治疗，如，糖皮质激素(泼尼松又称强尼松)、免疫抑制剂或细胞毒药物(环磷酰胺、硫唑嘌呤)、抗氧化剂(氨溴素、牛磺酸)、抗纤维化药物(吡非尼酮、IT_受体拮抗剂、单克隆抗体、)、受体抑制剂(白三烯受体拮抗剂、肿瘤坏死因子-α抑制剂、状花生长因子_β抑制剂)、免疫调节剂(卡介菌多糖核酸、左旋咪唑)、其他药物(秋水仙碱、大环内酯类抗生素、干扰素- Y、血管紧张素转化酶抑制剂)以及基因治疗方法等，中药治疗还比较少见。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种应用黄芪、红芪有效部位治疗肺纤维化的中药治疗方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案黄芪、红芪有效部位在制备治疗肺纤维化药物中的应用。具体地，所述黄芪、红芪有效部位为黄芪多糖、黄芪黄酮、黄芪皂苷、红芪多糖、红芪黄酮、红芪皂苷中的一种或两种以上组合物。优选地，所述黄芪、红芪有效部位为红芪黄酮。本发明具有以下有益效果(I)肺系数结果显示模型组的肺系数明显升高；黄芪黄酮大剂量组、黄芪皂苷大齐IJ量组、红芪黄酮小、中剂量组、红芪皂苷小剂量组的肺系数明显降低。提示大多数有效部位组都可以在不同程度上改善博莱霉素致肺间质纤维化大鼠的肺系数，使肺组织重量减轻，或者会改善其疾病状态使体重明显增加。(2)肺功能实验结果显示红芪黄酮小、中、大剂量组、黄芪黄酮小、中剂量组在多数指标的改善作用明显，这些组治疗效果较优。(3)HA血清检测实验结果表明；强的松组、黄芪多糖小、大剂量组、黄芪黄酮中、大剂量组、黄芪皂苷中、大剂量组，红芪黄酮小、中、大剂量组能显著降低HA的值使肺局部ECM水平降低，肺纤维化有所减轻。(4) LN血清检测实验结果表明强的松组、黄芪黄酮小、中、大剂量组、黄芪皂苷小、中剂量组，红芪黄酮小、中剂量组能显著降低LN的值使ECM中的胶原合成速度减慢，肺纤维化有所减轻。(5) HYP组织匀浆检测实验结果表明黄芪多糖大剂量组、黄芪黄酮小、中、大剂量组、红芪黄酮小、中、大剂量组能显著减少胶原纤维沉积使肺纤维化有所减轻。(6)综合评定，红芪黄酮较其它有效部位对肺纤维化大鼠肺功能、HA、LN、HYP的影响作用为优。其中，透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)及羟脯氨酸(HyP)在肺纤维化发生时，血清和肝脏组织均升高，各有效部位对它们均有降低作用。与模型组相比，各有效部位组在各个指标含量上均有一定的改善，说明各有效部位组对肺纤维化的进程均有一定的抑制作用。不同有效部位组之间的治疗差异，说明药物浓度对疾病治疗的作用影响很大，从而使本治疗方案在剂量上的分组更有意义。说明黄芪、红芪有效部位的小、中、大剂量对抑制肺纤维化的进程与其药物剂量有关，综合评定，红芪 黄酮较其它有效部位对肺纤维化大鼠肺功能、HA、LN、HYP的影响作用为优。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中图I是本发明的技术路线图；图2是HA的标准曲线图；图3是LN的标准曲线图。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I红、黄芪有效部位的提取I.实验材料I. I药品与试剂黄芪甲苷对照品、芦丁对照品、葡萄糖对照品均购自中国药品生物制品检验所。95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚均为分析纯。红芪、黄芪购于定西市陇西药材市场，经甘肃中医学院附属医院杨锡仓主任药师、甘肃省药品检验所朱俊儒主任药师鉴定。I. 2仪器与设备UV-3600型紫外可见分光光度计(日本岛津)，AE_240电子天平(梅特勒-托利多仪器上海分公司)，KQ-100超声波清洗器(昆山市超声技术有限公司)，R_200旋转蒸发仪(瑞士布奇)，DZF6050真空干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。I. 2实验方法I. 2. I红芪有效部位的提取分离
L 2. L I红芪总多糖将乙醇提取后的红芪药渣挥干乙醇后加水煎煮3次，每次lh，第一次加8倍量的水，后两次加6倍量水，合并三次水煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为I. 15 (20°C)的浸膏，离心分离，弃去沉淀，上清液搅拌下缓缓加入95%乙醇，使溶液的含醇量达到70%，充分搅匀，密闭，静置24 h，滤过，沉淀用适量70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀用蒸馏水溶解，离心分离(2500r/min，15min)，弃去沉淀，上清液搅拌下缓缓加入95%乙醇，使溶液的含醇量达到70%，充分搅匀，密闭，静置24 h，滤过离心，沉淀用70%乙醇洗涤沉淀2次，500C以下干燥；干燥后用水溶解干燥物，得溶液，将氯仿-正丁醇(5:1)按O. 2倍的体积加入溶液中，萃取(反复多次)，除去多糖中的蛋白；除去蛋白后，多糖脱色，将多糖的水溶液加入活性炭加热回流O. 5h (活性炭按3 %加入)，趁热过滤，滤液蒸干后得红芪总多糖。I. 2. I. 2红芪总黄酮取红芪药材，润湿后切制成厚度为2 3 mm的饮片，晾干，称取6. 5 kg，加人70%乙醇，回流提取3次，每次lh，第一次加8倍量的乙醇，后两次加6倍量乙醇，合并三次提取液，·滤过，滤液静置24 h，滤去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味，放冷，用蒸馏水稀释至1:2，然后上聚酰胺柱，上柱液浓度lg/ml，上柱速度2BV/h，然后水洗，接着用70%乙醇洗，最后用95%乙醇洗，洗脱液回收乙醇后，用等体积水饱和的乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，残留物水浴上干燥，得红芪总黄酮。I. 2. I. 3红芪总皂苷将上完聚酰胺柱的流出液继续上D-101大孔树脂，上柱液浓度lg/ml，上柱速度2BV/h,然后水洗，接着用70%乙醇洗，最后用95%乙醇洗，洗脱液回收乙醇后，用等体积水饱和的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇，残留物水浴上干燥，得红芪总皂苷。1.2.2红芪有效部位的含量测定I. 2. 2. I对照品溶液的制备葡萄糖对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的葡萄糖对照品10.68mg，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。得葡萄糖浓度为O.1068mg/ml。芦丁对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于干燥的25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取IOml，置于IOOml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每Iml含无水芦丁 O. 2mg)备用。实配浓度为O. 2198mg/ml。黄芪甲苷对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的黄芪甲苷对照品
12.5mg，置于干燥的25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。实配浓度为 O. 532mg/ml。I. 2. 2. 2样品溶液的制备精密称取红芪总多糖O. 5002g，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，摇匀，精密移取IOml定容至IOOml容量瓶中，摇匀，再吸取5ml定容至25ml容量瓶中，取2ml测定；精密称取红芪总黄酮I. 521g，用70%乙醇定容至IOOml容量瓶中，精密吸取2ml定于25ml容量瓶中，再吸取Iml至25ml容量瓶中，照标准曲线下的方法，自“加水至8. 0ml”起，依法测定；精密称取红芪总皂苷I. 536g，用无水乙醇定容于25mL容量瓶中，滤过，精密取滤液O. 5ml，加入O. 5ml的香草醛试剂，至冰水浴中缓缓加入5ml72%硫酸，摇匀放置，测定。
I. 2. 2. 3标准曲线的绘制葡萄糖标准曲线的绘制精密吸取上述葡萄糖标准品溶液O. 1、0. 2、0.4、0.6、O. 8、I. O mL,置于IOmL试管中，各加蒸懼水使总体积为I. Oml,摇勻。分别加入5%的苯酹溶液I. 5mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5分钟，置沸水浴中加热15分钟，然后置冷水浴中冷却30分钟，于波长490 nm处测定吸光度，随行空白。数据经回归处理得回归方程为A=57. 2482C+0. 0695，r=0. 9984。芦丁标准曲线的绘制精密量取上述芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、6、8mL，分别至25mL容量瓶中，各加水至8ml，分别加人5%亚硝酸钠溶液lmL，摇匀放置6分钟，加人10%硝酸铝溶液lmL，放置6分钟，加人IN (4%)氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，放置15分钟，置比色皿中，在波长500 nm处测定吸光度。数据经回归处理得回归方程为A=Il. 66035C+0. 0062, r2=0. 99839。黄芪甲苷标准曲线的绘制精密吸取上述黄芪甲苷对照品溶液O. 15,0. 30,0. 45、O. 60,0. 75 mL，分别置于具塞试管中，分别加入无水乙醇O. 75 mL，再分别加入O. 75 mL8%香 草醒一浓硫酸试剂，置于冰浴中加入7. 5ml体积分数为72%的硫酸摇匀，放入62°C的恒温水浴中保温20分钟，取出，流水冷却5 min，摇匀。在30分钟内，于波长544 nm处测定吸光度，随行空白。数据经回归处理得回归方程为A=21. 102C+0. 0298，r=0. 9993。I. 2. 2. 4精密度试验精密吸取红芪总黄酮样品溶液、红芪总皂苷样品溶液、红芪总多糖样品溶液各5份，每份O. 5 mL ;测定吸光度，以吸光度计算，红芪总多糖RSD为2. 92%，红芪总黄酮RSD为2. 52%,红芪总皂苷RSD为3. 08%οI. 2. 2. 5稳定性试验取总黄酮样品溶液，每15分钟测一次吸光度，连续2h考察其稳定性，结果表明2h内显色均稳定，可进行含量测定。取总皂苷样品溶液，每10分钟测一次吸光度，连续Ih考察其稳定性，结果表明Ih内显色均稳定，可进行含量测定。取总多糖样品溶液，每10分钟测一次吸光度，连续Ih考察其稳定性，结果Ih表明内显色均稳定，可进行含量测定。I. 2. 2. 6回收率测定精密称取红芪总多糖125mg，加入一定量的葡萄糖对照品，用蒸馏水定容于IOOmL容量瓶中，摇匀；精密称取红芪总黄酮40mg，加入一定量的芦丁对照品，用甲醇定容于25mL容量瓶中，摇匀；精密称取红芪总皂苷25mg，加入一定量的黄芪甲苷对照品，用无水乙醇定容于25mL容量瓶中，摇匀。按含量测定的方法，测定，计算回收率。测定结果葡萄糖平均回收率为98. 3%, RSD为2. 19% (n=5);芦丁平均回收率为95. 8%, RSD为2. 96% (n=5);黄芪甲苷平均回收率为92. 5%, RSD为3. 21% (n=5)。I. 2. 2. 7样品含量测定红芪总多糖的含量测定精密吸取红芪总多糖样品溶液2ml测定，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 718g/g。红芪总黄酮的含量测定精密吸取红芪总黄酮样品溶液，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 526g/g。红芪总皂苷的含量测定精密吸取红芪总皂苷样品溶液，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 517g/g。
I. 2. 2黄芪有效部位的提取分离I. 2. 2. I黄芪总多糖将乙醇提取后的黄芪药渣挥干乙醇后加水煎煮3次，每次lh，第一次加8倍量的水，后两次加6倍量水，合并三次水煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为I. 15 (20°C)的浸膏，离心分离，弃去沉淀，上清液搅拌下缓缓加入95%乙醇，使溶液的含醇量达到70%，充分搅匀，密闭，静置24 h，滤过，沉淀用适量70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀用蒸馏水溶解，离心分离(2500r/min，15min)，弃去沉淀，上清液搅拌下缓缓加入95%乙醇，使溶液的含醇量达到70%，充分搅匀，密闭，静置24 h，滤过离心，沉淀用70%乙醇洗涤沉淀2次，500C以下干燥；干燥后用水溶解干燥物，得溶液，将氯仿-正丁醇(5:1)按O. 2倍的体积加入溶液中，萃取(反复多次)，除去多糖中的蛋白；除去蛋白后，多糖脱色，将多糖的水溶液加入活性炭加热回流O. 5h (活性炭按3 %加入)，趁热过滤，滤液蒸干后得黄芪总多糖。I. 2. 2. 2黄芪总黄酮 取黄芪药材，润湿后切制成厚度为2 3 mm的饮片，晾干，称取6. 5 kg，加人70%乙醇，回流提取3次，每次lh，第一次加8倍量的乙醇，后两次加6倍量乙醇，合并三次提取液，滤过，滤液静置24 h，滤去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味，放冷，用蒸馏水稀释至1: 1，然后上聚酰胺柱，上柱液浓度lg/ml，上柱速度2BV/h，然后水洗，接着用70%乙醇洗，最后用95%乙醇洗，洗脱液回收乙醇后，用等体积水饱和的乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，残留物水浴上干燥，得黄芪总黄酮。I. 2. 2. 3黄芪总皂苷将上完聚酰胺柱的流出液继续上D-101大孔树脂，上柱液浓度lg/ml，上柱速度2BV/h,然后水洗，接着用70%乙醇洗，最后用95%乙醇洗，洗脱液回收乙醇后，用等体积水饱和的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇，残留物水浴上干燥，得黄芪总皂苷。2. 2. 3黄芪有效部位的含量测定2. 2. 3. I对照品溶液的制备葡萄糖对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的葡萄糖对照品10.68mg，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。得葡萄糖浓度为O.1068mg/ml。芦丁对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于干燥的25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取IOml，置于IOOml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每Iml含无水芦丁 O. 2mg)备用。实配浓度为O. 2198mg/ml。黄芪甲苷对照品溶液的制备精密称取105°C下干燥至恒重的黄芪甲苷对照品
12.5mg，置于干燥的25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。实配浓度为 O. 532mg/ml。2. 2. 3. 2样品溶液的制备精密称取黄芪总多糖O. 5005g，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，摇匀，精密移取IOml定容至IOOml容量瓶中，摇匀，再吸取5ml定容至25ml容量瓶中，取2ml测定；精密称取黄芪总黄酮I. 501g，用70%乙醇定容至IOOml容量瓶中，精密吸取2ml定于25ml容量瓶中，再吸取Iml至25ml容量瓶中，照标准曲线下的方法，自“加水至8. 0ml”起，依法测定；精密称取黄芪总皂苷I. 582g，用无水乙醇定容于25mL容量瓶中，滤过，精密取滤液O. 5ml，加Λ O. 5ml的香草醛试剂，至冰水浴中缓缓加入5ml72%硫酸，摇匀放置，测定。2. 2. 3. 3标准曲线的绘制葡萄糖标准曲线的绘制精密吸取上述葡萄糖标准品溶液O. 1、0. 2、0.4、0.6、O. 8、I. O mL,置于IOmL试管中，各加蒸懼水使总体积为I. Oml,摇勻。分别加入5%的苯酹溶液I. 5mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5分钟，置沸水浴中加热15分钟，然后置冷水浴中冷却30分钟，于波长490 nm处测定吸光度，随行空白。数据经回归处理得回归方程为A=57. 2482C+0. 0695，r=0. 9984。芦丁标准曲线的绘制精密量取上述芦丁对照品溶液0、1、2、3、4、6、8mL，分别至25mL容量瓶中，各加水至8ml，分别加人5%亚硝酸钠溶液lmL，摇匀放置6分钟，加人10%硝酸铝溶液lmL，放置6分钟，加人IN (4%)氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，放置15分钟，置比色皿中，在波长500 nm处测定吸光度。数据经回归处理得回归方程为A=Il. 66035C+0. 0062, r2=0. 99839。
黄芪甲苷标准曲线的绘制精密吸取上述黄芪甲苷对照品溶液O. 15,0. 30,0. 45、O. 60,0. 75 mL，分别置于具塞试管中，分别加入无水乙醇O. 75 mL，再分别加入O. 75 mL8%香草醒一浓硫酸试剂，置于冰浴中加入7. 5ml体积分数为72%的硫酸摇匀，放入62°C的恒温水浴中保温20分钟，取出，流水冷却5 min，摇匀。在30分钟内，于波长544 nm处测定吸光度，随行空白。数据经回归处理得回归方程为A=21. 102C+0. 0298，r=0. 9993。2. 2. 3. 4精密度试验精密吸取黄芪总黄酮样品溶液、黄芪总皂苷样品溶液、黄芪总多糖样品溶液各5份，每份O. 5 mL ;测定吸光度，以吸光度计算，黄芪总多糖RSD为3. 05%，黄芪总黄酮RSD为2. 63%，黄芪总皂苷RSD为3. 16%。2. 2. 3. 5稳定性试验取总黄酮样品溶液，每15分钟测一次吸光度，连续2h考察其稳定性，结果表明2h内显色均稳定，可进行含量测定。取总皂苷样品溶液，每10分钟测一次吸光度，连续Ih考察其稳定性，结果表明Ih内显色均稳定，可进行含量测定。取总多糖样品溶液，每10分钟测一次吸光度，连续Ih考察其稳定性，结果Ih表明内显色均稳定，可进行含量测定。2. 2. 3. 6回收率测定精密称取黄芪总多糖125mg，加入一定量的葡萄糖对照品，用蒸馏水定容于IOOmL容量瓶中，摇匀；精密称取黄芪总黄酮40mg，加入一定量的芦丁对照品，用甲醇定容于25mL容量瓶中，摇匀；精密称取黄芪总皂苷25mg，加入一定量的黄芪甲苷对照品，用无水乙醇定容于25mL容量瓶中，摇匀。按含量测定的方法，测定，计算回收率。测定结果葡萄糖平均回收率为98. 3%, RSD为2. 18% (n=5);芦丁平均回收率为96. 8%, RSD为2. 85% (n=5);黄芪甲苷平均回收率为92. 8%, RSD为3. 12% (n=5)。2. 2. 3. 7样品含量测定黄芪总多糖的含量测定精密吸取红芪总多糖样品溶液2ml测定，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 721g/g。黄芪总黄酮的含量测定精密吸取红芪总黄酮样品溶液，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 558g/g。黄芪总皂苷的含量测定精密吸取红芪总皂苷样品溶液，按标准曲线法操作，根据回归方程测其含量，得O. 531g/g。实施例2一、实验I材料与方法I. I 材料I. I. I实验动物及饲养条件SPF级健康Wistar大鼠,雌雄各半,体重(200± 10)g,由甘肃中医学院科研实验中心提供。实验动物质量合格证编号SCXK (甘)2011-0001-0001059 (见附录I) SPF级饲料(由北京科奥协力饲料有限公司供给)喂养，自由饮水，预备饲养3天后进行实验。动物实验设施使用证编号SCSY (甘)20011-0001-0002753 (见附录2)。
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I. I. 2主要试剂
权利要求
1.黄芪、红芪有效部位在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述黄芪、红芪有效部位为黄芪多糖、黄芪黄酮、黄芪皂苷、红芪多糖、红芪黄酮、红芪皂苷中的一种或两种以上组合物。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述黄芪、红芪有效部位为红芪黄酮。
全文摘要
本发明属于中医药领域，涉及黄芪、红芪有效部位的制备及其对肺纤维化模型干预的筛选，以获得最佳疗效的有效部位进行进一步研究。本发明通过造模建立大鼠肺间质纤维化模型，各相关检测指标及病理改变与正常大鼠比较有显著性差异且病理改变典型。黄芪、红芪各有效部位能不同程度抑制博来霉素诱导的肺间质纤维化大鼠模型的各相关指标，阻止肺间质纤维化的发展，其中红芪黄酮小、中剂量组效果较优。黄芪、红芪有效部位阻止肺间质纤维化进程的作用强度与适宜的等效药物浓度有关。综合评定，红芪黄酮较其它有效部位对肺纤维化大鼠肺功能、HA、LN、HYP等的影响作用为优。
文档编号A61K36/48GK102885878SQ20121037482
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者李金田, 李娟 , 刘永琦, 景明, 张毅, 蔺兴遥, 李雪燕, 苏蕴, 孙少伯 申请人:甘肃中医学院