专利名称：含细胞的可流动组合物的最小侵入性给药的材料和方法
含细胞的可流动组合物的最小侵入性给药的材料和方法
本申请是申请日为2005年12月6日、申请号为200580042372. X、题为“含细胞的可流动组合物的最小侵入性给药的材料和方法”的专利申请的分案申请。
相关申请日期
根据美国法典35章节119(e)，2005年12月6日提交的本非临时专利申请要求2004年12月8日提交的临时专利申请U. S. S. N. 60/634, 155，2005年3月21日提交的临时专利申请U. S. S. N. 60/663, 859，2005年5月19日提交的临时专利申请U. S. S. N. 60/682，054，以及_提交的临时专利申请U. S. S. N. 60/的优先权；并且根据美国法典35章节120，363和/或365，要求与本申请同一天提交的共同待决的国际专利申请PCT/US_(也称作代理机构案号ELV-002PC)，以及与本申请同一天提交的共同待决的国际专利申请PCT/US_(也称作代理机构案号ELV-008PC)的优先权；上述每一个专利申请的全部内容均弓I入本文作为参考。
发明背景
心血管疾病每年在全世界造成超过5亿人死亡，在美国造成I百万人死亡。在美国，每年大约完成150万次手术以试图减轻因这些疾病自发引起的阻塞性动脉病变。可提到的这些手术的几个包括球囊血管成形术和激光血管成形术、斑块旋切术、血管内支架术和旁路移植术等。血管成形术、血管旁路移植术甚至器官移植术的长期效果由于在这些程序之后促进了动脉病的发生而受到限制。内膜完整性的缺失、闭塞性血栓症及导致内膜增生的平滑肌细胞痉挛、迁移和增殖是这类动脉病的典型代表。例如，再狭窄导致这些患者中的20-50%发生阻塞性动脉病变。在冠状动脉成形术后的3-6个月内，超过三分之一的患者需要额外的介入术、另一次血管成形术甚至旁路手术。斑块旋切术装置也不佳，随着接受这种手术的患者人数增加，再狭窄发生的比率从10%攀升到了 47%。血管内支架的使用在这一点上同样有些令人失望。近来的一项研究报道，在支架插入后的最初几天内，除大约5%的患者发生急性并发症，如突然关闭外，再狭窄发生的比率为35%。
在接受血管旁路手术的患者中观察到了类似的问题。隐静脉主动脉-冠状动脉插入移植术的平均寿命仅为7年。所有这类移植物中有10%在手术后的最初几周内闭塞。在 I年和5年期间，分别有20%和30%的移植物发生闭塞。受同样病理学支配的透析患者的动静脉瘘限制了血液透析的效果。
促进的动脉病如再狭窄的特点是大量的平滑肌细胞增殖以及由这些细胞产生的大量细胞外基质的沉积。目前已变得显而易见的是，自体动脉粥样硬化和机械性介入术之后促进的动脉病之间共有一个共同的初始病理学事件，即，内皮细胞完整性和功能的缺失。
内皮单层沿着动脉壁排列，并且作为血管生理的双重生物调节者起作用。内皮通过在循环血液和动脉壁之间形成连续的、选择性可渗透的非凝血酶原屏障，为血管提供结构的完整性。然而，已逐渐认识到的是，内皮也产生和供给能控制血流量、血管松紧状态 (vessel tone)、闭塞性血栓症、血小板活化、粘附和聚集、白细胞粘附、单核细胞渗透及平滑肌细胞迁移和增殖的产物。由于平滑肌细胞有丝分裂原普遍存在于动脉壁中，是完整内皮的存在使正常血管维持在了静止状态。在内皮受损或移除后，由内皮分泌的化合物也同样地被移除，并开始发生一系列事件，从而导致了失控的平滑肌细胞增殖和迁移引发的阻塞性动脉病变。
目前用于治疗心血管疾病的许多临床介入术，包括冠状动脉成形术、冠状动脉内支架置入术和斑块旋切术，可以采用非侵入性闭合性手术方法完成。这些非侵入性血管内介入术策略应该伴有同样具有最小侵入性的递送治疗性材料至血管介入部位以治疗因此受损或患病的靶内皮的血管内模式。
此外，目前向血管内递送治疗性材料的方法依赖于将材料施于血管的内腔表面。 然而，由于与循环血液的接触限制了活性的效力和持续时间，向内腔表面施予治疗性材料或试剂仅能对受损或患病靶内皮提供暂时的效果。
本发明的一个目的是提供向位于受损或患病内腔内皮部位，或与该部位相邻，或在该部位附近的腔外或血管周围部位非侵入性地或者最小侵入性地递送细胞治疗性制剂， 并随之减少闭塞性血栓症、再狭窄、内膜增生及其它与血管介入或心血管疾病相关的临床后遗症的发生的材料和方法。
发明概述
本发明利用了这样的发现移植于可植入性可流动组合物之中、之上或之内的细胞可以设计用于多种最小侵入性递送模式，例如，在管状解剖学结构腔外表面，或在该外表面的相邻位置，或在该外表面附近进行血管内给药和血管周围沉积，所述的解剖学结构例如但不限于血管。在管状解剖学结构的外表面，或外表面之上，或外表面周围的最小侵入性递送也包括在本发明中。在血管的情况下，本发明的材料和方法适于治疗和控制与血管介入或心血管疾病相关的临床后遗症。
一方面，本发明是治疗管状解剖学结构内腔的受损或患病部位的可流动组合物， 其中的可流动组合物包括生物相容性基质和细胞，并且其中的可流动组合物的量是可以有效治疗受损或患病部位的量。根据一个实施方案，管状解剖学结构是血管。根据一些实施方案，可流动组合物以有效减少受损或患病部位的例如平滑肌细胞增殖、闭塞性血栓症、内膜增生、再狭窄、急性或慢性炎症或血管舒张等的量提供。对于本发明的目的，可流动组合物是指可以用注入或注入型递送装置例如但不限于针、注射器或导管施予的组合物。其它采用挤压、喷射或排出的递送装置也包括在本发明中。
根据一个实施方案，可流动组合物的细胞是内皮细胞或具有内皮细胞样表型的细胞。根据另一个实施方案，所述细胞是两种或两种以上细胞类型的共培养物。这两种或两种以上细胞类型选自内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞和心肌细胞。适用于本发明的细胞制品可以获自单一供体或者多个供体。
根据另一个实施方案，生物相容性基质是凝胶、泡沫或悬浮液。在另一个实施方案中，生物相容性基质包括微粒或微载体。在某些实施方案中，微粒或微载体进一步包括明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或附着肽。一个例示性的附着肽是序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的肽。根据另一个实施方案，微粒或微载体的直径为约20微米至约500微米，优选直径为约200微米。
在另一个实施 方案中，可流动组合物进一步包括载体流体。在尤其优选的实施方案中，可流动组合物是形状保持不变的，从而允许从业者在必要的程度上控制向指定的特定沉积部位的沉积。
另一方面，本发明是治疗管状解剖学结构内腔的受损或患病部位的方法。该方法包括使位于管状解剖学结构内腔的受损或患病部位，或与该部位相邻，或在该部位附近的管状解剖学结构的腔外表面与可流动组合物接触的步骤。本文中的非腔(也称作腔外)表面可以是血管的外表面或血管周围的表面。对于本发明的目的，非腔或腔外部位是除了腔的内表面之外的任何部位。在血管的情况下，例如，腔外或外腔部位可以在血管的外膜、中膜或内膜中；在非血管管状解剖学结构的情况下，相应的非腔部位都在本发明的范围内。
根据一个实施方案，通过穿过或透过管状解剖学结构的内壁，然后在位于受损或患病部位，或与该部位相邻，或在该部位附近的管状解剖学结构的外表面沉积可流动组合物来完成递送。根据另一个实施方案，本方法进一步包括在管状解剖学结构的腔外表面鉴定沉积可流动组合物的部位的步骤。根据一个实施方案，该鉴定步骤发生在该穿过或透过步骤之前，或者与该穿过或透过步骤同时发生。在一个实施方案中，该鉴定步骤通过成像完成。在另一个实施方案中，该鉴定步骤通过触诊完成。
在一个实施方案中，通过经经皮给药进入血管周隙，然后在受损或患病部位，或与该部位相邻，或在该部位附近的管状解剖学结构的外表面上沉积可流动组合物来完成递送。根据另一个实施方案，该方法进一步包括在管状解剖学结构的外表面鉴定沉积可流动组合物的部位的步骤。该鉴定步骤可以发生在该进入步骤之前，或者与该进入步骤同时发生。根据一个实施方案，该鉴定步骤通过成像完成。在另一个实施方案中，该鉴定步骤通过触诊完成。
根据本方法的各种实施方案，管状解剖学结构的外表面是非腔表面或者占据在本文别处所述的血管周隙。根据一个优选实施方案，管状解剖学结构是血管。根据另一个优选实施方案，血管包括支架。在另一个优选实施方案中，被治疗的管状解剖学结构是非血管结构，例如但不限于输卵管。
附图简述
图1是根据本发明的一个例证性实施方案的典型细胞生长曲线。
发明详述
正如本文所解释的那样，本发明基于这样的发现基于细胞的疗法可以用于治疗、 缓解、控制和/或减少与血管介入或心血管疾病相关的临床后遗症，尤其是闭塞性血栓症、 再狭窄、内膜增生、炎症和血管舒张的进展。本发明进一步受益于另一发现，即，迄今为止尚无记载的可流动组合物，例如微粒制剂，能提供铺满的活力充足的细胞群，该组合物包括移植于生物相容性基质例如可植入性微粒材料之中、之上或之内的细胞，并且该组合物可以采用最小侵入性给药模式例如闭合性程序中的血管内递送或局部经皮递送有效给药，而不降低临床效果或者可植入性可流动组合物的移植细胞的存活率。下面列出的教示对制造和使用本发明的材料和方法提供了充分的指导，并进一步对确定适当的用于测试、测量和监控本发明的材料和方法的性能的标准和受试者提供了充分的指导。
因此，已经开发出来用于临床上控制血管介入或心血管疾病的基于细胞的疗法。 本发明的例示性实施方案包括适用于本文所述治疗范例的生物相容性基质和细胞。尤其是，在一个优选实施方案中，可植入性可流动组合物包括生物相容性基质和内皮细胞或内皮样细胞 。在另一个优选实施方案中，可植入性可流动组合物包括内皮细胞或内皮样细胞， 优选人主动脉内皮细胞和微粒型生物相容性基质。
本发明的可植入性可流动组合物包括移植于生物相容性基质之上、之中和/或之内的细胞。移植的意思是指经细胞对细胞和/或细胞对基质的相互作用牢固地附着，以使细胞能承受住本文公开的制备性操作的苛刻条件。如本文别处解释的那样，可植入性可流动组合物的一个有效实施方案包括具有优选表型的近铺满细胞群、铺满细胞群或铺满后细胞群。理所当然的是，在制备性操作期间，可植入性可流动组合物的实施方案很可能脱落细胞和/或某些细胞不象其它细胞那样牢固地附着。所有必需的条件是，可植入性可流动组合物包括的细胞应符合本文所述功能或表型的标准。
本发明的可植入性可流动组合物根据组织工程学原理开发，并代表了满足上述临床需求的新方法。本发明的可植入性可流动组合物的独特之处在于，移植于生物相容性基质之上、之中和/或之内的活细胞可以在生理反馈控制下向管状解剖学结构提供处于生理比例的基于多种细胞的产物。如本文别处所述的那样，适用于可植入性可流动组合物的细胞是内皮细胞或内皮样细胞。由这些细胞进行的多种化合物的局部递送及生理动力学给药对负责维持功能性腔内皮的过程提供了更有效的调节。重要的是，例如本发明的可植入性可流动组合物中的内皮细胞由于其优选置于非腔或腔外部位而避免了血管内腔中的侵蚀性血流的破坏。
当本发明的可植入性可流动组合物以包裹、沉积或其它方式与位于受损或患病靶腔，或与该靶腔相邻，或在该靶腔附近的腔外或非腔部位接触时，其用于重建内环境稳态。 即当腔外给药时，本发明的可植入性可流动组合物可以提供模拟支持性生理环境，并有助于促进功能性内腔的生长。如本文预期的那样，管状解剖学结构是具有内腔表面和腔外表面的结构。在某些结构中，内腔表面是内皮细胞层；在另外一些结构中，内腔表面是非内皮细胞层。此外，对于本发明的目的，如本文别处描述的那样，腔外或非腔表面可以是但不限于是管状结构的外表面。
例如，内皮细胞可以释放多种试剂，这些试剂联合起来可以抑制或缓解与血管介入或心血管疾病后的急性并发症相关的不良生理事件。如本文例示的那样，重演正常生理的组合物和使用方法以及给药可以增强内皮的功能性，并提高该腔内皮的长期通畅率。通常地，治疗包括在受损或患病靶内皮处，或在该靶内皮相邻位置，或在该靶内皮附近，例如， 在目标血管结构腔外面的血管周隙沉积本 发明的可植入性可流动组合物。当沉积或以其它方式接触受损、受创或患病血管时，可植入性可流动组合物的细胞可以向目标血管结构，例如血管内的底层平滑肌细胞提高生长调节性化合物。虽然在血管外面，但本发明的可植入性可流动组合物提供了来自于细胞的多种调节性化合物的有效供应，同时却避免了产生血管内腔中的血流的机械作用。
用本发明的优选实施方案治疗受损或患病血管可以促进正常或近正常恢复和正常生理。相比之下，在缺乏用本发明的优选实施方案治疗的情况下，正常生理的恢复受到破坏，例如，在血管介入或心血管疾病之后，自体内皮细胞和平滑肌细胞可以以极快或失控的速度异常生长。因此，如本文预期的那样，采用本发明的可植入性可流动组合物的治疗将产生血管介入或心血管疾病部位的自体组织的正常或近正常恢复,例如,足以维持正常或近正常血管通畅率。
本发明的可植入性可流动组合物可以以多种构型置于被治疗血管结构中。血管可以全部或部分接触；例如，本发明的可植入性可流动组合物可以沿圆周方向或以弧形应用于血管。血管仅需要与一定量的足以改善血管结构的功能性的可植入性可流动组合物接触。
对于本发明的目的，接触是指直接或间接地如与本文别处所定义的腔外或非腔表面相互作用。在某些优选实施方案的情况下，实际的物理接触不是效力所必需的。在其它实施方案中，实际的物理接触是优选的。所有实施本发明所必需的条件是，在受损或患病部位，或在该部位的相邻位置，或在该部位的附近的腔外或非腔部位沉积可以有效治疗受损或患病部位的量的可植入性材料。在某些疾病或损伤的情况下，患病或受损部位可以在临床上表现于内腔表面。在其它疾病或损伤的情况下，患病或受损部位可以在临床上表现于腔外或非腔表面。在一些疾病或损伤中，患病或受损部位可以在临床上表现于内腔表面和腔外或非腔表面。本发明可以有效治疗任何一种前述临床表现。
本发明的可植入性可流动组合物的实施方案可以应用于任何需要介入治疗以维持内环境稳态的管状解剖学结构。如本文预期的那样，管状解剖学结构是具有内腔表面和腔外或非腔表面的结构。对于本发明的目的，腔外表面可以是但不限于管状结构的外表面。 在某些管状结构中，内腔表面是内皮细胞层；在某些其它结构中，内腔表面是非内皮细胞层。本发明可以有效治疗衬有内皮细胞或衬有非内皮细胞的管状结构。
管状解剖学结构包括血管系统、生殖系统、泌尿系统、胃肠道系统、肺系、呼吸系统以及脑和脊髓的脑室系统的结构。管状解剖学结构的代表性例子包括动脉和静脉、泪管、气管、支气管、细支气管、鼻道(包括鼻窦)及其它气道、咽鼓管、外耳道、□腔、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、胆道、输尿管、膀胱、尿道、输卵管、子宫、阴道及其它女性生殖道的通道、输精管及其它男性生殖道的通道、血管鞘以及脑和脊髓的脑室系统(脑脊液)。对于本发明的目的，管状解剖学结构可以是天然或非天然的，例如但不限于手术产生的吻合口。
受损或患病内皮在某些优选实施方案中，可以用本发明治疗的导致血管损伤的血管介入包括但不限于血管成形术、斑块旋切术、血管支架(包括裸金属支架和药物洗脱支架)、血管旁路手术(包括动脉旁路移植术和外周动脉旁路移植术)、器官移植、动静脉瘘及其它血管吻合口形成术、动静脉、外周及其它移植成形术，以及随后发生的血管入口相关损伤，包括进入血管透析期间获得的针刺伤或其它介入治疗。每种介入均对血管腔的内皮细胞衬里产生一定程度的损伤。反之，受损血管腔经历级联生化事件，从而导致多种临床可鉴定的后遗症，包括但不限于闭塞性血栓症、再狭窄、内膜增生、急性和慢性炎症、平滑肌细胞增殖、血管重塑、血管舒张和易损斑块病变的形成。
血栓症或闭塞性血栓症与血小板的粘附、聚集和机化有关；闭塞性血栓症通常与机化血栓相关。血栓症的特征在于血栓区域中的血流缺失。内皮或内皮样细胞释放的抗血栓化合物包括，但不限于硫酸乙酰肝素蛋白多糖、前列环素和一氧化氮。用本发明的可植入性可流动组合物治疗可以提高被治疗血管的通畅率。
狭窄、再狭窄、内膜增·生和平滑肌细胞增殖的特征在于与平滑肌细胞在腔内旺盛生长相关的血管腔的阻塞性病变。内皮或内皮样细胞向腔区域内释放抑制平滑肌细胞增殖的化合物。例示性的由内皮或内皮样细胞产生的治疗性化合物包括，但不限于硫酸乙酰肝素、TGF-β和一氧化氮。狭窄、再狭窄、内膜增生和平滑肌细胞增殖通过例如血管造影术、 血管内超声或其它超声技术鉴定。用本发明的可植入性可流动组合物治疗可以减小狭窄百分率、闭塞程度和/或提高与被治疗血管相关的通畅率。
炎症与炎症细胞的募集、粘附和渗透有关，炎症细胞包括但不限于粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。此外，血管通透性的增加导致体液、免疫球蛋白、补体及其它血液蛋白在损伤部位的邻近组织中的局部积聚，其反过来诱导与循环单核细胞及中性粒细胞的表面结合的粘附分子的表达，大大增加噬菌细胞迁移穿过腔表面并进入邻近组织的速度。活化后，这些细胞可以释放水解酶、细胞因子、趋化因子和生长因子。在炎症的慢性进展期，受损部位变成有纤维帽包被的，该纤维帽覆盖在脂核和坏死组织上。内皮或内皮样细胞向腔区域内释放可以减少炎症反应的抗炎化合物。用本发明的可植入性可流动组合物治疗可以抑制炎症细胞的活性和/或积聚，因此减少了生长因子的产生和分泌，并减少了巨噬细胞的局部血管渗透，从而预防、减少或缓解血管损伤部位的急性炎症反应。急性炎症反应的缓解或预防可以中断导致慢性炎症的事件，从而使最终的腔损害和/或血管功能障碍最小化。另外，慢性发炎组织的缓解或康复可以减低长期风险例如血管疾病(包括但不限于易损斑块或动脉粥样硬化)发作的风险。对血管疾病的进一步讨论公开于与本申请同一天提交的共同待决的申请PCT/US_(代理机构案号ELV-008PC)中，其全部内容引入本文作为参考，所述血管疾病包括但不限于易损斑块和动脉粥样硬化。
此外，可以用本发明治疗的自发性心血管疾病包括但不限于如急性和慢性炎症、 闭塞性血栓症、内膜增生、再狭窄、平滑肌细胞增殖、血管舒张、负性血管重塑、血管结构腔内的易损斑块病变以及各种不稳定性动脉综合征等。其它可以用本发明治疗的易损血管病症包括任何与需求量相比血液供应量不足的局部缺血、氧不足或损伤状态。易损血管病症可以由任何负性影响血液供应的损伤或修复产生。例示性的易损病症包括不稳定性动脉综合征，例如局部缺血、不稳定性心绞痛(包括范围从运动诱导型心绞痛到静息型心绞痛的不稳定性范围)、主动脉缺血、外周缺血(包括范围从间歇性跛行到坏疽的病症范围)、肠缺血和肾缺血等。
在本发明的某些实施方案中，在第一次血管介入，例如血管成形术、支架置入术或吻合术的同时采用本发明的可植入性可流动组合物治疗受损或患病靶内皮。这种治疗可以减小由血管介入导致的损伤，例如血管成形术导致的内皮裸露。根据其它实施方案，可植入性可流动组合物被施用于拯救血管介入之后受损或患病的靶内皮以及与介入相关的临床动脉病，包括但不限于例如再狭窄或闭塞性血栓症的发展。
在本发明的某些实施方案中，在给予可植入性可流动组合物之前、同时和/或之后给予了额外的治疗剂。例如，可以给予预防或减少血液凝块形成、血小板聚集或其它类似阻塞物的试剂。例示性的试剂包括，例如硫酸乙酰肝素和TGF-β。根据植入的适应症，还可以向可植入性可流动组合物中加入其它细胞因子或生长因子，包括促进再内皮化的VEGF 以及促进血管完整的b-FGF。其它类型的治疗剂包括但不限于抗增殖剂和抗肿瘤剂。例子包括雷帕霉素、紫杉醇和E2F Decoy试剂。任何前述试剂均可以局部或全身给药；如果为局部给药，某些试剂可以包含在可植入性可流动组合物内。
细胞来源:如本文描述的那样，本发明的可植入性可流动组合物包括细胞。细胞可以是同种异体的、异种的或自体的。在某些实施方案中，活细胞的来源可以得自适当的供体或多个供体。在某些其它实施方案中，细胞的来源可以得自尸体或细胞库。
在一个目前优选的实施方案中，细胞是内皮细胞。在一个尤其优选的实施方案中， 这些内皮细胞获自血管组织，优选但不限于动脉组织。如下文例示的那样，一种适 用的血管内皮细胞类型是主动脉内皮细胞。另一种适用的血管内皮细胞类型是脐静脉内皮细胞。又一种适用的血管内皮细胞类型是冠状动脉内皮细胞。其它适用于本发明的血管内皮细胞类型包括肺动脉内皮细胞和髂动脉内皮细胞。
在另一个目前优选的实施方案中，适宜的内皮细胞可以获自非血管组织。非血管组织可以得自任何本文别处所述的管状解剖学结构，或者可以得自任何非血管组织或器官。
在另一个实施方案中，内皮细胞可以得自内皮祖细胞或干细胞；在另一个实施方案中，内皮细胞通常可以得自祖细胞或干细胞。在其它优选实施方案中，细胞可以是得自血管或非血管组织或器官的同种异体、异种或自体的非内皮细胞。本发明还包括前述经基因改造、基因修饰或基因工程制造的任何细胞。
在进一步的实施方案中，将两种或两种以上类型的细胞共培养，以制备本发明的组合物。例如，将第一种细胞导入生物相容性可植入性材料中，并培养至铺满。第一种细胞类型包括，例如平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的组合、其它任何需要的适于产生有助于内皮细胞生长的环境的细胞类型或需要的细胞类型的组合。一旦第一种细胞类型达到铺满状态，则将第二种细胞类型接种在位于生物相容性可植入性材料之中、之上或之内的第一种铺满细胞类型上，并培养至第一种细胞类型和第二种细胞类型均达到铺满状态。第二种细胞类型包括，例如内皮细胞或其它任何需要的细胞类型或细胞类型的组合。第一和第二种细胞类型可能包括得自两个或两个以上不同供体或来源的相同的细胞类型。第一和第二种细胞类型可以逐步导入，或者作为单一的混合物导入。也可以改变细胞的密度，从而对于AV移植将平滑肌细胞对内皮细胞的比例变为约2:1，对于外周旁路术将比例变为约1:1，或者其它适合其它临床应用的比例。
为预防有过度增殖倾向的平滑肌细胞或其它细胞类型的过度增殖，可以修改培养程序。例如，在第一种细胞类型铺满之后，在导入第二种细胞类型之前，可以先将培养物用适于第二种细胞类型的附着因子覆盖。例示性的附着因子包括用明胶覆盖培养物，以提高内皮细胞的附着性。根据另一个实施方案，在第二种细胞类型培养期间，向培养基中加入肝素可以减少第一种细胞类型的增殖，并优化需要的第一种细胞类型与第二种细胞类型的比例。例如，在平滑肌细胞初始生长之后，可以给予肝素以控制平滑肌细胞的生长，从而达到较大的内皮细胞对平滑肌细胞的比例。
在一个优选实施方案中，首先通过将平滑肌细胞接种至生物相容性基质以产生血管结构而产生共培养物。一旦平滑肌细胞达到铺满状态，则将内皮细胞接种于可植入性材料上培养的平滑肌细胞上，以产生模拟血管。该实施方案可以根据本文所述方法施用于例如AV移植或外周旁路移植，以促进假体移植材料的整合。
所有本发明的组合物的细胞所必需的条件是显示一种或多种优选表型或功能特性。如本文前面描述的那样，本发明基于这样的发现具有易鉴定表型的细胞当与优选生物相容性基质(在本文别处描述)联合时，其可以促进、修复和/或以其它方式调节与治疗受损或患病靶血管内皮或另一管状解剖学结构的受损或患病靶腔相关的内皮细胞生理和/ 或腔内环境稳定。
对于本发明的目的，本发明的一种优选易鉴定的典型细胞表型是通过下文所述体外分析法测量，能抑制或以其它方式干扰平滑肌细胞增殖的表型。本文称之为抑制性表型。
由本发明的组合物的细胞显示的其它易鉴定表型是抗血栓或能抑制血小板粘附和聚集的表型。抗血栓活性可以用下文所述体外硫酸乙酰肝素分析法和/或体外血小板聚集分析法测定。
在本发明的典型有效实施方案中，细胞需要显示的表型不超过前述表型中的一种。在某些实施方案中，细胞可以显示一种以上前述表型。
虽然前述表型各自代表一种功能性内皮细胞，例如但不限于血管内皮细胞，但显示这种(这些)表型的非内皮细胞从本发明的目的考虑，认为是内皮样细胞，因此适用于本发明。本文也将内皮样细胞称作内皮细胞的功能性类似物，或内皮细胞的功能性模拟物。因此，仅为举例说明目的，适用于本文中公开的材料和方法的细胞还包括产生内皮样细胞的干细胞或祖细胞；起源为非内皮细胞但在功能表现上类似于经本文所述参数判定的内皮细胞的细胞；任何起源的经工程改造或以其它方式修饰后，经本文所述参数判定具有内皮样功能性的细胞。
通常地,当存在于铺满、近铺满或铺满后细胞群,并与优选生物相容性基质如本文所述的那些联合时，本发明的细胞显示出一种或多种上述表型。本领域技术人员应了解的是，铺满、近铺满或铺满后细胞群可以通过多种技术容易地鉴定，其中最常用并被广泛公认的技术是直接显微观察。其它技术包括采用标准细胞计数技术，例如但不限于血细胞计数器或库尔特计数器来评估每单位表面积的细胞数。
此外，对于本发明的目的，内皮样细胞包括但不限于用本文所述参数测量时，在功能和表型上仿效或模拟近铺满、铺满及铺满后内皮细胞的细胞。
因此，利用下文所述详细说明和指导，本领域普通技术人员将了解如何制造、使用、测试和鉴定本文公开的可植入性可流动组合物的有效实施方案。那就是，本文公开的教示提供了所有制造和使用本发明的可植入性可流动组合物所必需的条件。此外，本文公开的教示提供了所有有效鉴定、制造和使用含有等同细胞的有效组合物所必需的条件。最后， 所有必需的条件是，依照本文公开的方法这些等同体可以有效治疗、控制、调节或缓解腔损伤或疾病，例如作为非限制性例子的与血管介入或心血管疾病相关的腔损伤或疾病。如熟练从业者将了解的那样，本发明的组合物的等同实施方案可以仅采用常规实验和本文提供的教示来鉴定。
在某些优选实施方案中，用于本发明的可植入性可流动组合物的内皮细胞分离自人尸体供体的主动脉。每批细胞均可以得自单个或多个供体。每批细胞均广泛测试其内皮细胞纯度、生物学功能、细菌、真菌、已知人病原体及其它外来试剂的存在。将细胞用公知技术冷冻保存和库存，待以后培养扩展，随后制成可植入性组合物。
细胞制备:如上所述，适宜的细胞可以获自各种组织类型和细胞类型。在某些优选实施方案中，用于可植入性可流动组合物的人主动脉内皮细胞分离自尸体供体的主动脉。 在另外的实施方案中，猪主动脉内皮细胞(CellApplications, San Die`go, CA)通过与分离人主动脉内皮细胞类似的程序从正常猪主动脉中分离。每批细胞均可以得自单个或多个供体，然后广泛测试其内皮细胞存活率、纯度、生物学功能、支原体、细菌、真菌、酵母菌、已知人病原体及其它外来试剂的存在。用公知技术将细胞进一步培养、鉴定和冷冻保存，以形成第3至第6代的工作细胞库，待以后培养扩展，随后制成生物相容性可植入性组合物。
人或猪主动脉内皮细胞在每瓶加入内皮细胞生长介质约15ml的预处理的T-75瓶中制备。人主动脉内皮细胞在内皮细胞生长培养基(Endothelial Growth Media, EGM-2, Cambrex Biosciences 公司，East Rutherford,新泽西)中制备。EGM-2 由内皮细胞基础培养基(EndothelialBasal Media, EBM-2, Cambrex Biosciences 公司)和含有 2%FBS的EGM-2SingleQuots组成。猪细胞在加有5%FBS和50 μ g/ml庆大霉素的EBM-2中制备。将培养瓶置于孵化器中，在约37° C、5%C02/95%空气及湿度90%的条件下保持最少 30分钟。将一瓶或两瓶细胞从-160° C至-140° C冰箱中取出，在约37° C下解冻。每瓶解冻后的细胞以优选约3 X IO3个细胞/cm3，但不小于1. O X IO3个/cm3且不大于7. O X IO3 个/cm3的密度接种至两个T-75瓶中；然后将含有细胞的培养瓶放回孵化器中。约8-24小时后，除去培养基(spent media),并替换以新鲜培养基。此后,每2_3天更换一次培养基, 直至细胞达到优选约85-100%，但不小于60%且不大于100%的铺满度。当可植入性可流动组合物打算用于临床时，仅无抗生素培养基可以用于人主动脉内皮细胞的解冻后培养及本发明的可植入性可流动组合物的生产。
然后除去内皮细胞生长培养基，细胞单层用IOmlHEPES缓冲盐水(HEPES)冲洗。除去HEPES，加入2ml胰岛素以使细胞从T-75瓶壁上脱离。当脱离发生后，加入3ml胰岛素中和溶液(TNS)以终止酶反应。另外加入5ml HEPES，细胞用血细胞计数器计数。将细胞悬浮液离心，在人细胞的情况下，用无抗生素EGM-2调节密度至约1. 75 X IO6个细胞/ml，或在猪细胞的情况下，用加有5%FBS和50 μ g/ml庆大霉素的EBM-2调节密度至约1. 50 X IO6个细胞 /ml。
生物相容性基质:根据本发明，可植入性可流动组合物的一个优选实施方案包括形式为凝胶、泡沫、悬浮液、微载体、微囊、可流动纤维结构或其它可流动材料的生物相容性基质。生物相容性基质允许细胞生长并附着至基质、在其上或基质内。当植入例如血管的外表面时，生物相容性基质可以在其被生物侵蚀之前停留在植入部位约7-90天，优选至少约7-14天,更优选至少约14-28天,最优选至少约28-90天。
对于本发明的目的，可流动组合物是指可以用注入或注入型递送装置例如但不限于针、注射器或导管给药的组合物。其它采用挤压、喷射或排出的递送装置也包括在本发明中。任何用于注入型递送装置的非固体形式的生物相容性基质均包括在本发明中，其中的装置能通过顺着血管内部长度行进而实施血管内给药或局部经皮给药。优选的可流动组合物是形状保持不变的。如本文预期的那样，含有移植入可流动微粒基质的细胞的可植入性可流动组合物，被设计用于任何注射用递送装置，该装置包括内径范围为22号标准尺寸至 26号标准尺寸，长度范围为约1至20mm的针。优选注射用递送装置能递送约50mg、在约I 至约3ml介质中含有约I百万个细胞的可植入性微粒材料。
根据本发明的一般优选实施方案，可流动组合物包括生物相容性微粒基质，例如得自猪皮I父的广品Gelfoam 微粒、Gelfoam 粉末或粉状GelfoamR (Pfizer Inc.公司， 纽约，纽约州)(以下称“Gelfoam微粒”)。根据另一个实施方案，生物相容性微粒材料是 Cytodex-3(AmershamBiosciences公司，Piscataway,新泽西)微载体，其由与交联葡聚糖基质结合的变性胶原蛋白组成。根据另一个实施方案，生物相容性可植入性微粒基质包括改良藻酸盐微粒；生物相容性聚合体如通过水解降解的合成聚合体，例如多羟酸如聚乳酸、聚乙二醇酸及其共聚物；聚原酸酯(polyorthoesters);聚酐；蛋白质如明胶、胶原蛋白、纤维蛋白胶；或碳水化合物或多糖，例如纤维素和衍生化纤维素、壳聚糖、藻酸盐或其组合物。生物相容性基质是能在可流动组合物给药后的数天、数周或数月的时间里逐渐消失的材料。 降解的速率取决于选定的生物相容性基质，并且降解的速率可以根据治疗和临床情况的性质进行调整。
根据另一个实施方案，可植入性微粒基质可以是改良微粒基质。可以对可植入性微粒基质的改良进行选择，以优化和/或控制细胞与可植入性微粒基质结合时细胞的功能，所述细胞包括上文所述细胞的表型(例如，抑制性表型)。根据一个实施方案，对可植入性微粒基质的改良包括用附着因子或粘附肽涂覆微粒，该附着因子或粘附肽可以增强细胞抑制平滑肌细胞增殖、减少炎症、增加硫酸乙酰肝素的产生、增加前列环素的产生和/或增加TGF-h的产生的能力。例示性的附着因子包括，例如纤连蛋白、纤维蛋白胶和采用标准水性碳二亚胺化学共价结合的细胞粘附配体(包括例如RGD)。其它细胞粘附配体包括具有细胞粘附鉴定序列的肽，包括但不限于RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY和REDV。
根据另一个实施方案，可植入性微粒基质是除Gelfoam之外的微粒。其它例示性微粒基质包括，例如纤维蛋白胶、藻酸盐、聚苯乙烯磺酸钠微载体、胶原蛋白涂层葡聚糖微载体、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物(每个共聚物的聚合体比例在1_100%之间)。根据优选实施方案，这些其它微粒基质经改良后包括上文所述附着因子或粘附肽。例示性附着因子包括，例如明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白胶和采用标准水性碳二亚胺化学共价结合的细胞粘附配体(包括RGD)。其它细胞粘附配体包括具有细胞粘附鉴定序列的肽，包括但不限于 RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR, GRGDY 和 REDV。
根据另一个实施方案，可植入性微粒基质经物理改良以促进细胞附着。根据一个实施方案，使可植入性微粒基质交联以增强其机械特性，并促进其细胞附着和生长特性。根据优选实施方案，藻酸盐微粒先用硫酸钙进行第一次交联，然后用氯化钙进行第二次交联， 最后按常规方案进行。根据另一个实施方案，在细胞培养之前将肝素或硫酸乙酰肝素的来源，例如肝素-琼脂糖加入基质内。
包括生物相容性微粒基质的可植入性可流动组合物优选用内径为22号标准尺寸至26号标准尺寸的针进行递送。因此，形成这样的基质的微粒优选具有能通过本文所定义的适当针孔的直径。根据优选实施方案，这样的基质的微粒的直径为约20 μ m至约 1000 μ m,优选直径为约100 μ m至约500 μ m,最优选直径为约200 μ m。
优选微粒基质的各个微粒应至少有I个粘附至其表面的细胞，优选多于I个细胞。 因此，每个微粒的直径应大于选定的细胞类型的伸展直径。例如，内皮细胞的伸展直径约为 18 μ m，为支持每个微粒上可以附着多于I个的内皮细胞，各微粒的直径应至少为20 μ m。
优诜培养管:在本文的某些实施方案中，将约50_60mg的Gelfoam微粒置于带有O.2 μ m过滤帽的单个50mL培养管(Evergreen公司，洛杉肌,加利福尼亚)中。为减少培养基更换期间损失的微粒数，可以对培养管进行改良，例如，在培养管的帽区或内部加入滤膜， 以预防微粒在去除培养基时被排出或其它非预期地去除；向培养管中加入能通过培养基但不能通过微粒的隔膜，以形成各部分间通过流体连通的分离的培养基部分和微粒部分；或者在培养管底部加入可以 在不扰乱颗粒的条件下打开并放出培养基的喷嘴。
细胞接种入可植入性材料:在细胞接种之前，向微粒中加入70%乙醇，然后用PBS 或HEPES冲洗数次。然后微粒在无抗生素EGM-2中，在约37° C、5%C02/95%空气的条件下再水合12至24小时。然后将约50-60mg微粒的等分试样从其再水合容器中取出，置于单个组织培养皿中。微粒等分试样以每mg微粒2X IO3至2X IO4个细胞的优选密度接种。将细胞-基质混合物吸上吸下数次，以形成均一的悬浮液。然后培养管在37° C、5%C02、90% 湿度的条件下定期搅拌孵育3-4小时，以促进细胞附着。随后向每管中加入另外9mL EGM-2 (最终培养基体积为10mL)，得到最终微粒体积比为约5mg微粒/mL培养基。
此后，每2-3天更换一次培养基，直至细胞达到铺满状态。在一个优选实施方案中，细胞优选传代6次，但可以使用传代次数更少或更多的细胞。
细胞生长曲线和铺满:分别在第3或4天、6或7天、9或10天及12或13天或者上述时间左右，取出可植入性可流动组合物样品进行细胞计数，评价细胞存活率，建立细胞生长曲线并分析，以评定细胞的生长特征，并确定是否达到近铺满、铺满或铺满后。含有猪主动脉内皮细胞移植物的可植入性可流动组合物的制剂，其代表性的生长曲线见图1。在该实施例中，可植入性材料的形式是微粒。通常地，本领域普通技术人员了解在早、中、晚时间点时可接受的细胞生长指标，例如在早期时间点(对于图1而言，约为第3-10天)观察到细胞数的增长，然后是近铺满相(对于图1而言，约为第10-13天)，接着是细胞达到铺满后细胞数的稳定期(对于图1而言，约为第13-15天)以及细胞铺满后细胞数的维持期(对于图1 而言，约为第15-17天)。对于本发明的目的，优选在稳定期内至少72小时的细胞群。
细胞计数通过将可植入性可流动组合物等分试样用O. 8mg/ml胶原蛋白酶在胰岛素-EDTA中的溶液(适用于Gelfoam微粒)，或者葡聚糖酶和胰岛素-EDTA的溶液(适用于 Cytodex-3微粒)完全分解来完成。测量已分解的可植入性可流动组合物的体积后，已知体积的细胞悬浮液用O. 4%台盼蓝稀释(细胞对苔盼蓝的比为4:1)，并用台盼蓝拒染法测定存活率。活细胞、失活细胞及总细胞用血细胞计数器计数。以活细胞数对培养的天数作图建立生长曲线。达到铺满后，细胞被运输，用于移植。
对于本发明的目的，将铺满定义为每mg生物相容性微粒中至少存在约8X IO3个细胞，优选每等分试样50-70mg微粒中存在总细胞数约7 X IO5至约IX IO6个，且其存活率优选至少约90%但不低于约80%。细胞存活率优选至少为约90%但不低于约80%。如果细胞在12 或13天后未铺满，则更换培养基，继续孵育一天。持续该过程，直至达到铺满，或者直至接种后约14天。如果经过程检查后确定细胞已铺满，则进行最后的培养基更换。最后的培养基更换用无酚红且无抗生素的EGM-2进行。培养基更换后，立即将培养管安上无菌塞密封帽用于运输。
功能性评价对于本文所述本发明的目的，可植入性可流动组合物在移植之前进一步对功能性标记进行测试。例如，在培养期间收集条件培养基，以确定由培养的内皮细胞产生的硫酸乙酰肝素、转化生长因子P1 (TGF-D、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和一氧化氮的水平。在某些优选实施方案中，当总细胞数为至少约2X IO3个细胞/cm3，优选至少约8 X IO3个细胞/cm3，且活细胞百分数为至少约80-90%，优选大于等于90%，最优选至少约90%时，可植入性可流动组合物可以用于本文所述目的。条件培养基中的硫酸乙酰肝素为至少约O. 5-1. O μ g/106个细胞/天，优选至少约1. O μ g/106个细胞/天。条件培养基中的TGF-β !为至少约200-300picog/ml/天,优选至少约300picog/ml/天；条件培养基中的 b-FGF 低于约 200picog/ml,优选不超过约 400picog/ml。
硫酸乙酰肝素的水平可采用常规二甲基亚甲基蓝-硫酸软骨素裂解酶ABC消化光度法进行定量。总硫酸化糖胺聚糖(GAG)水平用二甲基亚甲基蓝(DMB)染料结合法测定，该方法通过用收集培养基(collection media)稀释已知量的纯硫酸软骨素得到标准曲线,然后将未知样品与标准曲线进行比较。在加入DMB显色剂之前，将条件培养基的其它样品与硫酸软骨素裂解酶ABC混合，以分解软骨素和硫酸皮肤素。所有吸光值均在混有GAG标准品的DMB染料的最大吸收波长——一般为515-525nm左右测定。通过用条件培养基样品中的总硫酸化糖胺聚糖浓度减去软骨素和硫酸皮肤素的浓度，计算每IO6个细胞每天的硫酸乙酰肝素水平。硫酸软骨素裂解酶ABC的活性通过分解纯硫酸软骨素样品来确证。如果分解的纯硫酸软骨素低于100%，则适当校正条件培养基样品。硫酸乙酰肝素的水平还可以用单克隆抗体采用ELISA法进行定量。
TGF- β !和b-FGF的水平采用ELISA法，用单克隆抗体或多克隆抗体，优选多克隆抗体进行定量。收集培养基(collection media)对照同样用ELISA法进行定量，并适当校正样品在培养基对照中的TGF-β i和b-FGF水平。
—氧化氮(NO)水平用标准Griess反应法定量。一氧化氮的瞬变及挥发性使其不适合于大多数检测方法。然而，一氧化氮的两个稳定的降解产物——三氧化氮(NO3)和二氧化氮(NO2)可以用常规光度法检测。Griess反应法在硝酸还原酶存在下将三氧化氮经酶法转化为二氧化氮。二氧化氮以吸收约540nm范围处的可见光的有色偶氮染料产物的形式， 经比色法检测。系统中存在的一氧化氮的水平通过将所有三氧化氮转化为二氧化氮，测定未知样品中的二氧化氮总浓度，然后将得到的二氧化氮浓度与用已知量的三氧化氮转化为二氧化氮后产生的标准曲线进行比较。
前述优选抑制性表型用上述硫酸乙酰肝素、TGF- β pNO和/或b-FGF的定量分析， 以及下面的平滑肌细胞生长和血栓抑制率的体外定量分析进行评定。对于本发明的目的， 当一种或多种这些另外的体外分析证明，可植入性可流动组合物显示出优选的抑制性表型时，该可植入性可流动组合物可以准备用于移植。
为体外评价对平滑肌细胞生长的抑制，测定了与培养的内皮细胞相关的抑制值。 将猪或人主动脉平滑肌细胞稀疏接种于24孔组织培养板中的平滑肌细胞生长培养基中 (SmGM-2, Cambrex BioScience公司)。使细胞附着24小时。然后将该培养基用含有O. 2%FBS 的平滑肌细胞基础培养基(SmBM)替换，培养48-72小时，使细胞生长停滞。将铺满后内皮细胞培养物用SMC生长培养基按1:1稀释两次，制成条件培养基，并将其加至平滑肌细胞培养物中。每次试验均包括抑制平滑肌细胞生长的阳性对照，例如肝素。3-4天后，用Coulter 计数器对每份样品中的细胞数进行计数。通过比较临加入条件培养基之前和暴露于条件培养基及对照培养基(标准生长培养基，加入或不加入生长因子)下3-4天后的每孔平滑肌细胞数，确定条件培养基对平滑肌细胞增殖的作用。将与条件培养基样品相关的抑制值与阳性对照相关的抑制值进行比较。根据优选实施方案，如果条件培养基的抑制率达到肝素对照的抑制率的约20%，则认为该可植入性可流动组合物具有抑制性。
为体外评价对血栓的抑制率，测定了与培养的内皮细胞相关的硫酸乙酰肝素的水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性能。采用上文详细描述过的常规二甲基亚甲基蓝-硫酸软骨素裂解酶ABC光度法或ELISA法，计算每IO6个细胞的硫酸乙酰肝素浓度。当条件培养基中的硫酸乙酰肝素为至少约0. 5-1. 0mg/ 106个细胞/天，优选至少约1. 0mg/106 个细胞/天时，该可植入性可流动组合物可以用于本文所述目的。
另一个评价血栓抑制率的方法包括在体外测定对与富血小板血浆相关的血小板聚集的抑制值。在室温下向猪血液样品中加入柠檬酸钠，得到猪血浆。柠檬酸钠血浆在温和转速下离心，以使红细胞和白细胞成团，留下血小板悬浮在血浆中。用铺满后内皮细胞培养物制备条件培养基，并加至富血小板血浆等分试样中。向血浆中加入血小板聚集剂(激动剂)作为对照。血小板激动剂一般包括花生四烯酸(arachidonate)、ADP、胶原蛋白、肾上腺素、瑞斯西丁素(ristocetin,可获自Sigma-Aldrich Co.公司，圣路易，密苏里州)。另一份未加入血小板激动剂或条件培养基的血浆等分试样用来测定基线自发血小板聚集。每次试验还包括抑制血小板聚集的阳性对照。例示性的阳性对照包括阿司匹林、肝素、abciximab (ReoPrO , Eli Lilly公司，印第安纳波利斯，印第安纳州)、替罗非班(Aggrastat*，Merck&Co.，Inc.公司，Whitehouse Station,新泽西州)或埃替非巴肽 Untegrilin1S Mi llennium Pharmaceuticals, Inc.公司，剑桥,麻萨诸塞州)。然后用聚集仪测量所有测试条件下得到的血小板聚集。聚集仪通过监测光密度来测量血小板聚集。当血小板聚集，则有更多光线可以通过样品。聚集仪报道的结果以血小板聚集速率的函数“血小板聚集单位”表示。加入激动剂后6分钟时测定最大聚集。通过比较富血小板血浆在加入条件培养基之前的基线血小板聚集和暴露于条件培养基之后及阳性对照的血小板聚集， 确定条件培养基对血小板聚集的作用。结果以基线的百分数表示。将与条件培养基样品相关的抑制值与阳性对照相关的抑制值进行比较。根据优选实施方案，当条件培养基的抑制率为阳性对照的抑制率的约20%时，则可认为该可植入性可流动组合物具有抑制性。
运输容器培养基更换后，立即将可植入性可流动组合物包装以用于运输。根据一个实施方案，在可植入性材料上培养细胞时使用的同一培养管被安上无菌塞密封帽用于运输。为降低在最后的冲洗期间微粒和/或细胞倾析的风险，可以对运输容器进行改良以使其包括，例如，具有能通过培养基和冲洗溶液，但不能倾析出颗粒和/或细胞的孔径的过滤器或其它捕获装置。
如果可植入性可流动组合物在含血清培养基中运输，则在临移植前冲洗可植入性可流动组合物，优选在培养管内冲洗。然后从运输容器中除去过滤器或其它捕获装置，将细胞移植微粒吸入注射器中用于递送。排出注射器中多余的冲洗溶液，将针、导管或其它递送装置连接至注射器，用于向治疗部位的递送。然后根据例如下文所述例示性给药方法中的一种，将可流动组合物递送至患者。如果可植入性可流动组合物在无血清培养基中运输，则在临床场所无需进行最后的冲洗程序。
根据另一个备选的实施方案，将可植入性可流动组合物从培养管吸至注射器中， 加入l-20ml培养基，或足够体积的培养基一起运输和贮藏，给注射器加帽密封，在密封的注射器中运输该材料。在植入部位，多余的培养基从注射器中排出。然后将针、导管或其它递送装置连·接至注射器，用于向治疗部位的递送。根据该实施方案，可流动组合物直接从运输注射器中递送至患者。
本发明的可植入性组合物可在最终产物容器中供应，包括例如经滤帽改良的50ml 或60ml密封组织培养容器或预载注射器，所述最终产物容器均优选含有约50-60mg微粒材料，在每等份约45-60ml，优选约50ml的内皮细胞生长培养基中植入的内皮细胞总数为约 7 X IO5至约I X IO6个。每个患者接受的总细胞数优选为约0. 6 X 104-12 X IO4个细胞/kg体重,但不小于2 X IO3个细胞/kg体重并不大于2 X IO5个细胞/kg体重。
如本文预期的那样，本发明的材料包括细胞，优选血管内皮细胞；在一个优选的实施方案中，所述细胞优选存活率为约90%，优选密度为约1.4X104-2.1 X IO4个细胞/mg微粒；当铺满或近铺满时，所述细胞产生的条件培养基所包含的肝素为至少约O. 5-1. 0mg/106 个细胞/天，优选至少约1.0mg/106个细胞/天。条件培养基中的TGF-P1为至少约 200-300picog/ml/天，优选至少约300picog/ml/天；条件培养基中的b_FGF低于约 200picog/ml,优选不大于约 400picog/ml。
根据另一个实施方案，在给药之前向可流动组合物中加入一种或多种另外的物质。这些物质包括但不限于抗炎剂、糖胺聚糖、前列腺素、前列腺素类、细胞因子包括但不限于TGF和VEGF、血管紧张素及相关化合物、酪氨酸激酶抑制剂、免疫抑制剂、维生素、糖皮质激素、抗氧化剂、自由基清除剂、肽类激素、血管生成因子及血管生成抑制因子。
载述:根据一个实施方案，可植入性可流动组合物可任选包括载体流体。优选的载体流体是使给药更加方便的细胞生长培养基。实验室模拟的可植入性可流动组合物的给药显示，载体不是处理可流动组合物时保持细胞完整性的必要条件。意外的是，如本文所述的细胞制剂中可以没有载体或其它通常用来保护细胞完整性的试剂，或通常用来改善处理和减少由剪切力导致的非固体或可流动制剂分裂的试剂。
然而，载体可以在例如，细胞培养期间，包括排出条件培养基，导入新的培养基时， 在运输前处理可植入性可流动组合物，将该材料吸入递送用注射器时，和/或将该材料从注射器中排出并将该材料递送至血管周隙或其它靶部位时，用于提高细胞在可流动组合物中的流动性和存活率。
载体可以在细胞培养程序的不同时间点导入可植入性材料中。例如，在细胞培养程序中，载体可以在微粒水合(细胞接种前)时、即将进行细胞接种前或在进行细胞接种时加入微粒基质，和/或在预定的培养基更换时以增量方式加入。通过在细胞培养早期引入载体，可以将那些可能受到不良影响的细胞弃去，剩下的细胞可以增殖以维持足够的细胞群。
此外，载体可以在细胞达到铺满或近铺满，进行最后的培养基更换时，及即将进行移植前引入。然而，观察到在临给药之前加入未稀释的甘油载体可能导致细胞休克，从而使细胞完全窒息而降低预期的细胞存活率和低于可接受水平的效能。基于这些观察结果，向可流动组合物中一次性全部加入高粘性载体流体如甘油有可能对细胞产生不良影响,并且应该避免。
为评价其它候选载体流体的功效，采用高微粒对载体比进行初步试验，以测定达到预期效果时所需载体的最小量。评价的预期效果包括，例如改善处理和提`高组合物的流动性并维持细胞的存活率和效力。此外，还进行研究以测试在不影响细胞存活率或功能的条件下将平面型的可植入性组合物转化为可植入微粒型可流动组合物的能力(参见共同待决的申请PCT/US_，也称作ELV-002PC，其全部内容引入本文作为参考)。例如，最初的测试溶液中，50mg微粒仅含有约O. 1-1%的载体溶液。该浓度以增量方式增加至最大值为 50mg微粒中含约10%的载体。
随后进行的试验中，载体流体从微粒水合或细胞接种时开始，在整个培养过程中增量式地加入，这样就使得当可植入性可流动组合物中的细胞达到铺满并准备运输和/或施予患者时，可植入性材料中的载体流体的浓度已经从早期细胞附着时可接受的载体流体对微粒的较低比例增加到了较高的理想比例。例如，根据例示性方案，在初始水合和随后的每次培养基更换时，将O. 1%的载体溶液加入到微粒材料中，直到获得最终浓度为1%的载体溶液。我们认为，虽然在每次引入载体流体时都会有一些细胞流失，但大多数细胞却混入经载体处理的可植入性可流动组合物中，并能在该环境下生长至铺满或近铺满。
载体包括但不限于稀甘油、藻酸盐(优选约1%的藻酸盐溶液)、葡聚糖或右旋糖(优选约1-10%的葡聚糖或右旋糖溶液)、其它糖包括例如葡萄糖、蔗糖和果糖、淀粉(优选约6% 的羟乙基淀粉溶液)、明胶(优选约1-2%的明胶溶液)、内皮细胞生长培养基、内皮细胞基础培养基、其它细胞生长培养基或中性缓冲盐。其它本文未详细说明的溶液百分比范围也包括在内。载体的改变部分依赖于所用生物相容性基质的类型、移植到材料上的细胞类型以及为递送选定的给药模式。例如，用于初始水合和随后的培养基更换的细胞培养基，根据选定的载体可以包括以体积计约O. 5%至约10%的载体流体。通常地，选定的载体应该在所用剂量和浓度下无细胞毒性，并且具有充分的通透性，以允许空气和营养物质流入(以支持细胞生长)和流出(以排出细胞废产物)可植入性组合物。
未稀释的甘油载体对细胞存活率的影响猪主动脉内皮细胞接种于lOOmg Gelfoam微粒上，并增殖至铺满。收集微粒型可流动组合物，并将其置于50ml试管中与3ml 未稀释的甘油等分试样混合，然后将其置于连接有24、26或27号针的注射器中。所有注射器中的内容物通过连接的针缓慢排出，收集于50ml试管中。所有活细胞中仅有0-5%的细胞在排出后存活(95-100%的细胞死亡)，与未加入甘油的相同试验具有86-93%的细胞存活率相比，显然表明了该载体流体在未稀释的情况下作为单剂量向铺满细胞加入时对细胞存活率的有害影响。目前尚未确定使用该载体流体是否有利于维持细胞单层的铺满。
平面型材料的挤压和修饰:根据另一个实施方案，在细胞已完全移植入可植入性组合物并达到铺满后，对固体、半固体或大直径组合物进行修饰，以形成能通过注射用递送装置递送的微粒。根据一个实施方案，细胞如上文详细描述的那样在载体流体存在下培养， 以维持材料修饰期间细胞的铺满和完整性。
根据修饰方法的一个实施方案，一旦细胞在平面型可植入性组合物上达到铺满， 则将组合物转移至注射器。为适应该平面形式，注射器可以不带针或者带有大孔针。注射器将弹性平面形式吸上来，然后，在压力下，植入细胞的组合物通过注射器口排出，形成非平面的可流动组合物。为了获得优选粒径，可能需要多次从注射器中通过。例如，材料可以先通过没有针的注射器，然后通过大孔针，接着通过更小孔的针，直至材料达到预期的粒径和流动性。多次通过和对粒径的增量修饰可以有利地减少在这样的材料修饰期间对细胞的伤害量，并保持细胞的铺满度。
手术密封剂在某些其它实施方案中，本发明的可流动组合物通常还可以另外尤其作为吻合口密封剂，或者外科密封剂。在这样一个双重目的的实施方案中，当与管状结构的外表面接触，或者以弧形应用于外表面，或者沿圆周方向使用时，组合物还可以有效密封两个或多个管状结构的接合点，或者密封管状结构中的孔洞。这样的密封剂可以消除进行缝合的需要，所述缝合可例如进一步损害血管组织并促使腔内皮损伤。这样的密封剂还可以在吻合口附近提供额外的稳定性，从而增强任何缝合修补的效果。所有必需的条件是，该双重目的组合物的密封型功能或特性不干扰或削弱细胞的预期表型及该组合物的基于细胞的功能性的同时表 达。
对于某些密封剂实施方案的目的，可流动组合物包括生物相容性底物，该底物自身包括具有密封剂特性，同时还具有支撑内皮或内皮样细胞群所需要的特性的成分，例如但不限于纤维蛋白网。同样地，生物相容性底物本身可以同时具有密封剂特性和支撑细胞群所需要的特性。在其它实施方案的情况下，密封剂的功能性可以至少部分地由细胞提供。 例如，预期与组合物结合的细胞产生能修饰底物的物质，从而使底物获得密封剂特性，同时还显示/维持其必需的细胞功能性。某些细胞可以自然产生该类物质，而其它细胞可以通过改造后产生该类物质。
可植入性可流动组合物的保存期:包括铺满、近铺满或铺满后细胞群的可植入性可流动组合物可以在室温下维持稳定和存活状态至少两周。这类可植入性可流动组合物优选在约45-60ml，更优选约50ml的含有或不含额外的FBS的运输培养基中保存。运输培养基包括不含酚红的EGM-2培养基。运输培养基中可以加入FBS，直至达到FBS以体积计约为 10%，或者FBS总浓度为约12%。然而，由于在移植之前，FBS必须从可植入性可流动组合物中去除，因此优选限制运输培养基中使用的FBS的量，以减少移植前需要的冲洗时间。
可植入性可流动组合物的冷冻保存:包括铺满、近铺满或铺满后细胞群的可植入性可流动组合物可以冷冻保存以贮藏和/或运输至临床机构，而在最后的解冻后不减小其临床效力或完整性。可植入性可流动组合物优选在15ml冷冻管(Malgene'Nalge Nunc Int' I公司，罗切斯特，纽约州)中，在含有约5ml CryoStor CS-10溶液(BioLifeSolutions 公司，Oswego，纽约州)、约10%DMS0、约2_8%葡聚糖和约50_75%FBS的溶液中冷冻保存。将冷冻管置于冷异丙醇水浴，转移至_80°C冰箱中4小时，然后转移至液氮(-150至-165°C) 中。
然后将冷冻保存的可植入性可流动组合物的等分试样在室温下缓慢解冻约15min，接着在室温水浴中再解冻约15分钟。然后将材料用约15ml洗涤用培养基 (washmedia)洗漆约3次。洗漆用培养基包括含或不含50 μ g/ml庆大霉素的无酹红EBM。 最初两次冲洗程序在室温下进行约5分钟。最后一次冲洗程序在37° C、5%C02下进行约30 分钟。
在解冻和冲洗程序之后，使冷冻保存的材料在约IOml的恢复液中休眠约48小时。 对于猪内皮细胞，恢复液是37°C下在5%C02中的加有5%FBS和50 μ g/ml庆大霉素的EBM-2。 对于人内皮细胞，恢复液是无抗生素EGM-2。进一步的解冻后调节可以在使用和/或包装用于贮藏或运输之前进行至少另外的24小时。
在递送装置中的装载和摄取:如上文详细描述的那样，可流动组合物的等分试样在培养管或注射器中，在约45-60ml,优选约50ml的含或不含血清的运输培养基中包装和运输，在不更换培养基的条件下支持细胞达14天。移植之前，倾析出多余的培养基，并且， 如果运输培养基中存在血清，则将可植入性可流 动组合物漂洗数次，以除去所有残留的血清。由于某些可植入性可流动组合物的微粒形式的制剂易于分散，并因此失去细胞铺满状态，所以，在最后的冲洗程序中，该组合物应保留在运输容器内。此外，对运输容器的改良优选能在操作中维持可植入性可流动组合物的完整性的改良，所述改良包括但不限于过滤器和/或单独的培养隔间。
在冲洗可植入性可流动组合物数次之后，保留约l_3ml的冲洗液在可植入性可流动组合物的顶部，以有利于将该材料摄取至递送装置例如注射器中。然后操作递送装置，将可植入性可流动组合物吸入递送装置中，操作时尽量小心，使铺满细胞层的破坏最小化。根据另一个实施方案，使用材料的装载装置，例如在运输容器开口和递送用注射器之间的漏斗形接口，使材料在转移至递送装置的过程中细胞破碎减少。在材料转移至递送装置之后， 从递送装置中排出部分剩余液体约1ml，以准备好递送装置，填满空隙体积。在递送至患者的可植入性可流动组合物中大约剩有0_2ml的冲洗液。现在准备将可植入性可流动组合物递送至治疗部位。
通过针:为证明本发明的实用性，一个优选微粒型可植入性可流动组合物(植入 Gelfoam微粒的HAE)通过了 22号针孔(内径=O. 016英寸)。此外，其它优选组合物(植入 Gelfoam微粒的PAE)能通过的针孔的针的范围是约21号针(内径=O. 019英寸)至28号针(内径=O. 007英寸)。
如下表I所示，本发明的实施方案可以在对通过针的细胞的细胞数、存活率或功能性无不良影响的条件下，通过内径在这些范围内的针。令人意外的是，细胞制剂可以在不影响或损害铺满状态或功能性的条件下摄取并从范围为21号(内径=O. 019英寸)至30号 (内径=O. 006英寸)，优选24号(内径=O. 012英寸)的针孔中流出。同样令人意外的是， 细胞在通过针之后，仅以细胞生长培养基作为载体流体的条件下表现非常好。
如下文所述，细胞与微粒基质混合，并增殖至铺满。铺满后3天，将得到的可流动组合物通过内径范围为约O. 007英寸至约O. 018英寸的无菌针，收集，在内皮细胞生长培养基-2 (EGM-2)中恢复48小时。恢复期过后，使培养基条件化24小时。然后对通过后细胞的条件培养基进行评价。对通过后的条件培养基评价其产物碱性成纤维细胞生长因子 (b-FGF)、硫酸乙酰肝素(HS)和转化生长因子P1 (TGF-P1)的可接受的水平。此外，进行平滑肌细胞试验以显示培养基对平滑肌细胞增殖的抑制作用。将通过针的组合物的实验结果与没有通过针的样品进行比较。
表I
通讨22号针
权利要求
1.用于治疗管状解剖学结构内腔上的受损或患病部位的可流动性组合物，其中所述可 流动性组合物包括生物相容性基质和细胞，并且其中所述可流动性组合物以有效治疗所述 受损或患病部位的量通过经皮注射递送至所述受损或患病部位或与该部位相邻或在该部 位附近的腔外表面。
2.权利要求1的可流动性组合物，其中所述细胞具有内皮样表型。
3.权利要求1的可流动性组合物，其中所述细胞是两种或更多种选自下述细胞的共培 养物内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞和心肌细胞。
4.权利要求1的可流动性组合物，其中的可流动性组合物是保持形状的。
5.权利要求1的可流动性组合物，其中的生物相容性基质包括微粒或微载体。
6.权利要求5的可流动性组合物，其中的微粒或微载体进一步包括明胶、胶原蛋白、纤 连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或附着肽。
7.权利要求6的可流动性组合物，其中的附着肽包括序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD)的肽。
8.权利要求5的可流动性组合物，其中的微粒或微载体的直径为约20微米至约500微米。
9 权利要求5的可流动性组合物，其中的微粒或微载体的直径为约200微米。
10.权利要求1的可流动性组合物，其进一步包括选自下述的适当载体流体藻酸盐、 糖溶液、淀粉溶液、明胶、内皮细胞生长培养基、内皮细胞基础培养基、细胞生长培养基、其 它生长培养基或中性缓冲盐。
11.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减少受损或患病部位的平滑肌细 胞的增殖。
12.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减轻受损或患病部位的闭塞性血栓。
13.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减少受损或患病部位的内膜增生。
14.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减轻受损或患病部位的狭窄或再狭窄。
15.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减轻受损或患病部位的急性炎症。
16.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减轻受损或患病部位的慢性炎症。
17.权利要求1的可流动性组合物，其中所述有效量减轻受损或患病部位的血管舒张或血管痉挛。
18.权利要求1的可流动性组合物，其中所述管状解剖学结构是血管。
19.生物相容性基质和细胞在制备治疗管状解剖学结构内腔上的受损或患病部位的可 流动性组合物中的应用，其中所述可流动性组合物将通过经皮注射被递送至所述管状解剖 学结构的受损或患病部位或与该部位相邻或在该部位附近的所述管状解剖结构的腔外表 面并且与所述述管状解剖结构的腔外表面接触，并且其中所述可流动性组合物的量是有效 治疗受损或患病部位的量。
20.权利要求19的应用，其中通过穿过或透过所述管状解剖学结构的内壁，将可流动 性组合物沉积在所述受损或患病部位或与该部位相邻或在该部位附近处的所述管状解剖 学结构的外表面上。
21.权利要求20的应用，其中将鉴定所述可流动性组合物在所述管状解剖学结构的外 表面上沉积的部位。
22.权利要求21的应用，其中在所述穿过或透过所述管状解剖学结构的内壁之前，或 者与穿过或透过所述管状解剖学结构的内壁同时鉴定所述可流动性组合物的沉积部位。
23.权利要求21的应用，其中通过成像鉴定所述部位。
24.权利要求21的应用，其中通过触诊鉴定所述部位。
25.权利要求19的应用，其中通过经皮给药进入血管周隙，将可流动性组合物沉积在 受损或患病部位或与该部位相邻或在该部位附近的所述管状解剖学结构的外表面上。
26.权利要求25的应用，其中鉴定可流动性组合物沉积在所述管状解剖学结构的外表 面的部位。
27.权利要求26的应用，其中在经皮给药进入血管周隙之前或者同时，鉴定可流动性 组合物的沉积部位。
28.权利要求26的应用，其中通过成像鉴定所述部位。
29.权利要求26的应用，其中通过触诊鉴定所述部位。
30.权利要求19的应用，其中所述管状解剖学结构的外表面是非腔表面。
31.权利要求19的应用，其中所述管状解剖学结构的外表面占据血管周隙。
32.权利要求19的应用，其中所述管状解剖学结构是血管。
33.权利要求32的应用，其中所述血管包括支架。
34.权利要求33的应用，其中所述受损或患病部位在所述支架附近。
35.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减少受损或患病部位的平 滑肌细胞的增殖。
36.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的闭塞性血栓。
37.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的内膜增生。
38.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的狭窄或再狭窄。
39.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的急 性炎症。
40.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的慢 性炎症。
41.权利要求19的应用，其中所述可流动性组合物的有效量减轻受损或患病部位的血 管舒张或血管痉挛。
42.权利要求19的应用，其中所述管状解剖学结构选自泪管、气管、支气管、细支气 管、鼻道、鼻窦、气道、咽鼓管、外耳道、口腔、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、胆道、输尿管、 膀胱、尿道、输卵管、子宫、阴道及其它女性生殖道的通道和输精管及其它男性生殖道的通 道。
43.权利要求1的可流动性组合物，其中所述细胞选自铺满的细胞群；接近铺满的细 胞群；铺满后的细胞群；以及具有前述表型的任一种的细胞群。
44.权利要求1的可流动性组合物，其中所述组合物是通过最小侵入性闭合性手术方法递送的。
45.权利要求1的可流动性组合物，其中所述组合物是通过穿过或透过所述管状解剖学结构的内壁递送的。
46.权利要求1的可流动性组合物，其中所述管状解剖学结构是天然结构或手术产生的吻合口。
47.用于治疗管状解剖学结构内腔的受损或患病部位的可流动性组合物，其中所述可流动性组合物包括生物相容性基质、细胞以及合适的载体流体，并且所述可流动性组合物的量是有效治疗受损或患病部位的量。
48.权利要求47的可流动性组合物，其中所述载体流体选自藻酸盐、糖溶液、淀粉溶液、明胶、内皮细胞生长培养基、内皮细胞基础培养基、其它细胞生长介质或中性缓冲盐。
49.权利要求1、19和47所述的可流动性组合物，其中所述细胞是非内皮细胞，所述非内皮细胞为源自血管或非血管组织或器官而在功能上如同内皮细胞或具有内皮细胞样表型的同种异体、异种或自体细胞。
50.权利要求1、19和47所述的可流动性组合物，其中所述细胞被基因改造、基因修饰或基因工程化以在功能上如同内皮细 胞或具有内皮细胞样表型。
51.权利要求1、19和47所述的可流动性组合物，其中所述细胞当与生物相容性基质联合时显示一种或多种优选的易鉴定表型或功能特性，其可以促进、修复和/或以其它方式调节与治疗受损或患病靶血管内皮或另一管状解剖学结构的受损或患病靶腔相关的内皮细胞生理和/或腔内环境稳定。
52.权利要求51所述的可流动性组合物，其中由所述细胞所显示的优选的易鉴定表型是抑制或以其它方式干扰平滑肌细胞增殖的能力。
53.权利要求51所述的可流动性组合物，其中由所述细胞所显示的优选的易鉴定表型是它们抗血栓或能抑制血小板粘附和聚集。
54.权利要求1、19和47所述的可流动性组合物，其中所述细胞不需要显示一种以上优选的易鉴定表型。
55.权利要求1、19和47所述的可流动性组合物，其中所述细胞显示一种以上优选的易鉴定表型。
56.权利要求2、19和47所述的可流动性组合物，其中所述表型是抑制性表型。
全文摘要
本发明为含细胞的可流动组合物的最小侵入性给药的材料和方法。本发明的公开基于这样的发现基于细胞的疗法可以用于治疗、缓解、控制和/或减少与血管介入或心血管疾病相关的临床后遗症，尤其是闭塞性血栓症、再狭窄、内膜增生、炎症和血管舒张的进展。本发明进一步受益于另一发现，即，迄今为止尚未记载的可植入性可流动性组合物能提供铺满的活力充足的细胞群，其可以通过最小侵入性手术方法有效给药而不降低临床效果或细胞的存活率。本公开的发明可以用于治疗血管结构和非血管管状结构如输卵管。
文档编号A61L27/38GK103055350SQ201210448869
公开日2013年4月24日 申请日期2005年12月6日 优先权日2004年12月8日
发明者海伦·玛丽·纽金特, 埃拉泽尔·埃德尔曼, 史蒂夫·博林格 申请人:夏尔再生医学公司