专利名称：从海藻提取物中纯化岩藻依聚糖的工艺方法
技术领域：
本发明通常涉及岩藻依聚糖(本文也称为AV513)的生产。更具体地说，本发明涉及纯化岩藻依聚糖提取物以除去重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质但不影响期望的生物学活性的方法。
背景技术：
正常的凝血是一个复杂的生理和生化过程，其在几个水平上受到调节。凝血过程涉及凝血因子级联系统的激活，产生纤维蛋白和导致血小板聚集以及血管收缩(Davie等人的综述，Biochemistry30 :10363，1991)。凝结级联系统由“外源性”途径和“内源性”途径构成，外源性途径被认为是引发正常凝血的主要手段，内源性途径则扩展凝血反应。出血损害的正常反应包括激活外源性途径。当血液接触受伤后被暴露于组织上或在组织上表达的组织因子(TF)-因子VII的辅因子时，引发外源性途径的激活。TF与促进产生FVIIa的FVII形成复合体。FVIIa接着结合TF将FX转化为丝氨酸蛋白酶FXa，这是凝血酶原复合物的关键成分。通过FXa/FVa/钙/磷脂复合物将凝血酶原转化为凝血酶刺激了纤维蛋白的形成和血小板的活化，所有这些都是正常凝血所必需的。内源性的途径因子IXa和VIIIa进一步增强正常的止血，这两个因子也可以将FX转化为FXa。也可以见Weitz，J. I.，等人，Chest, 126 (3)，September2004 (Suppl)，265S。硫酸多糖是一类动物和人类中以许多生物学活性为特征且具有良好耐受性的分子。这些聚阴离子分子通常来自植物和动物组织，并且包括广范围的亚类，包括肝素、葡糖氨基聚糖、岩藻依聚糖、交叉菜聚糖、多硫酸戍聚糖(pentosanpolysulfates)和硫酸皮肤素或硫酸葡聚糖。肝素样的硫酸多糖显示通过抗凝血酶III和/或肝素辅因子II相互作用介导的不同抗凝血活性(Toida TC, Linhardt, RJ.，Trends in Glycoscience andGlycotechnology2003 ； 15 :29-46)。尽管有这样的一种硫酸多糖-口服肝素已被考虑作为一种抗凝血剂开发(ADunn，Idrugs, 3 =817-824, 2000)，但是只有肝素是不够的，因为其具有严重的并发症，这些并发症包括术中和术后出血、骨质疏松、脱发、肝素抗性、肝素反跳、肝素诱导的血小板减少症(HIT)、肝素诱导的血小板减少症血栓形成综合症(HITTS)以及其他的缺点，包括中断给药几天后抗凝血作用衰减(Iqbal O 等人，FareedJ, Expert Opin Emerg Drugs6 :111-135,2001 ；Roberts, HR, AnesthesiologylOO =722-730, 2004)。肝素通常胃肠外给药，其口服吸收水平只有大约 I % (Fitton, J. H. , Glycoscience, The Nutrition Science Site,modified JanuaryOI,2005)。与肝素相反，另一种硫酸多糖，岩藻依聚糖，其从海藻分离出来，已经证明能够调节(即加速)凝血(美国专利号2005/0282771)。具体地说，当在体外以低浓度给药或在体内以低的皮下剂量给药时，岩藻依聚糖通过外源性途径途径激活血友病情形下的凝血(Liu, T 等人，和 Johnson, K. ff.，Thrombosis andHaemostasis, 95 :68-76, 2006),这证实了其促凝血活性。更高剂量的岩藻依聚糖能够具有与肝素相似的抗凝血活性。鉴于目前的抗凝血剂如肝素或苄丙酮香豆素(warfarin)的相关问题，因此明确地需要能够克服与目前存在的抗凝血治疗相关的一个或多个问题的药物如岩藻依聚糖。由此，需要一种改进的方法，以经济划算和有效地生产具有最佳活性的富含岩藻依聚糖的提取物，用于促凝血剂或用于抗凝血治疗应用。
发明内容
本发明基于从海藻提取物纯化岩藻依聚糖的方法中获得的发现。该方法提供高产率的岩藻依聚糖，该岩藻依聚糖基本不含有重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质。因此，本发明包括从非均相混合物富集岩藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供岩藻依聚糖源；(b)通过用螯合剂处理除去上述源中的重金属离子，产生第一岩藻依聚糖混合物；(C)选择性沉淀所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖，除去污染物；(d)在水溶液中重悬含有岩藻依聚糖的沉淀物，获得第二岩藻依聚糖混合物；(e)重复步骤(C)和(d) —次或多次；和(f)过滤包括岩藻依聚糖的水溶液，除去细菌和内毒素污染物，产生纯化的岩藻依聚糖提取物。在一个实施方案中，所述岩藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一个实施方案中，岩藻依聚糖来自藻类。在一个优选的实施方案中，岩藻依聚糖来自墨角藻属或昆布属(Laminaria)。代表性的岩藻依聚糖来自墨角藻或海带或其他来源,包括但不限于裙带菜和泡叶藻。在一些实施方案中，螯合剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(β -氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA) ,2,3- 二巯基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3- 二巯基琥珀酸(DMSA)。在一个优选的实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂固定在固体载体上。在一个实施方案中，螯合剂是亚氨基二乙酸螯合树脂。在一些实施方案中，用乙醇选择性地沉淀岩藻依聚糖一次或多次，其中乙醇在岩藻依聚糖混合物中的浓度为约40%到50% (ν/ν)。在一些实施方案中，其pH保持在约5. 7到6. O之间。在一个优选的实施方案中，pH被调节到约5.95。在一些实施方案中，向岩藻依聚糖混合物中加入NaCl，浓度约为20-24g/升。在另一个方面中，本发明提供了包括岩藻依聚糖的组合物，岩藻依聚糖通过本文所述的方法产生。在一个实施方案中，岩藻依聚糖具有5到25重量百分比的硫。在另一个实施方案中，岩藻依聚糖来自海藻。在一个优选的实施方案中，岩藻依聚糖来自墨角藻属或昆布属。代表性的岩藻依聚糖来自墨角藻或海带或R村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡叶藻(Ascophyllumnodosum)、昆布(Ecklonia kurome)、鹿角藻(Pelvetia fastigiata)、单纯性褐条藻(Saundersella simplex)、长松藻(Chordariaflagelliformis)或任何其他种类的含有岩藻依聚糖的海洋植物或动物。在优选的实施方案中，岩藻依聚糖具有生物学活性，例如具有促凝血活性。在一些实施方案中，所述组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂。在另一个方面，本发明提供了治疗需要增强凝血的受治疗者的方法，其包括向所述受治疗者给予治疗有效量的包括用本文所述的任何方法产生的岩藻依聚糖的组合物。在一些实施方案中，所述受治疗者具有选自以下的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏导致的先天性凝血疾病和获得性凝血疾病。在其它的实施方案中，需要凝血的原因是先前使用了抗凝血剂、手术或其 他侵入性的操作。在一些实施方案中，以约O. Olmg/kg到约I O O mg/kg的剂量给予岩藻依聚糖。本领域技术人员在阅读了本发明后容易实施本发明的这些和其他的实施方案。
图I显示了在活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)分析中处理对岩藻依聚糖(AV513)活性的影响。图2显示了在稀释的凝血酶原(dPT)分析中处理对岩藻依聚糖活性的影响。图3显示了凝血弹性描记器(TEG)分析中处理对岩藻依聚糖活性的影响。
具体实施例方式除非另有说明，本发明的实施采用了蛋白化学、生物化学、分子生物学和药物学的常规方法，这些都在本领域的技术人员技能范围内。这些技术都在文献中有充分的描述° 例如，见 Protein Purification Methods A Practical Approach, (E. L. V. Harrisand S. Angal,Eds. ,1989) ；Protein Purification Applications APractical Approach,(E.L.V.Harris and S. Angal, Eds. ,1990) ；T.E.Creighton, Proteins !Structuresand Molecular Properties (ff. H. Freeman and Company,1993) ；A.L.Lehninger,Biochemistry (Worth Publishers, Inc.,最新增补)；Methods InEnzymology (S. Colowickand N. Kaplan 编辑,Academic Press, Inc.) ；Morrison andBoyd, Organic Chemistry (Al Iynand Bacon, Inc.,最新增补)；J. March, AdvancedOrganic Chemistry (McGraw Hill,最新增补)；Remington :The Science andPractice of Pharmacy, A. Gennaro,编辑，第 20 版；和 Goodman&Gilman ThePharmacological Basis of Therapeutics,J. Griffith Hardman,L. L. Limbird, A. Gilman,第 10 版。本文所述的所有出版物、专利和专利申请，不论是上文提到的还是下文将要提及的,其全部内容都通过参考并入本文。在全文中使用了以下氨基酸缩写。丙氨酸Ala (A)精氨酸Arg (R)天冬酰胺Asn (N)天门冬氨酸Asp⑶半胱氨酸Cys (C)谷氨酰胺GIn (Q)谷氨酸GIu (E)甘氨酸GIy (G)组氨酸His⑶异亮氨酸=He⑴亮氨酸Leu (L)赖氨酸Lys⑷蛋氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)丝氨酸Ser⑶苏氨酸Thr⑴色氨酸Trp (W)酪氨酸Tyr⑴缬氨酸VaI (V)I.定义
在描述本发明时，使用了以下术语，如下所述对它们进行了定义。必须指出的是，如在说明书和后附权利要求中所用，除非另外明确指出，否则单数形式“一”、“所述”和“这”包括复数指代。因此，例如指代“岩藻依聚糖”包括两种或以上的岩藻依聚糖的混合物等。如本文所用，术语“大约”表示其修饰的值的大约±10%。术语“生物学活性的”指蛋白具有天然存在的蛋白质的结构的、功能的或生化的功倉泛。本文所用的术语“岩藻依聚糖”指存在于许多海洋植物和动物中的硫酸a -L-岩藻聚糖。岩藻依聚糖在褐藻的细胞壁中特别丰富，其包括来自墨角藻属(例如，墨角藻、枯墨角藻、Fucus distichus和齿缘墨角藻)或昆布属(海带、皱海带和Iaminariaabyssalis)的岩藻依聚糖。岩藻依聚糖也包括来自绳藻、R村枝管藻、裙带菜、粘膜藻(Leathesia difformis)、泡叶藻、昆布、鹿角藻、单纯性褐条藻、长松藻或任何其他种类的含有岩藻依聚糖的海洋植物或动物的岩藻依聚糖。另外，术语岩藻依聚糖包括其生物学活性片段、衍生物或其类似物。岩藻依聚糖包括通过降解(如水解)较大的岩藻依聚糖分子产生的岩藻依聚糖片段。降解可以通过本领域技术人员已知的方法实现，包括用酸、碱、热或酶处理产生降解的岩藻依聚糖。岩藻依聚糖也可以被化学改造并可以具有修饰作用，包括但不限于硫酸化、多硫酸化、乙酰化、酯化和甲基化。“基本上纯化” 一般指分离物质(如岩藻依聚糖)，使得该物质在其所在的样品·中占有绝大部分百分数。典型地，在一个样品中，基本纯化的组分占该样品的50%、优选80% -85%,更优选 90-95%。当在组合物中A+B之和重量的至少约80%为A时，含有A的组合物“基本上不含有B”。优选的，在组合物中A占A+B之和的重量的至少85%到95%。本文所用的“抗凝(血)剂”指能够阻止或减慢形成凝块的任何药剂。本文所用的“促凝(血)剂”指能够加速形成凝块的任何药剂。本文所用的“螯合剂”指能够结合金属的化合物、肽或蛋白。螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(β-氨乙醚)N，N，K , Ni -四乙酸(EGTA)、2，3-二巯基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3_ 二巯基琥珀酸(DMSA)等。螯合剂可以固定在载体上(如亚氨基二乙酸螯合树脂)。本文使用术语“来自”表明一个分子的最初来源，但是不用来限定该分子的制备方法，例如化学合成或重组方法。“衍生”指对目标指代分子或其类似物的任何合适的修饰作用，诸如硫酸化、乙酰化、糖基化、磷酸化、聚合物缀合(如用聚乙二醇)或其它的外源部分的加入，只要能够保持所述分子的期望生物学活性(如凝血活性)就行。例如，可以化学改变岩藻依聚糖以改善其促凝血功能。这样的修饰作用可以包括但不限于硫酸化、酯化和甲基化。制备类似物和衍生物的方法一般为本领域所知。“片段”指仅有完整全长序列和结构的一部分组成的分子。岩藻依聚糖的片段可以通过降解(如水解)大的岩藻依聚糖多糖产生。岩藻依聚糖活性片段一般包括全长多糖的
2-20个糖单位，优选地全长分子的至少大约5-10个单位，或者在2个糖单位和全长分子之间的任何整数的糖单位，条件是所述片段保留生物学活性如促凝血活性。
“药学上接受的赋形剂或载体”指可任选地包括在本发明的组合物中的赋形剂，其对患者不产生显著的不良毒性作用。“药学上可接受的盐”包括但不限于氨基酸盐、用无机酸制成的盐如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐和硝酸盐或用有机酸制成的盐如苹果酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙基琥珀酸、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐、棕榈酸盐、水杨酸盐和硬脂酸盐以及依托红霉素盐、葡庚糖酸盐和乳糖酸盐。含有药学上可接受的阳离子的类似盐包括但不限于钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、锂盐和铵盐(包括取代的铵盐)。本文所述的“活性分子”或“活性剂”指能够提供在体内或体外显示一些药学效应通常是有利效应的任何药剂、药物、化合物、物质的组合物或混合物。其包括食品、食品增补齐U、营养品、营养保健品、药物、疫苗、抗体、维生素和其他的有益物质。如本文所用，该术语还包括能够在患者中产生局部或全身作用的任何生理活性的或药物活性的物质。“任选的”或“任选地”表示在其后描述的情形可能发生或可能不发生，因此该描述 包括所述情形发生或不发生的情况。术语“受治疗者”、“个体”或“患者”在本文中可以交换使用，指脊椎动物。优选地指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠、啮齿动物、猴、人类、家畜、体育动物和宠物。2.实施本发明的方式在具体描述本发明前，应该理解的是，本发明不限于特定的制剂或方法参数，它们当然会改变。也应该理解，本文所用的术语只是为了描述本发明的具体实施方式
，不是为了限定本发明。虽然本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的这些材料和方法类似或相当的方法和材料也能够用于实施本发明。A.岩藻依聚糖的生产本发明是建立在分离岩藻依聚糖使其基本不含有重金属离子、细菌和内毒素污染物和其他杂质的纯化程序的基础之上的。所述方法包括一系列的分离步骤，包括用螯合剂处理除去重金属离子、一次或多次选择性沉淀以除去杂质和过滤除去细菌和内毒素污染物。为了进一步理解本发明，以下提供了关于纯化岩藻依聚糖提取物方法的更详细的描述。岩藻依聚糖纯化可以使用任何来源的岩藻依聚糖提取物。在许多海洋植物和动物中发现了岩藻依聚糖，其在褐藻(褐藻纲)的细胞壁中特别丰富。例如，纯化可以使用来自墨角藻属(例如，墨角藻、枯墨角藻、Fucus distichus和齿缘墨角藻)或昆布属(海带、皱海带和laminaria abyssalis)的褐藻。或者，也可以使用来自其他来源的岩藻依聚糖来实施本发明，这些来源包括但不限于绳藻、R村枝管藻、裙带菜、粘膜藻、泡叶藻、昆布、鹿角藻、单纯性褐条藻、长松藻或任何其他种类的含有岩藻依聚糖的海洋植物或动物。螯合剂可以使用能够结合金属离子的任何螯合剂除去含有岩藻依聚糖的非均相混合物中的金属离子污染物。螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(β-氨乙醚)N，N，N'，N'-四乙酸(EGTA)，2，3-二巯基丙醇-I-磺酸(DMPS)和2，3_ 二巯基琥珀酸(DMSA)等。可选地，也可以使用含有固定螯合基团的金属螯合树脂除去含有岩藻依聚糖的样品中的金属离子。例如，可以使用购买的含有螯合配体亚氨基二乙酸的螯合树脂(例如 CHELEXI O O (Bio-Rad)，DOffEXAl (Doff Chemical Co.)和螯合树脂(Hampton Research))。螯合树脂可以分批加入岩藻依聚糖样品中，并且通过离心除去。可选地，可以通过含有螯合树脂的柱子用层析根据本领域已知的方法除去岩藻依聚糖样品中的金属离子。选择性沉淀岩藻依聚糖通过乙醇的选择性沉淀进一步纯化岩藻依聚糖提取物。选择性沉淀除去岩藻依聚糖混合物中的一些螯合剂和其他的污染物。在一些实施方案中，用浓度为大约40%到50%
的乙醇选择性沉淀岩藻依聚糖一次或多次。在向岩藻依聚糖混合物加入乙醇前，将岩藻依聚糖混合物的pH调节到5. 7-6. O之间。向岩藻依聚糖混合物中加入NaCl，浓度为20_24g/升。沉淀岩藻依聚糖后，除去上清液并将沉淀的岩藻依聚糖重悬于水溶液中。重复上述循环能够提高岩藻依聚糖的纯度。讨滤通过O. 2 μ m的滤器过滤岩藻依聚糖除去细菌和内毒素污染物。用冻干或喷雾干燥法干燥过滤的产物。通常岩藻依聚糖的产率为大约50%或以上，更优选地为大约60%到约 80%。分析纯化的岩藻依聚糖分析岩藻依聚糖样品的纯度和各种性质，如分子量、包括岩藻糖和木糖的碳水化合物的含量，重金属污染、硫酸盐和水。可以使用一些分析技术表征岩藻依聚糖样品，包括但不限于高效液相色谱(HPLC)、元素成分分析、激光散射(LLS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和 GC-MS。B药物组合物纯化的岩藻依聚糖可以配制成任选含有一种或多种药学上接受的赋形剂的药物组合物。代表性的赋形剂包括但不限于碳水化合物、无机盐、抗微生物剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱和它们的组合。适用于注射组合物的赋形剂包括水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷脂和表面活性剂。碳水化合物如糖、衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的糖水化合物赋形剂包括，例如单糖诸如岩藻糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维素二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、吡喃山梨醇、肌醇等。赋形剂可以包括无机盐或缓冲剂如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和它们的组合。本发明的组合物也包括阻止微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明的抗微生物剂的非限定性的实例包括苯扎氯铵、苄索氯胺、苄醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯基乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞和它们的组合。组合物中也可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以用于防止氧化，由此阻止岩藻依聚糖或制剂中的其它组分的破坏。本发明使用的合适的抗氧化剂包括例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、次磷酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和它们的组合。表面活性剂可以作为赋形剂存在。代表性的表面活性剂包括聚山梨醇酯，如"Tween20"和"Tween80，"和普郎尼克类聚合物如 F68 和 F88 (BASF，Mount01ive，NewJersey);脱水山梨醇酯；脂类如磷脂(如卵磷脂)和其他的磷脂酰胆碱类，磷脂酰乙醇胺(但是优选地为非脂质体形式)，脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，如胆固醇；螯合剂如EDTA ;锌和其他的这类阳离子。酸和碱可以作为赋形剂存在于组合物中。可以使用的酸的非限定性实例包括选自下组的酸盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、硫酸、延胡索酸和它们的组合。合适的碱基的实例包括但不限于选自下组的碱氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、延胡索酸钾和它们的组合。
根据一些因素，组合物中的岩藻依聚糖的量(例如当在给药系统中含有时)会不同，但是当所述组合物是以单位剂量形式或在容器中(如小瓶)时，最优地为治疗有效量。通过重复的施用逐渐加大量的组合物，确定产生临床期望终点的量，可以实验决定治疗有效量的剂量。组合物中单个赋形剂的量会不同，这取决于赋形剂的性质和功能以及组合物的特定需要。典型地，任何单个赋形剂的最优量可以通过常规实验确定，即通过制备含有不同量的赋形剂的组合物(从低到高)，检测稳定性和其他参数，然后获得最佳性能且没有显著不良作用的范围。然而，通常，组合物中赋形剂的剂量按重量计为约1%到约99%，优选为约5 %到约98 %，更优选为约15 %到约95 %，最优选为按重量计浓度小于30 %。上述的这些赋形剂以及其他的赋形剂在下述文献中描述"Remington The Science&Practiceof Pharmacy ",第 19 版，Williams&Williams，(1995), the " Physician，s DeskReference ",第 52 版,Medical Economics, Montvale, NJ (1998)和 Kibbe, A. H. , HandbookofPharmaceutical Excipients, 第 3 版，American Pharmaceutical Association,Washington, D.C. ,2000。组合物包括所有类型的制剂，尤其是适于注射的制剂(例如粉末和冻干物，它们在使用前能够与溶剂重构)，以及易于用于注射溶液或悬浮液的制剂，干燥的不溶性组合物(其在使用前与载体组合)和乳剂及液体浓缩液(使用前稀释)。在注射前用于重构固体组合物的合适的稀释剂的实例包括抑菌注射用水、5%葡萄糖水溶液、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、盐水、无菌水、去离子水和他们的组合。就液体药物组合物而言，可以使用溶液和悬浮液。其他的优选的组合物包括用于口服给药、眼部给药或局部给药的组合物。本文所述的药物制剂也可以放在注射器、移植器具等中，这取决于期望的给药和使用方式。优选地，本文所述的岩藻依聚糖组合物为单位剂量的形式，单位剂量表示预先定量的或预先包装的、用于单次剂量的本发明的缀合物或组合物的量。本文所述的岩藻依聚糖组合物可任选地包括一种或多种附加药剂，如止血剂、凝血因子或其他的治疗受治疗者病症或疾病的药物。特别优选的是包括诸如以下一种或多种凝血因子的复合制剂因子XI、因子XII、前激肽释放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和冯维勒布兰德氏因子。岩藻依聚糖组合物也可以包括其他的促凝血剂，如内源性途径的激活因子，包括但不限于因子Xa、因子Ixa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽释放酶、高分子量的激肽原或外源性途径的激活因子，包括但不限于组织因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。岩藻依聚糖组合物可以包括天然的、合成的或重组的凝血因子或它们的保留生物学活性(即促凝血)的片段、变体或共价修饰的衍生物。可选地，这样的药剂包含在来自岩藻依聚糖的单个组合物中，并且在与本发明的岩藻依聚糖的组合物施用的同时、之前或之后共同施用。
C 施用向受治疗者施用至少一个岩藻依聚糖的治疗有效的治疗循环。“治疗有效的治疗循环”指这样的一个循环当给个体给药时，对出血疾病的治疗产生积极的治疗反应。增强凝血的施用岩藻依聚糖的治疗循环是特别值得关注的。“积极的治疗反应”指根据本发明进行治疗的个体显示出血病症的一个或多个症状的改善，包括如凝血时间变短和出血减少和/或减少对凝血因子置换治疗的需要。。其它使用岩藻依聚糖的治疗有效的治疗循环将会作为抗凝血剂向患有以下疾病的受治疗者施用血栓形成前疾病如深静脉血栓形成、动脉血栓形成和其他的心血管和癌症疾病，以作为预防性的和/或维持性的治疗。在一些实施方案中，施用多个治疗有效剂量的组合物，所述组合物包括岩藻依聚糖和/或一种或多种其他的治疗药物，如止血剂、凝血因子或其他的药物。本发明的组合物通常但不是必须地通过口服、注射(皮下、静脉或肌内)、灌注或局部给药。本发明的制剂在给药前可以为液体溶液或悬浮液的形式，但是也可以采用其他的形式，如浆液、乳液、膏、片齐U、胶囊、粉末、凝胶、基质、栓剂等。也可以考虑其他的给药方式，如肺内、直肠内、经皮、透粘膜、鞘内、心包、动脉内、脑内、眼内、腹膜内等。可以使用与本领域已知的任何医学上接受的相同或不同的给药方法施用包括岩藻依聚糖和其他药剂的药物组合物。在具体的实施方案中，本发明的组合物可以用于局部给药岩藻依聚糖，例如用于治疗损伤、伤害或手术造成的出血。根据本发明的制剂也可以用于局部治疗。例如，可以通过在出血部位注射或优选地经胶带或伤口覆盖方式局部涂敷固体、液体或膏来施用岩藻依聚糖。也可以使用栓剂、胶囊(尤其是耐胃液的胶囊)、点滴或喷雾。选择特定的制剂和合适的给药方法以靶向出血部位。在另一个实施方案中，例如在计划手术前预防性施用包括岩藻依聚糖和/或其他药剂的药物组合物。这种预防性施用对于患有已知的已存在的凝血疾病的受治疗者具有特别的价值。在本发明的另一个实施方案中，包括岩藻依聚糖和/或其他药剂的药物组合物存在于缓释制剂中或者存在于使用缓释器具给药的制剂中。这样的器具是本领域已知的，包括例如透皮贴剂和微型植入泵，它们能够随时间以连续稳定的方式以不同的剂量释放药物，使非缓释药物组合物获得持续释放的作用。本发明也提供了向患有疾病的患者施用包括本文提供的岩藻依聚糖的缀合物的方法，其中所述疾病对用包含在缀合物或组合物中的岩藻依聚糖的治疗产生反应。所述方法包括通过本文所述的任何方式施用治疗有效量的缀合物或给药系统，它们优选作为药物组合物的一部分给予。所述给药方法可以用于治疗对使用岩藻依聚糖的治疗产生反应的任何疾病。更具体地说，本文的组合物能够有效地治疗出血疾病，疾病包括血友病A、血友病B、冯维勒布兰德氏病、特发性血小板减少症、缺乏一个或多个接触因子(如因子XI，因子XII，前激肽释放酶，高分子量的激肽原(HMWK))、缺少一个或多个与临床大出血相关的因子(如因子V，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II (低凝血酶原血症)和冯维勒布兰德氏因子)、维生素K缺乏、纤维蛋白原疾病，包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症、α 2-抗纤溶酶缺乏和由以下原因导致的出血过度肝病、肾病、血小板减少、血小板功能障碍、血肿、内出血、关节积血、手术、创伤、低温、月经和妊娠。本领域技术人员知道特定岩藻依聚糖能够有效治疗的条件。给药的实际剂量会不同，这取决于受治疗者的年龄、重量和一般状况以及要治疗的疾病的严重性、卫生保健人员的判断和施用的缀合物。治疗有效量可以由本领域技术人员确定，并根据每个特定的病例的具体需要调节。一般，治疗有效量的岩藻依聚糖范围为约O. 01mg/kg-200mg/kg/天，更优选地为约O. 01mg/kg-20mg/kg/天，更优选地为O. 02mg/kg-2mg/kg/天。优选地，这些剂量范围为O. 01-50mg/kg4 次 / 天(QID)、0· Ol-lOmg/kg QID,O. 01_2mg/kgQID、0· 01-0. 2mg/kg QID、0.01-50mg/kg3 次 / 天(TID)、0.01-10mg/kg TID、0. 01_2mg/kg TID、0. 01-0. 2mg /kg TID、0. 01-100mg/kg2 次 / 天(BID)、0· Ol-lOmg/kgBID，0. 01_2mg/kg BID 或 0. 01-0. 2mg/kg BID和每天局部施用一次或多次的0. 1-10%的浓度。给药的化合物的量将取决于特定的岩藻依聚糖的效价和以及期望的效应大小或促凝血作用及给药途径。纯化的岩藻依聚糖提取物(其再次作为药物制剂的部分提供)可以单独施用或与其它的岩藻依聚糖或诸如以下的治疗剂组合施用止血剂、凝血因子或用于治疗特定疾病或病症的其它药物，给药要根据剂量方案由医师的判断、病人的需要等决定。具体的剂量方案为本技术领域的技术人员公知或通过常规方法由实验确定。代表性的给药方案包括但不限于每天5次、每天4次、每天3次、每天2次、每天I次、每周3次、每周2次、每周I次、每月2次、每月I次给药或它们的任何组合。优选的组合物是那些每天给药只有I次的组合物。岩藻依聚糖可以在给药其它药物前、同时或之后给予。如果与其它的药物同时给药，岩藻依聚糖可以存在于同一种组合物或不同的组合物中。因此，可以通过同时治疗的方式给予个体岩藻依聚糖和其它的药物。“同时治疗”指给予受治疗者药物，使得在接受治疗的受治疗者中产生所述物质组合的疗效。例如，同时治疗可以根据特定的给药方案通过给予一个剂量的包括岩藻依聚糖的药物组合物和一个剂量的包括至少一种其它药剂如止血剂或凝血因子(例如FVIII或FIX)实现，在组合中它们含有治疗有效的剂量。同样，可以至少一个治疗剂量来施用岩藻依聚糖和一个或多个其它的治疗剂。可以同时或在不同时间(即，以任意的顺序在同一天或在不同的日期)施用单独的药物组合物，条件是能够在接受治疗的受治疗者中产生这些物质组合的治疗效应。F.应用纯化后，岩藻依聚糖可以用于多种用途。在这方面，岩藻依聚糖可以用作如促凝血剂促进凝血、减少出血、抵消用抗凝血剂治疗受治疗者的效应，用作抗炎剂，用作抗癌剂，用作抗病毒剂或用作造血(祖)细胞动员剂。用不同的体外凝血分析(例如dPT和aPTT分析)和活体出血模型(例如在血友病小鼠或狗中进行剪断尾巴或角质层的出血时间测定)容易确定纯化的岩藻依聚糖提取物促进凝血和减少出血的能力。例如见F1DR Staff.Physicians ' Desk Reference. 2004, Anderson 等人(1976)Thromb. Res. 9 :575-580 ;Nordfang 等人(1991)ThrombHaemost. 66 :464-467 ;Welsch 等人(1991)ThrombosisRes earch64 :213-222 ；Broze 等人(2() ()I)Thromb Haemost85 :747-748 ；Scallan 等人(2003)Blood. 102 :2031-2037 ；Pijnappels 等人(1986)Thromb. Haemost. 55 :70-73 和Giles等人(1982)Blood60 :727_730，它们通过参考并入本文。在一个方面，岩藻依聚糖提取物可以用于本发明的方法中，改善在治疗出血疾病中的止血，特别是增强与缺乏凝血因子相关的出血的疾病中的止血，或逆转受治疗者中的抗凝血剂的效应。给予受治疗者岩藻依聚糖以治疗出血疾病，所述出血疾病包括先天性的凝血障碍、获得性的凝血障碍和创伤引起的出血状况。可以用岩藻依聚糖治疗的出血疾病的实例包括但不限于血友病A、血友病B、冯维勒布兰德氏病、特发性血小板减少症、缺乏一个或多个接触因子(如因子XI，因子XII、前激肽释放酶、高分子量的激肽原(HMWK))、缺少一个或多个与临床大出血相关的因子(如因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II (低凝血酶原血症)和冯维勒布兰德氏因子)、维生素K缺乏、纤维蛋白原疾病，包括无纤维蛋白原血症、低纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症、α 2-抗纤溶酶缺乏和由以下原因导致的出血过度肝病、肾病、血小板减少、血肿、血小板功能障碍、内出血、关节积血、手术、创伤、低温、月经和妊娠。在一些实施方案中，用岩藻依聚糖治疗的先天性凝血疾病包括血友病Α、血友病B和冯维勒布兰德氏病。在其它的实施方案中，用岩藻依聚糖治疗的获得性凝血疾病包括缺乏因子VIII、冯维勒布兰德氏因子IX、因子V、因子XI、因子XII和因子XIII，尤其是那些由抑制剂或抗自身免疫引起的疾病或由导致凝血因子合成减少的疾病或病症引起的止血疾病。患者的需要取决于要治疗的特定的出血疾病。例如，可以在一段连续的时间以多个剂量给予岩藻依聚糖来治疗慢性疾病(例如先天性的或获得性的凝血因子缺乏)。可选地，可以在相对短的时间内例如一到两周以单个或多个剂量给予岩藻依聚糖来治疗急性疾病(由手术或创伤引起的出血或在接受凝血置换治疗的受治疗者中由凝血因子抑制剂/自身免疫发作引起的出血)。另外，岩藻依聚糖可以与其它的止血剂、凝血因子和药物组合使用。可以给予受治疗者治疗有效量的一种或多种选自下组的因子因子XI、因子XII、前激肽释放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和冯维勒布兰德氏因子。治疗也可以包括施用促凝血剂，如内源性途径的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽释放酶、高分子量的激肽原或外源性途径的激活因子，包括组织因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。另外需要输入血液制品以补充大量出血患者的血液流失，并且在受伤的情况下，进行手术修复以阻止出血是适宜的。本发明也提供了逆转受治疗者中抗凝血剂效应的方法，所述方法包括给予受治疗者治疗有效量的包括纯化的岩藻依聚糖的组合物。在一些实施方案中，受治疗者已经用抗凝血剂进行了治疗，这些抗凝血剂包括但不限于肝素、香豆素衍生物如苄丙酮香豆素或双香豆素、TFPI, AT III、狼疮抗凝血剂、线虫抗凝肽(NAPc2)、活性位点阻断因子VIIa(因子VIIai)、因子IXa抑制剂、因子Xa抑制剂(包括磺达肝癸(fondaparinux)、艾屈肝素(idraparinux)、DX_9065a 和雷扎沙班(razaxaban) (DPC906)、因子 Va 和 VIIIa 的抑制剂(包括活化的蛋白C(APC)和可溶的凝血调制蛋白、凝血酶抑制剂(包括水蛭素、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和希美加群(ximelagatran)。在一些实施方案中，受治疗者中的抗凝血剂可以是结合凝血因子的抗体，包括但不限于结合因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子XI、因子XII、冯维勒布兰德氏因子、前激肽释放酶或高分子量的激肽原(HMWK)的抗体。在一些实施方案中，纯化的岩藻依聚糖提取物可以单独施用或与一种或多种不同的岩藻依聚糖共同施用和/或一种或多种其他的逆转受治疗者中的抗凝血剂效应的治疗剂组合施用。例如可以给予受治疗者治疗有效量的包括岩藻依聚糖和一种或多种选自以下因子的组合物因子XI、因子XII、前激肽释放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和冯维勒布兰德氏因子。治疗还可以包括施用促凝血剂，如内源性途径的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽释放酶、高分子量的激肽原或外源性途径的激活因子，包括组织因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。在另一方面，本发明提供了增强正在进行手术和侵入性操作的受治疗者的方法， 所述方法包括给予受治疗者治疗有效量的包括纯化的岩藻依聚糖的组合物。在一些实施方案中，岩藻依聚糖可以单独向正在接受外科手术或侵入性操作的受治疗者给药或与一种或多种不同的岩藻依聚糖共同施用和/或与一种或多种其他的治疗剂组合施用。例如可以给予受治疗者治疗有效量的一种或多种选自下组的因子因子XI、因子XII、前激肽释放酶、高分子量的激肽原(HMWK)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、因子II、因子VIIa和冯维勒布兰德氏因子。治疗还可以包括施用促凝血剂，如内源性途径的激活因子，包括因子Xa、因子IXa、因子XIa、因子XIIa和Villa、前激肽释放酶、高分子量的激肽原或外源性途径的激活因子，包括组织因子、因子Vila、因子Va和因子Xa。在另一个方面，本发明提供了抑制TFPI活性的方法，包括将包括TFPI的组合物与足量的岩藻依聚糖结合来抑制TFPI活性。在一些实施方案中，通过包括向受治疗者给予治疗有效量的含有纯化岩藻依聚糖提取物的组合物的方法抑制受治疗者中TFPI活性。在一些实施方案中，本发明提供了抑制生物样品中TFPI活性的方法，所述方法包括结合生物样品(例如血液和血浆)和足量的纯化岩藻依聚糖提取物来抑制TFPI活性。3.实验以下是实施本发明的具体实施方式
的实施例。提供以下实施例只是为了说明的目的，而不是意欲以任何方式限制本发明的范围。虽然已经努力确保所用数据(例如量、温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差应该是允许的。实施例I纯化岩藻依聚糖实验I第I 天将岩藻依聚糖提取物(50克，NPNutra批号050316-FU-85)溶于1，OOOmL的高纯水(NERL，批号#0808036)，在40_45°C的水浴中搅拌45分钟。溶液的pH为5. 82，温度为41 °C，此时搅拌加入2. 5克EDTA 二钠(2. 5% w EDTA/w岩藻依聚糖提取物，EDTA批号006139，来自Fisher)。EDTA溶解后溶液的pH降到4. 70，然后用O. IM NaOH将pH上调到6. 02。混合该反应物并在40-45°C和pH6. 0(±0. 2)维持I小时。I小时后，加入24克的氯化钠(2%w/v，Fisher批号#010166)并除去水套。然后用O. IM NaOH将pH从5. 7调到5. 95。掺加大约I体积的无水乙醇(I. I升,Sigma-Aldrich批号06563JE)沉淀岩藻依聚糖,使其在环境温度下沉淀过夜。第2天通过抽吸除去多糖沉淀中的上清液。加入I升(1，OOOmL)的室温高纯水再溶解沉 淀物，接着进行30-60分钟的剧烈搅拌。沉淀物成为溶液后，通过连续混合溶液溶解20克(2% w/v)氯化钠。将第一天的重溶再盐溃化的沉淀与SOOmL的无水乙醇混合将多糖再次沉淀。第3天再次除去第2天沉淀的上清液，在第3天重复重溶(1，OOOmL NERL水)-再盐溃化(20克NaCl)-沉淀(800mL的无水ΕΤ0Η)整个过程。再次过夜沉淀岩藻依聚糖。第4天在第4天,通过抽吸除去多糖沉淀的上清液。接着通过用900ml的高纯水在22°C混合1-1. 5小时溶解沉淀。其pH测定为6. 85，通过加入6N HCl调节到ρΗ5· 8。通过O. 2 μ mKLEENPAK N66P0SIDYNE滤囊(Pall，批号IJ7287)过滤整个溶液。接着将烧瓶和滤器用IOOmL高纯水冲洗，高纯水接着通过P0SIDYNE滤器并加入到多糖溶液中。接着将全部的过滤溶液( I. 05升)装到单个冻干盘里并在-40°C冷冻3小时。随后使用以下程序冻干48小时前4小时，搁板温度10°C，接下来的20小时，搁板温度为20°C，最后的24小时搁板温度为50°C。将冻干的产物从干燥仪和盘上转移到预称重的塑料容器中。产物的产量为26. 4克(52. 8%重量产率)。产物标记为批次/实验I并放入两个塑料袋中贮存。实施例2纯化岩藻依聚糖实验2第I 天通过在40-45 °C的水浴中搅拌30-45分钟将岩藻依聚糖提取物(50克，NPNutra批号050316-FU-85)溶于I, OOOmL的高纯水(NERL，批号#0808036)。溶液的pH为5. 83，温度为42. 5°C，此时搅拌加入I. 25克EDTA 二钠(I. 25% wEDTA/w岩藻依聚糖提取物，EDTA批号006139，来自Fisher)。EDTA溶解后溶液的pH降到4. 90，然后用O. IM NaOH将pH上调到6. 04。混合该反应物并在40-45°C和pH6. 0(±0. 2)下维持I小时。I小时温育后，溶液的pH为6. 15，此时向溶液中加入22克的氯化钠。溶液的pH轻微降到5. 72，然后用O. IMNaOH将pH调到6. 08。掺加大约I升(IOOOmL)无水乙醇沉淀岩藻依聚糖，使其在室温下沉淀过夜。第2天通过抽吸除去多糖沉淀中的上清液。加入I升(1，OOOmL)的室温高纯水再溶解沉淀物，接着进行30-60分钟的剧烈搅拌。沉淀物成为溶液后，通过连续混合溶液溶解20克(2% w/v)氯化钠。将第一天的重溶再盐溃化的沉淀与750mL的无水乙醇混合将多糖再次沉淀。第3天再次除去第2天沉淀的上清液，在第3天重复重溶(1，OOOmL NERL水)，再盐溃化(20克NaCl)和沉淀(750mL的无水ΕΤ0Η)整个过程。再次过夜沉淀岩藻依聚糖。第4天
在第4天，通过抽吸除去多糖沉淀的上清液。接着通过用900ml的高纯水在22°C混合1-2小时溶解沉淀。其pH测定为6. 81，通过加入6N HCl调节到ρΗ5· 82。通过O. 2 μ mKLEENPAK N66P0SIDYNE滤囊(Pall，批号IJ7287)过滤整个溶液。接着将烧瓶和滤器用IOOmL高纯水冲洗，高纯水接着通过P0SIDYNE滤器并加入到多糖溶液中。接着将全部的过滤溶液( I. I升)装到单个冻干盘里并在-40°c冷冻3小时。随后使用以下程序冻干48小时前4小时，搁板温度10°C，接下来的20小时，搁板温度为20°C，最后的24小时搁板温·度为50°C。将冻干的产物从干燥仪和盘上转移到预称重的塑料容器中。产物的产量为25. 4克(50. 8%的重量产率)。产物标记为批次/实验2并放入两个塑料袋中贮存。实施例3表征来自实验I (实施例I)和实验2 (实施例2)的纯化的岩藻依聚糖提取物的样品并与粗岩藻依聚糖提取物(NPNutra批号050316-FU-85)比较。由BayBioanalyticalLaboratory, Inc. (BBL, Hercules, CA)进行样品分析。岩藻依聚糖的表征分析包括用具有激光散射(LLS)的大小排阻色谱检测、岩藻糖和木糖含量分析、水含量分析、重金属分析、硫酸盐分析和元素分析。使用具有LLS的大小排阻色谱测量平均分子量。通过水解岩藻依聚糖并用设计成分离小碳水化合物的柱子通过HPLC测定岩藻糖和木糖的含量。也可以使用酚-硫酸分析以岩藻糖作为标准估计总碳水化合物的含量。使用卡尔费休(Karl Fischer)(KF)分析测定水的含量。硫酸盐由离子交换色谱测定。阳离子(主要是钠、钾和其他的重金属)通过ICP-MS测定。另外,对样品进行兀素成分分析(CHNS)。由ComplexCarbohydrateResearch Center (乔治亚大学,乔治亚州雅典城)通过从样品制备per_0_三甲基甲娃烧化的甲苷然后进行GC/MS来进行单糖分析。在Avigen对内毒素通过LAL进行测定。结果汇总于表I中。表I岩藻依聚糖提取物的表征结果汇总
权利要求
1.从非均相混合物中纯化岩藻依聚糖的方法，所述方法包括 (a)提供岩藻依聚糖源； (b)通过用螯合剂处理除去上述源中的重金属离子，产生第一岩藻依聚糖混合物； (C)选择性沉淀所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖，除去污染物； (d)在水溶液中重悬含有岩藻依聚糖的沉淀物，获得第二岩藻依聚糖混合物； (e)重复步骤(C)和⑷一次或多次；和 (f)过滤含有岩藻依聚糖的水溶液，除去细菌和内毒素污染物，产生纯化的岩藻依聚糖。
2.权利要求I所述的方法，其中所述纯化的岩藻依聚糖含有5到25百分重量的硫。
3.权利要求I或2所述的方法，其中岩藻依聚糖来源于藻类。
4.权利要求3所述的方法，其中岩藻依聚糖来源于墨角藻属或昆布属。
5.权利要求4所述的方法，其中岩藻依聚糖来源于墨角藻或海带。
6.权利要求I所述的方法，其中螯合剂选自下组乙二胺四乙酸、乙二醇-双-(β-氨乙醚)N，N，N'，Ν'-四乙酸、2，3-二巯基丙醇-I-磺酸和2，3-二巯基琥珀酸。
7.权利要求6所述的方法，其中螯合剂是乙二胺四乙酸。
8.权利要求I所述的方法，其中螯合剂固定在固体载体上。
9.权利要求8所述的方法，其中螯合剂是亚氨基二乙酸螯合树脂。
10.权利要求I所述的方法，其中在所述第一岩藻依聚糖混合物中的岩藻依聚糖用乙醇选择性地沉淀。
11.权利要求10所述的方法，其中乙醇的浓度为40%到50%(ν/ν)。
12.权利要求10所述的方法，其中pH保持在5.7到6. O之间。
13.权利要求12所述的方法，其中pH调节到5.95。
14.权利要求10所述的方法，其中向所述第一岩藻依聚糖混合物或所述第一岩藻依聚糖混合物和第二岩藻依聚糖混合物中加入NaCl，浓度为20-24g/升。
15.权利要求I所述的方法，其包括重复步骤(c)和(d)三次。
16.权利要求I所述的方法，进一步包括冻干纯化的岩藻依聚糖。
17.—种组合物，其包括权利要求1-16任一项所述的方法产生的纯化的岩藻依聚糖，其中所述纯化的岩藻依聚糖具有通过电感耦合等离子体质谱检测的检测不到水平的砷、漠、铺、钻、铅、裡、钥、锡、鹤和f凡。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述岩藻依聚糖有生物学活性。
19.权利要求18所述的组合物，其中所述岩藻依聚糖有促凝血活性。
20.权利要求17-19任一项所述的组合物，还包括药学上可接受的赋形剂。
21.权利要求17-20任一项的组合物在制造用于治疗需要增强凝血的受治疗者的药物中的用途。
22.权利要求21所述的用途,其中岩藻依聚糖以O.Olmg/kg到100mg/kg的剂量给药。
23.权利要求21或22所述的用途，其中受治疗者患有选自下组的出血疾病慢性或急性出血疾病、血液因子缺乏导致的先天性凝血疾病和获得性凝血疾病。
24.权利要求21或22所述的用途，其中受治疗者在急性受伤或受伤情况下需要增强止血。
25.权利要求21或22所述的用途，其中需要增强凝血的原因是先前使用了抗凝血剂、手术或其他侵入性的操作。
26.权利要求21或22所述的用途，其中需要增强凝血的原因是用作抗炎剂、抗癌剂、抗病毒剂或用于造血祖细胞动员。
27.权利要求1-16任一项的方法产生的岩藻依聚糖在制造用于治疗需要增强凝血的受治疗者的药物中的用途。
全文摘要
本申请公开了从褐藻提取物中纯化岩藻依聚糖的方法。具体地说，公开了纯化提取物中的岩藻依聚糖以除去重金属离子、细菌和内毒素污染物以及其他杂质的方法。所述方法应用了螯合剂、选择性沉淀和过滤等手段。
文档编号A61P7/04GK102911281SQ20121041776
公开日2013年2月6日 申请日期2008年2月1日 优先权日2007年2月23日
发明者帕特里克·N·嘉康利, 詹尼弗·巴哈-戴维森, 斯里尼瓦莎·普拉萨德, 科克·约翰逊 申请人:巴克斯特国际公司, 巴克斯特健康护理股份有限公司