专利名称：用于治疗创伤性脑损伤的组合物和方法
用于治疗创伤性脑损伤的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月10日提交的、发明名称为“Compositions and MethodsforTreating Neural Injuries”的美国临时申请第61/558，171号的权益,其全部内容通过引用并入本文。技术领域
本申请一般性涉及用于在创伤性脑损伤后减轻皮质损伤和促进功能恢复的方法，尤其是利用能够通过抑制NMDA受体磷酸化而降低坏死性神经细胞死亡的药剂的方法。
背景技术：
在美国，每年发生150万级别从轻微到严重不等的创伤性脑损伤(traumaticbrain injury, TBI)事件[1，2]。该数目是多发性硬化、脊髓损伤、AIDS和乳腺癌案例总数的6倍。此外，据估计，伊拉克和阿富汗战争中有300，000以上的美国退伍军人由于受到战时爆炸物冲击而患有长期TBI [3，4]。TBI是一种严重的公共健康问题。令人遗憾的是，很少措施可以用来反转由创伤所引起的初始脑损伤。由于严重受损并且可利用的治疗方法有限，TBI是儿童和年轻人的主要死亡原因之一 [5-10]，而幸存者也患有运动性残疾、认知缺损[7，8，11，12]和癫痫症[13-17]等后遗症。
TBI的神经、经济和社会后果对于患者、患者家庭和整个社会而言都是破坏性的[1，2，6，18]。据估计，在美国仅在2000年TBI的成本就高达6千万美元[1，2]。Bilmes和Stiglitz (2006)估计，伊拉克战争给政府所带来的脑损伤治疗成本在2015年将达到一千四百万美兀(Bilmes L, Stiglitz, J.The economic costs of the Iraq war:anappraisal three years after thebeginning of the conflict.Cambridge,MA:NationalBureau of Economic research ;2006.)。据不完全统计,在中国因卢页脑损伤致残者累计有150-200万，每年新增8-10万；每年有20万人因伤致死。在全部死亡者中约60%-80%是因颅脑损伤致死，17%因颅脑损伤致残。脊髓伤致残者累计有50-60万，每年新增23万，由此造成的医疗消耗高达2000-3000亿元/年。这些统计数据表明，对于提高创伤后功能恢复的有效治疗方法存在迫切的需求。
在过去的20年来，我们在分子和细胞水平上对创伤性脑损伤有很多的了解和认识。通常，当外力(诸如撞击、击打头部)或穿透性脑损伤后，仅导致少量神经细胞死亡及神经纤维断裂。这些初始的神经损伤相对`并不严重[19-21]。但是因于初始神经损伤导致的级联效应所引起的继发损伤严重地加重了初级损伤[22]，导致大量的神经细胞死亡及退行性病变。它们是大多数创伤后神经细胞损伤的主要原因。神经细胞死亡及退行性病变以及导致的神经网络破坏是导致认知、感觉和运动功能失调等神经功能缺损的主要原因[20，21,23-25] 0人类大脑和脊髓组成的中枢神经系统(CNS)缺乏自我再生和修复能力一直是长期困扰神经科学界的一大难题。然而，从最近的研究中获得大量关于继发性损伤过程中的生化及分子机理。这些丰富的知识为有效地治疗继发性损伤提供了很大的希望。
继发损伤涉及的早期因素主要是谷氨酸的过多释放。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统(CNS)的主要兴奋性神经递质。在哺乳动物脑中介导大多数兴奋性突触的快速突触传递[26]。由于对精准突触传递的需要，谷氨酸在大脑里的浓度得到非常精确的调控。它主要存在于细胞内，在细胞间隙的浓度非常低。它在中枢神经系统的受体主要是N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体。NMDA受体有两个亚型:2A亚型(NR2A)和2B亚型(NR2B) [27-29]。NR2A主要存在于突触(Synapse)。在兴奋性突触传递中起着主要作用。NR2B—般存在于突触外的细胞膜。在正常情况下，由于细胞间隙谷氨酸的浓度非常低，NR2B —般没有被激活。然而初始神经损伤导致大量的谷氨酸从受伤或死亡的细胞中释放到细胞间隙，使细胞间隙中的谷氨酸浓度急剧升高。谷氨酸的病理性释放可过度刺激谷氨酸受体NR2B。NR2B受体是一种钙渗透性离子型谷氨酸受体的亚类，在病理学病症诸如脑外伤期间，NR2B受体被胞外合氨酸浓度不受控制的增加而过度活化，引起大量的钙离子流入细胞，继而导致神经元过度兴奋性死亡[30]。NR2B亚型所介导的兴奋性死亡被认为是创伤性脑损伤后神经元死亡的主要原因[31-36]。尽管对创伤性脑损伤的治疗已经集中在采用谷氨酸拮抗剂或钙阻断剂来抑制谷氨酸所介导的兴奋性死亡，但这些化合物的临床试验仅取得有限的成功。在很大程度上，这些治疗的失败可能是由于创伤性脑损伤后只有非常短的治疗时间窗口，或者是所用的化合物难以跨越血脑屏障(BBB)进入大脑。因此，我们寻找新的神经保护药物用于治疗创伤性脑损伤时，关键是能有效而且选择性地阻断NMDA受体2B亚型的过度兴奋，但是不影响NMDA受体2A亚型正常的神经传递的功能。把副作用尽量减少到最低。它可以方便给药，而且可以越过血脑屏障到大脑去发挥神经保护的功能。
发明概述
在一个实施方案中，本申请提供治疗创伤性脑损伤对象的方法，所述方法包括步骤:向对象施用治疗有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。
在一个实施方案中，本申请提供抑制创伤性脑损伤后神经细胞损伤的方法，包括将至少一个细胞暴露于有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。
在一个方面中，将至少一个神经细胞暴露于有效量的本发明的肽或向对象施用有效量的本发明的肽的步骤在遭受创伤性脑损伤后一段短的时间内进行。在一个示例性实施方式中，肽的施用在创伤性脑损伤后一周内，优选72小时、更优选48小时、仍更优选24小时或更少，例如，18、12、8、6、4、2或I小时内。
在一个实施方案中，本申请提供了有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽在制备用于在创伤性脑损伤后抑制神经细胞损伤的药物中的用途。
在另一个实施方案中，本申请提供了有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽在制备用于在创伤性脑损伤后治疗对象的药物中的用途。优选地，所述对象是哺乳动物，优选人。
在另一个实施方案中，本申请提供了用于在创伤性脑损伤后治疗神经损伤的组合物，所述组合物包含本发明的肽和药学上可接受的载体。
在一个方面，本发明的肽的治疗有效量在0.1-lOOOmg/kg体重的范围内，优选l-100mg/kg 体重 、更优选 10-50mg/kg 体重。
在一个方面中，本发明的肽能够解偶联NR2B与死亡相关蛋白激酶(DAPKl)的结合。在一个方面中，本发明的肽通过结合DAPKl而抑制NR2B磷酸化。
在一个方面中，本发明的肽可包含SEQ ID NO:1SEQ ID NO:1或其功能等效变体，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除。本发明的肽可选自与SEQ ID NO:I具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的序列。
在一个方面中，本发明的肽可在其N端或C端进一步包含信号肽。优选地，信号肽选自TAT序列、MAP序列、MTS序列或R9序列。在一个方面中，本发明的肽可被化学修饰。
附图描述
图1.TNR10118 解偶联 TBI 诱导的 DAPKl 募集至 NMDA 受体 2B (NR2B)。
(a)显示小鼠脑中受控皮层损伤(CCI)的示意图。(b)结晶紫染色显示在中等水平冲击的CCI之后24小时的皮层病区。(C)在中等创伤性脑损伤24小时之后，死亡相关蛋白激酶I (DAPK1 ;绿色)的活化和含2B亚基的NMDA受体(NR2B ;红色)的磷酸化以及在皮层中细胞表面募集。(d)分开的通道，以更好地揭示在图C4中所示的细胞表面上激活的DAPKl (绿色)和NR2B的磷酸化(红色)。(e)检测在TBI 24小时之后脑中磷酸化NR2B的蛋白质印迹。(f)共免疫沉淀反应揭示在损伤后DAPKl结合于NR2B。TNRlOl 18治疗在TBI后在脑中阻断了 DAPK和NR2B之间的生化结合。(g)TNR10118治疗在TBI之后在脑中减少了 NR2B磷酸化。
图2.TNRlOl 18治疗在体外减少了谷氨酸/甘氨酸诱导的钙流入神经元。
(a)检测谷氨酸/甘氨酸刺激后海马神经元中钙指示物“Fluo-4”的延时成像。神经元用赋形剂、乱序肽(IOy m/1)或TNR10118(10 y m/1)处理。(b)定量评价在谷氨酸/甘氨酸刺激后不同时间细胞中的Fluo-4强度。
图3.TNR10118治疗保护神经元免受谷氨酸/甘氨酸刺激诱导的兴奋性中毒影响。
(a)评价TNRlOl 18对谷氨酸/甘氨酸兴奋性中毒的神经保护作用的实验步骤。(b)用赋形剂处理的海马粒状神经元的明视野成像。(C)碘化丙啶(PI)染色，揭示用赋形剂治疗的海马粒状神经元的死细胞。(d) (b)和(C)的合并图像。(e)在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗的海马粒状神经元的明视野成像。(f)碘化丙啶(PI)染色，揭示在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用PBS治疗的海马粒状神经元的死细胞。(g) (e)和⑴的合并图像。(h)在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用乱序肽治疗的海马粒状神经元的明视野成像。(i)碘化丙啶(PD染色，揭示在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用乱序肽治疗的海马粒状神经元的死细胞。(j) (h)和(i)的合并图像。(k)在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用TNR10118治疗的海马粒状神经元的明视野成像。(I)PI染色，揭示在谷氨酸和甘氨酸刺激之后用TNR10118治疗的海马粒状神经元的死细胞。(m) (k)和⑴的合并图像。(n)定量。
图4.TNRlOl 18治疗减轻创伤性脑损伤后的皮质损伤。
(a)H&E染色，显示赋形剂治疗24小时后具有外伤性脑损伤(TBI损伤)的大脑。(b)H&E染色，显示乱序肽治疗24小时后的TBI损伤大脑。(c)H&E染色，显示在TNR10118治疗24小时后的TBI损伤大脑。(d)定量结果，显示在乱序肽或TNRlO118治疗大脑中的皮层创伤体积。
图5.TNR10118治疗显著地减少创伤性脑损伤后大脑皮层中的细胞死亡。
(a) Flu oro-Jade (FJB)染色，检测乱序肽治疗后具有创伤性脑损伤(TBI损伤)的大脑中的退行性细胞。(b)FJB-染色，检测在TNRlOl 18治疗后TBI损伤大脑中的退行性细胞。(c)-(d) (a)中白框中的组织的放大图。(e)-(f) (b)中白框中的组织的放大图。(g)评价组织创伤外侧缘和内侧边缘的细胞死亡。(h)来自创伤边缘的FJB-阳性细胞的分布。(i)TNR10118治疗小鼠和对照小鼠中的FJB-阳性细胞密度。
图6.TNR-10118治疗显著地预防创伤性脑损伤后海马齿状回中的细胞死亡。
(a) Fluoro-Jade (FJB)染色，检测乱序肽治疗后创伤性脑损伤(TBI损伤)大脑的海马齿状回中的退行性细胞。(b) Fluoro-Jade (FJB)染色，检测TNRlOl 18治疗后TBI损伤大脑的海马齿状回中的退行性细胞。(c) (a)中白框中的组织的放大图。(d)(b)中白框中的组织的放大图。(e)定量显示在乱序肽或TNR10118治疗后TBI损伤大脑的海马齿状回中的FJB-阳性细胞。
图7.TNR-10118治疗显著保护创伤性脑损伤后海马CAl区中神经元免于死亡。
(a) Fluoro-Jade (FJB)染色，检测乱序肽治疗后创伤性脑损伤(TBI损伤)大脑的CAl区中的退行性细胞。(b) Fluoro-Jade (FJB)染色，检测TNRlOl 18治疗后TBI损伤大脑的CAl区中的退行性细胞。(c)定量显示在乱序肽或TNRlOl 18治疗后TBI损伤大脑的CAl区中的FJB-阳性细胞总数。(d)定量显示在乱序肽或TNRlOl 18治疗后来自TBI损伤大脑CAl区的系列切片中的FJB-阳性细胞。
图8.评价TNRlOl 18治疗后创伤后运动行为的转杆试验
使用恒速(IOrpm)转杆踏车分析以TNR10118或乱序肽治疗的接受假手术或创伤性脑损伤(TBI损伤)的全部动物。在五个连续试验中，以IOmin间隔测定各动物停留在转杆上的平均时间(最大值，3min)。结果表明，用TNR10118治疗的TBI损伤小鼠在杆上展示出比乱序肽治疗小鼠显著更好的运动协调和平衡能力。
图9.评价TNRlOl 18治疗后感觉运动缺乏的粘着物去除。
(a)在创伤性脑损伤(TBI)前后不同天数的左前肢的接触时间。(b)在TBI前后不同天数的右前肢的接触时间。(c)在TBI前后不同天数左前肢的粘合条去除时间。(d)在TBI前后不同天数右前肢的粘合条去除时间。
发明详述
为了促进对本发明原理的理解的目的，现参考在附图中举例说明的实施方案，并且将具体描述所述实施 方案。然而，将理解的是，这些描述并不旨在对本发明的范围进行任何限制。
本申请的公开内容提供治疗神经损伤的各种组合物、方法和用途。在本发明的各种实施方案中，损伤可以由创伤性脑损伤引起。
定义
如本文所使用，术语“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农畜、以及动物园动物、体育动物或玩赏动物，诸如狗、猫、牛、马、羊、猪、山羊、兔等。
如本文所使用，术语“药学上可接受的载体”包括可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对于接触所使用的剂量和浓度的细胞或哺乳动物而言是无毒的。生理学可接受的载体可以是含水PH缓冲溶液。生理学可接受的载体的实例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、及其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂诸如EDTA ;糖醇诸如甘露糖醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS 。
如本文所使用，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”对象或哺乳动物中神经受损或损伤的分子、多肽、死亡相关蛋白激酶I (DAPKl)结合寡肽、DAPKl-结合有机分子、N-甲D-天冬氨酸受体(NMDAR)或其它药物的量。在创伤性脑损伤的情况下，治疗有效量的“药物”可降低神经细胞死亡或损伤的水平；减少神经组织损坏区域；和/或在一定程度上减轻与创伤性脑损伤有关的一个或多个症状。在一个实施方式中，治疗有效量包括但不限于约0.l-1000mg/kg 体重、优选 l-100mg/kg 体重、更优选 10_50mg/kg 体重。
N-甲某D-天冬氡酸等体(NMDAR)
分子克隆法迄今已经鉴定出许多NMDAR亚型，其分类为三个亚族:NR1、NR2 (A-D)和NR3 (A和B)。大多数天然NMDAR是由两个必需NRl亚型和一个或多个调控NR2亚型(最通常为NR2A和/或NR2B)构成的四聚体复合物。含NR2A的NDMA受体传导突触传递。它的活化刺激神经元存活信号传导复合物(SSC)以促进基础突触传递下的神经元存活，而含NR2B的NDMA受体主要位于突触外。在疾病状况下，增加的谷氨酸胞外浓度导致突触谷氨酸溢流和突触外的NMDAR(主要为含NR2B的NMDAR)的兴奋性毒性激活，其进一步激活死亡相关蛋白激酶(DAPK)。活性DAPK被募集，并结合和磷酸化NR2B，其继而阻断突触SSC活性并促进神经元死亡。由于NMDAR在突触生理学中具有重要作用，包括突触可塑性，并且还调节存活和死亡通路两者 ，因此，无选择性地阻断它的活性的拮抗剂可导致显著的不期望的副作用。
抑制神经损伤的方法
在本发明的至少一个实施方案中，神经损伤可通过将抑制剂引至NMDAR而治疗。例如，本发明的用于抑制神经细胞损伤的方法可包括步骤:将至少一个神经细胞暴露于有效量的通过将NMDAR 2B亚型与DAPK I的结合解偶联而抑制NR28亚型活性的药物，由此该至少一个神经细胞的损伤被抑制。尽管NMDAR可包括NR1、NR2 (A-D)和NR3 (A和B)亚型的一个或多个，在一个示例性实施方案中，NMDAR包括NR2B亚型。另外，该方法的药物可包括肽、核苷酸或分子。任选地，药物还可包含药学上可接受的载体。
根据本发明的治疗创伤性脑损伤对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的抑制NR2B活性的肽，由此所述对象的至少一个神经细胞得以抑制。在一个实施方式中，所述肽可通过解偶联NR2B与DAPK I的结合而起作用。在至少一个实施方式中，所述对象可以是哺乳动物，例如人。此外，施用治疗有效量的肽可通过选自下列的途径进行:静脉注射、肌内注射、皮下注射、逆行静脉注射、动脉注射、经皮施用、吸入和手术植入。在一个示例性实施方式中，本发明的治疗创伤性脑损伤对象的方法降低了所述对象的运动协调受损水平以及提高了其学习和记忆能力。
根据本发明的方法，将至少一个神经细胞暴露于有效量的本发明的肽或向对象施用有效量的本发明的肽的步骤在遭受创伤性脑损伤后一段短的时间内进行。在一个示例性实施方式中，肽的施用在创伤性脑损伤后一周内，优选72小时、更优选48小时、仍更优选24小时或更少，例如，18、12、8、6、4、2或I小时内。
本发明的肽
在一个示例性实施方案中，适合于本发明的肽包括具有SEQ ID NO:I (KKNRNKLRRQHSY)的肽或与其具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%或100%同一性的序列。
在一个示例性实施方式中，适合于本发明的肽包括具有SEQ ID NO:1或由SEQIDNO:1组成的肽的功能等效变体。优选地，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除并且表现出与本发明的肽实例具有基本相似的体内或体外活性。
本文所公开的肽的变体也处于本发明的范围内。肽变体指一个或更多个氨基酸被改变的氨基酸序列。变体可以具有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如以异亮氨酸取代亮氨酸。备选地，变体可以具有“非保守”改变，例如以色氨酸取代甘氨酸。类似的较少改变还可包括氨基酸缺失或者插入，或者两者。特定形式的“变体”肽是“功能等效的”肽，即表现出与本发明的肽实例具有基本相似的体内或体外活性的肽。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如DNASTAR软件(DNASTAR，Inc.，Madison, WI)找到确定哪些氨基酸残基可以被替代、插入或缺失而不丧失生物学或免疫学活性的指导。此外，在下面提供特定的指导，包括在所引用参考文献内提供那些，所述参考文献通过参考并入本文。
在另外的实施方案中，所命名残基的特定位置可以稍微变化而仍然存在于肽的结构和功能类似位置上(参见 Chang，Y.，等，Biochemistry 37:3258-3271 (1998))。
此外，本发明的肽可进一步在其N端或C端包含能够引导本发明的肽跨血脑屏障和神经细胞膜的信号肽。本领域中已知的合适的信号肽可哟关于本发明，只要它们能够引导本发明的肽跨血脑屏障和神经细胞膜。示例性信号肽可选自人HIV-1Tat蛋白(47-60)(TAT)序列(“YGRKKRRQRRRPPQ” 或“GRKKRRQRRRQ”)、模型两亲性肽(modelamphipathicpeptide, MAP)序列(“KLALKLALKALKAALKLA”)、膜转位肽(membranetranslocatingpeptide, MTS)序列(“AAVALLPAVLLALLAP”)或 R9 ( “RRRRRRRRR”)序列。在一个特别优选的实施方式中，本发明的信号肽为Tat序列。任选地，本发明的肽可以被化学修饰，以促进其跨BBB和神经细胞膜，包括但不限于酰胺化、乙酰化或环化等。在一个示例性实施方式中，本发明的肽包括或由序列Tat-KKNRNKLRRQHSY(" TNRlOl 18/7 )组成。
在一个示例性实施方式中，本发明的肽是具有强疏水性的短链肽，使其在信号肽的帮助下可以容易地跨血脑屏障以及神经细胞膜。
下列实施例仅用于示例性阐述本发明而不是限制本发明。实施例
在本申请中，发明人评价了脑渗透性肽在TBI之后阻断NR2B S1303磷酸化、抑制兴奋性毒性激活、减少神经元死亡和改善行为结果等方面的神经保护效应。
材料和方法
A.动物
将雄性C57BL/6小鼠(Jackson实验室)分组安置在12/12光/暗周期的房间，并可以自由获得食物和水。实验中使用的小鼠年龄8周。所有的程序在美国印第安纳大学的动物管理和使用委员会的批准下进行。
B.海马神经细胞 培养
对C57BL/6小鼠[出生后当天0 (PO)]的脑组织进行解剖，去除脑膜，分离出海马。海马组织用木瓜蛋白酶消化。收集单个细胞，将其铺板于聚赖氨酸包被的盖玻片中，并在含有B27补充剂的NeurobasalTM无血清培养基中培养。
C.碘化丙啶染色和细胞计数
在处理后24小时将碘化丙啶(PI) [41] (10 U g/mL)施加于细胞培养物。在37°C潮湿培养箱中放置30min后，用磷酸缓冲盐水(PBS)短暂洗涤细胞，然后用在PBS中的2%低聚甲醛(PFA)固定。通过相差显微术核查固定的细胞。选择各盖玻片上五个随机的视场，获取明视场和PI染色的图像。计数细胞总数和PI阳性细胞数目，从而计算PI阳性细胞在全部细胞中的百分比。每组实验重复三次。
D.Ca2+ 成像
对于Ca2+成像，将海马神经细胞在体外培养五天(Days-1n-vitro, DIV5),加入Fluo-4 (I V- M, Invitrogen),温浴30min，接着洗漆3次,每次洗漆30min。然后，用50 y M谷氨酸/10 ii M甘氨酸刺激神经细胞的NMDAR.。再通过配备有Axio 0bserver200显微镜的AxioCam照相机收集突光。使用Axiovision 4.7软件以5秒/240周期抓取图像。Fluo-4的相对荧光被表示为AF/Fmin，其中AF是荧光相对于基线(Fmin)荧光水平的增加(AF=F-Fmin)。各实 验重复最少3次,得到相当的结果。
E.控制性皮层冲击创伤性脑损伤模型
控制性皮层冲击(CCI)损伤模型是一种挫伤性脑损伤模型，其模仿在许多人TBI病例中观察到的病灶异常。该模型由Lighthall首先引入用于雪貂[42]，后来改用于大鼠[43]和小鼠[44]。小鼠CCI模型以越来越高的频率用于研究创伤后细胞死亡[45，46]。
在本申请中，使八周龄C57BL/6雄性小鼠(n = 72)如前所描述经受轻微的CCI损伤或假手术处理[47，48]，只是其中形变量设定为0.2mm,而活塞速度控制在2.8m/sec0这些更改如先前所描述[19，20，24，50，51]使用电磁模型[49]产生轻微的损伤水平。
F.肽的施用
在创伤性脑损伤之后一个小时，将10mg/Kg阻断肽(“TNR 10118”，Tat-KKNRNKLRRQHSY)或作为对照的乱序肽(Tat-NRRRNSKLQHKKY)静脉内(1.v.)施用于小鼠。阻断肽和乱序肽都与Tat蛋白的细胞膜转导结构域(可跨BBB和可增加细胞膜通透性的信号肽)融合[52]。
H.病理学和组织化学分析
组织处理
在TBI手术之后三天，用过量戊巴比妥钠深度麻醉动物，然后用冷的0.9%的盐水经心脏灌流，接着用在PBS中包含4%低聚甲醛(PFA)的固定剂处理。移出大脑并在PFA中后固定过夜，接着用30%蔗糖冷冻保护48小时。使用低温恒温器(Leica CM 1950)切出一序列冠状缝切面(30iim厚)，并在-20°C存储。然后，如所描述[47，48，55，56]，对切片进行FJB染色处理以及免疫组织化学分析。
苏木素和曙红(H.E.)染色
大脑切片在苏木素中染色6分钟，用双蒸水CldH2O漂洗，并在酸性酒精中脱色I秒。然后，在浸入碳酸锂之前用ddH20漂洗切片3秒，并在曙红中复染15秒。然后用ddH20漂洗切片，并用二甲苯I和II各自净化5分钟，以及在通风橱中用包埋剂(cytoseal，ThomasScientific, USA)包埋。
创伤体积的测量
按照Sullivan等[57]的方法进行创伤体积的测量。对于治疗组，使用无偏的体视学方案——Cavalieri方法[58]，以盲法评价TBI后皮层损伤程度。采用图象分析系统(NeuroLucida,MBF Bioscience)评价贯穿该损伤皮层的至少12个等间隔切片。在每个切片上，对于完整的半球测定总皮层区(定义为纹层I的背面至胼胝体的背面)。通过将皮层的平均面积乘以所分析的皮层总长度，测定半球体积[58]。接着，对于该切片测定损伤皮层区域。通过确定创伤长度(切片数)乘以平均面积，确定损伤坏死皮层的体积。损伤的量接着表示为皮层体积的百分比。这消除了在各种后固定和包埋技术之后通常观察到的组织变化的偏差。
Fluoro-Jade B(FJB)染色
FJB染色(一种广泛用于检测退行性或垂死神经细胞的技术)和用4'，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和细胞型特异性标记物进行的免疫组织化学分析如先前所描述[53，54]。对于FJB染色，首先将切片在I %碱(NaOH)的80%乙醇溶液中温育5min，然后在梯度乙醇(75%、50%、和25% ;各5min)和蒸馏水中水合。然后，将切片在旋转台上在0.06%高锰酸钾溶液中温育lOmin，在蒸馏水中漂洗2min，并在0.0004%的FJB溶液(Histo-Chem Inc., Jefferson, AR)和 0.0004 % 的 DAPI (Sigma, St.Louis, MO)温育20min。然后，将切片在蒸馏水中漂洗(2-3min)、风干、并置于载物片加温器，直到完全干燥(5-10min)。干燥载物片在二甲苯中净化(2-5min)并用DPX包埋(Fluka)。在染色后，在显微镜(Zeisslmager, Germany)下评价贯穿该损伤皮层的至少12个等间隔切片。
Fluoro-Jade B 定量
在TBI损伤之后，在皮层和海马的各区域中FJB阳性神经细胞的总数如我们以前描述进行测定[48]。在切片之后从所有含有海马的切片从每六片选一个切片用于FJB染色评价。各海马亚区的解剖学边界(齿状回粒细胞、CA3锥体细胞和CAl锥体细胞)如Amaral和Witter[59]所描述加以鉴定。且在突光显微镜(Zeiss imager,Germany)下以40x物镜计数FJB阳性神经元，并测定它的定位，或在门区、齿状回区、CAl区或在CA3区中。1.行为测试方法
转杆试验
在加速转杆(San Diego Instruments)上测试小鼠,在各试验之前适应Imin,以每15秒5rpm加快速率,且最终速度不超过40rpm。在三个试验中取小鼠从杆掉落的时间(潜伏期)的平均值[60，61]。
Morris水迷宫试验
使用Morris水迷宫(MWM)测试动物的空间学习和记忆[62，63]。迷宫，一个直径为1.0m的环形黑池，装满18-20°C水，通过添加无毒白漆而将水变成不透明。有机玻璃平台隐藏于水面以下Icm并被固定。在Morris水迷宫中训练小鼠3天,每天试验10次。对于每次试验，在标记为北、东、南和西的4个位置之一将小鼠放入迷宫。在4个位置中交替起始位置，进行后续试验。一旦小鼠逃离到平台，允许小鼠在第一次试验后在那里停留30秒，并且在每一另外的试验允许停留15秒。如果小鼠不在60秒内找出平台，则由实验者将其置于平台30秒。对于每次试验，记录小鼠发现平台的时间(逃生时间)。在上次试验48小时之后，从该池除去平台，并测试动物对于该空间任务的保持。允许每只动物游泳60秒，在这期间，使用计算机化视频运动分析系统记录它们的运动(Accutrak2000, AccuscanInstruments Inc., Columbus, OH)。
用于感觉运动功能试验的粘着物去除模型
将各只动物从其住笼移出并置于测试箱(透明有机玻璃箱15cm_25cm),适应60秒的时间。对于每只小鼠，将动物轻轻地从测试箱移出并以相等的压力将I个胶带条(0.3cm-0.4cm)施加至其爪子,使得该胶带条覆盖至前爪的无毛部分。每天，转换粘着物放置顺序(右或左)并在各组内随机化。
一旦胶带条附着于动物爪子，将小鼠放回测试箱。在测试箱中轻轻处理小鼠，以避免可干扰结果的应力诱导的僵硬行为。为进一步使应力最小化，当转移动物进出测试箱时，不以尾部抓动物。
在测试箱中观察动物行为。接触时间定义为小鼠对胶带条的存在作出反应的点。对于每一 胶带条，小鼠将开始摇动它的爪子和/或直接将其爪子放入口中。两种行为都显示小鼠已经感觉到胶带并表示接触时间的终点。记录小鼠感觉左爪和右爪上的粘合条的时间长度。
在动物处于测试箱中时持续观察动物行为。观察到小鼠使用嘴并且以较小的程度使用另一个前肢(将对侧前肢放在健康同侧前肢上)而试图除去该粘着物。记录小鼠从左爪和右爪上除去粘合条的时间长度。给予小鼠除去粘合条的最大持续时间是2分钟。在第二个带子被除去或者达到2分钟之后，将小鼠放回笼子中。每天该步骤一次，连续3天。
J.统计分析
使用AN0VA、接着用学生t检验分析收集的数据，显著性设定为P < 0.05。
实施例1-在创伤性脑损伤后，在神经元中死亡相关激酶(DAPK) I在S1303位置磷酸化NMDA受体2B亚型(NR2B)
成年小鼠的左侧大脑接受中等水平的撞击，产生中等程度的创伤性CCI脑外伤。撞击的位置和参数如示意图(图1a)中描述。在假手术对照组小鼠中，未见脑组织损失。在中等水平的CCI伤24小时后，在同侧皮质皮层表现出典型的组织损失(图1b)。在假手术对照组小鼠中，使用免疫染色(图1c中，C1-C2)，磷酸化NR2B S1303(pNR2B)和DAPK激酶的水平几乎检测不到。然而，在损伤后24小时，PNR2B和激酶的水平在损伤相邻的组织的细胞中显著上调(图lc，C3-4)。DAPI染色显示它们的核固缩。激活的激酶存在于细胞质中，而PNR2B位于细胞表面(图1d)。蛋白质印迹(Western blot)检测也证实了创伤性脑损伤后，PNR2B S1303的蛋白质含量显著增加(图1e)。这些结果显示创伤性脑损伤激活DAPK激酶及增加NMDA受体2B亚型(NR2B)的磷酸化。
我们进一步确定了 DAPKl与pNR2B之间的生化和功能关系。首先，我们进行了免疫共沉淀，其中DAPKl抗体被用来沉淀在假手术和脑外伤组织中与此激酶结合的蛋白分子(图1F)。在假手术的脑组织裂解液中，经过免疫共沉淀富集，该激酶达到可以检测到的水平。同时，它可以微弱结合NR2B。但是，TBI后，它结合NR2B的量显著增高。相反，该激酶不结合NMDA受体2A亚型(NR2A)。同时，该激酶能够结合突触后密度蛋白95 (PSD-95)。因此，它与PSD-95的结合可以用作阳性对照(图1f)。在损伤皮层的对侧和同侧结合于NR2B的DAPKl均显著增加，同时更多pNR2B S1303的磷酸化(图1g)。用TNR0118处理TBI损伤小鼠显著降低了 DAPKl和NR2B之间的相互作用(图1f)，并抑制了 pNR2B S1303磷酸化(图1g)。这些结果表明，在TBI之后，DAPKl被募集并磷酸化在细胞表面上的NR2B。
实施例2-用TNR0118处理神经元在体外降低谷氨酸刺激引起的Ca2+内流和保护谷氨酸诱导的神经元过度兴奋性死亡
已经证明DAPKl激酶可以与NR2B的C-末端结合、在Ser_1303位置磷酸化NR2B，从而增强NMDA受体对Ca2+的通透性。过多的Ca2+内流进一步激活DAPKl，进而通过磷酸化NR2B增强NMDA受体对Ca2+的通透性，形成有害的恶性循环，从而导致神经的过渡兴奋性死亡。在多种神经疾病中，包括创伤性脑外伤，神经细胞死亡都是由于谷氨酸受体相关的过多Ca2+内流引起的[35，36，67]。
为了测试TNR0118抑制谷氨酸诱导的NR2B的磷酸化是否能够阻止Ca2+内流、减少细胞内过量的Ca2+所引起的细胞毒性，我们采用体外由谷氨酸诱导的神经元过度兴奋性死亡模型。在神经元的培养液中加入Ca2+指示剂一Fluo-4。当Ca2+指示剂与Ca2+相互结合的时候，指示剂产生荧光。荧光的亮度显示Ca2+的浓度[Ca2+]。。当Fluo-4进入神经细胞，更换培养液，然后加入200 ii M谷氨酸及20 ii M甘氨酸刺激神经细胞。分别用Ix PBS缓冲液(赋形剂对照)、10 PM TNR10118或乱序对照肽处理神经细胞(图2)。结果显示，在对照组中，谷氨酸/甘氨酸刺激导致神经细胞内Fluo-4荧光的亮度急剧增高，显示神经细胞内[Ca2+]。急剧增加，而且细胞内[Ca2+]。长时间维持在一个比较高的水平(图2)。用对照肽处理的神经元，显示了类似的[Ca2+]。长时间增加(图2)。与此相反，用TNR10118处理的神经元，荧光强度显著减弱，而且持续的时间较短，表现出显著减少Ca2+内流，降低细胞内[Ca2+]。(图2)。对荧光-4荧光强度进行了量化。结果表明，与Ix PBS缓冲液及对照肽相比，TNR10118-处理可以显著减少谷氨酸诱导的Ca2+内流，降低细胞内[Ca2+]c(图2)。这些结果表明，TNROl 18抑制DAPKl对NR2B的磷酸化能够在体外阻止谷氨酸刺激的Ca2+内流。
谷氨酸是一种兴奋性神经递质。TBI后，由于细胞损伤，细胞内的谷氨酸被释放出来，导致细胞外谷 氨酸的浓度急剧升高。谷氨酸导致的过渡兴奋性死亡被认为是创伤后神经细胞死亡的主要原因。所有阻止谷氨酸刺激导致的Ca2+内流可能具有神经保护作用。我们前面已经证明TNR0118抑制谷氨酸诱导的NR2B的磷酸化能够阻止Ca2+内流。这里，我们测试，TNR0118减少过量细胞内Ca2+内流是否能够保护神经过渡兴奋性导致的死亡。在体外培养4天(DIV 4)的神经元用200 ii M谷氨酸和20 ii M甘氨酸刺激I小时，然后用PBSiL序对照肽或TNRlOl 18分别处理。24小时后进行细胞死亡定量(图3a)。
使用碘化丙唳(propidium iodide,PI)染色的方法[41]来定量细胞死亡。PI是一种能够插入到双链核酸中的荧光分子。它被活细胞排除在外，所以，活细胞不被PI染色。但它可以穿透垂死或死亡细胞的细胞膜，把它们的细胞核染成红色荧光。所以，有红色荧光的细胞是垂死或死亡的细胞。在没有谷氨酸/甘氨酸刺激时，只有7.0± 1.7% (n = 5)的神经细胞是PI阳性(图3b-d)。谷氨酸/甘氨酸刺激后，49.6±2.3% (n = 5)的神经细胞呈现PI阳性(图3e-g)。用200 ii M谷氨酸和20 ii M甘氨酸刺激I小时，可以导致大约一半的神经细胞死亡。PBS或对照肽处理没有改变细胞死亡(48.3±2.0%中，n = 5)(图3h-j)。然而，当刺激的神经细胞用IOiiM TNR10118处理，谷氨酸诱导的细胞死亡急剧下降(18.5±0.6%, n = 5, P < 0.001，图3k_m)。这些结果表明，TNRlOl 18在体外对谷氨酸诱导的过渡兴奋性细胞死亡有明显的保护作用。
实施例3-在TBI之后单次静脉注射TNRlOl 18减少TBI引起的大脑皮质损伤
所有的动物都接受中等程度的创伤性脑损伤(TBI)，然后被随机分配到PBS对照组、乱序对照肽组及治疗组[22，48，56，68]。创伤后一小时，小鼠分别接受静脉注射PBS、对照肽(10mg/kg体重)、或TNR10118(10mg/kg体重)。注射后二十四小时，处死小鼠并使用卡瓦列利(Cavalieri)方法来确定其大脑皮层损伤体积的大小。
每只动物经受中等程度的创伤性脑损伤，都在受创伤的位置表现出明显的大脑皮层缺损(图4a_c)。我们首先测量皮质损伤的体积来评估短肽的治疗效果。接受PBS注射的对照动物表现出明显的皮层组织缺损(图4a)。与创伤对侧皮层相比，创伤侧皮层体积减少17.4±1.2% (图4d)。接受对照肽注射的小鼠也表现出了相近数量的大脑皮层组织缺损17.7±1.5% (图4b)。然而，接受TNR10118注射的小鼠，其大脑皮层组织缺损体积只有11.9±1.7% (图4c)。统计分析表明，相对于对照组而言，TNR10118注射明显减少TBI引起的大脑皮层组织缺损(？<0.05;图4(1)。这些数据表明，单次静脉注射该小肽能够明显减少大脑皮质损伤，它具有明显的脑保护功能。
为了进一步确定该短肽的神经保护作用，我们用FIuoto Jade B(FJB)染色的方法来进一步定量测评在大脑皮层中的细胞死亡。FJB染色是一被广泛使用的用于检测退化或死亡的神经细胞的技术[53，54]。每只小鼠位于损伤最中心的3个脑切片被挑选出来，用于FJB染色。结果显示，在所有接受中等水平脑损伤的动物中，无论是接受PBS注射(n =10)、对照肽注射(n= 10)或TNR10118注射(N= 10)，我们都在受损伤的大脑皮层边缘处观察到明显的FJB阳性神经细胞(图5a，b)。然而，放大图像显示，在损伤的大脑皮层的两侧，被FJB标记细胞的数量在接受PBS注射及对照肽注射的小鼠比在接受TNRlOl 18注射小鼠的相应的区域高得多(图5e-f)。评价组织损伤的外侧边缘和内侧细胞死亡(图5g)，表明在乱序对照肽处理的小鼠大脑中从两外侧和内侧方向FJB-阳性细胞的分布扩展至平均900微米。
相比之下，在TNR10118治疗小鼠中，FJB-阳性细胞的分布减少到从创伤边缘平均320 u m的距离(图5h)。定量结果发现，在组织创伤周围200 ii m内FJB-阳性细胞的密度在TNR10118-治疗小鼠中稍微低于在对照小鼠中。但该差异不具有统计学显著性。然而，在TNR10118治疗小鼠中，FJB-阳性细胞的密度从创伤最中心向外的两个方向急剧降低，并且在从创伤最中心向外的320 以上的`区域中观察不到FJB-阳性细胞(图5i)。相比之下，在乱序肽治疗小鼠中，不仅FJB-阳性细胞分布更广，而且FJB-阳性细胞的密度比在TNRlO118治疗小鼠中降低得显著更慢。这些结果表明，细胞死亡在TNRlOl 18治疗小鼠中显著降低，进一步确认了 TNRlOl 18在TBI损伤后的神经保护作用。
实施例4-肽治疗降低了海马齿状回的粒细胞层中的细胞死亡数目
已经证明，大脑皮层的创伤性脑损伤不仅诱导皮层中的细胞死亡，而且导致在学习和记忆中发挥关键作用的海马中细胞死亡[48]。我们的早先研究表明，尽管细胞死亡在海马的不同区域中不均匀分布，但大部分细胞死亡位于齿状回区域，主要在粒细胞层和少量存在于CAl区。
因此，为测定阻断肽是否影响TBI损伤后海马中的细胞死亡率，我们首先测定粒细胞层中的细胞死亡率。在乱序肽治疗的大脑的粒细胞层中观察到显著数量的FJB-阳性细胞。这些FJB-阳性细胞的大多数位于内粒细胞层(图6a、c)，这支持了我们早先的观察结果[48]。相比之下，在TNR10118治疗的大脑的粒细胞层中FJB-阳性细胞数目则少得多(图6b、d)。定量结果表明，在对照小鼠的粒细胞层中FJB-阳性细胞的总数为2859 (±333)，而TNRlO118治疗小鼠的粒细胞层中该数目为1021 (±350)(图6e)。这些结果表明，，这个肽可以阻断DAPKl与NR2B的结合，从而显著地减少粒细胞层中的细胞死亡。
实施例5-肽治疗降低了海马CAl区中的细胞死亡数目
尽管在中等水平的损伤后大多数死亡细胞位于齿状回区域，在CAl区中也存在一定数量的死亡细胞。而且，CAl区中的锥体细胞与齿状回中的粒状神经元在许多方面不同，包括形态学、标记物和电生理学活性。
为测定阻断DAPKl募集至NR2B的肽是否防止TBI损伤后CAl区中的细胞死亡，使用FJB染色测定海马CAl区中的细胞死亡。在对照治疗大脑的CAl区中发现大量FJB-阳性细胞(图7a)。但是，在阻断肽治疗大脑的对应区中发现只有少数FJB-阳性细胞(图7b)。定量结果显示，对照治疗大脑的CAl区中FJB阳性细胞的数目为941 (±234);而TNR10118肽治疗大脑的相应区域处该数目减少到76 (±50)(图7c)。
为进一步测定该肽在完整的海马范围内对于CAl区神经元的神经保护效应，我们选择包括整个海马的一系列切片并使用FJB染色方法测定各切片中的细胞死亡数目(图7d)。对照治疗大脑的CAl区中在最中心的切片的FJB阳性细胞数为170 (±30)。尽管CAl区中细胞死亡数目在头侧方向和尾侧方向均逐渐下降，但是在头侧720iim和尾侧ISOOiim发现FJB-阳性细胞，这几乎覆盖整个海马。尽管如此，在肽治疗大脑的CAl区中在最中心的切片仅发现中等数目的FJB-阳性细胞(35±16)。FJB-阳性细胞数目在头侧和尾侧方向均显著下降。FJB-阳性细胞仅仅分布于从最中心向头侧和尾侧约360 V- m。
该结果表明，阻断肽不仅降低CAl区中FJB-阳性细胞的数目，而且将FJB-阳性细胞保持在小得多的区域中。我们还在对照小鼠海马的门区和CA3区中发现少量FLB阳性细胞，731 (±167)。肽治疗在相应区域中将该数目减少至327 (± 183)。这些结果显示出在TBI后该肽在CAl区、CA3区和门区中对锥体神经细胞的显著保护效应。
实施例6-TNR10118治疗在中等CC1-TBI后改善空间学习和记忆功能
为了测定组织学改善是否转化为更好的行为表现，我们采用Morris水迷宫(MWM)测试评价了不同组小鼠的空·间学习和记忆。小鼠接受假手术作为对照或者中等CCI损伤。将损伤小鼠随机分成对照组或治疗组。在损伤I小时后，对照组小鼠接受10mg/kg乱序肽的单次静脉(1.V.)注射，而治疗组小鼠接受10mg/kg的TNR10118肽的单次1.v.注射。在损伤两周之后，采用MWM测试评价它们的学习和记忆。该测试测量了小鼠从水逃出并发现藏于水池中的平台所需要的时间的量(逃生时间)。
在第一个训练日，各组的逃生时间并不显著不同，这确保小鼠在相同的行为水平上开始本测试。假手术组的逃生时间在前四日每日减少并在第5日达到最佳(图8a)。对于用乱序肽治疗的TB1-损伤小鼠，它们的逃生时间在训练的前三日虽然也缓慢降低，但仍显示显著较长的逃生时间，甚至在训练5天之后也是如此(图8a)。
相比之下，对于用治疗肽治疗的TB1-损伤小鼠，它们的逃生时间比假手术对照组长，但在训练的第5日，它们的逃生时间与假手术相比并未不同(图8a)。这些数据表明，TBI损伤导致逃生时间延迟，而通过乱序肽治疗并不能减轻该延迟(P < 0.05，相对于假手术对照组)。值得注意的是，肽TNR10118治疗的小鼠在训练的第5日显示出与假手术对照组一样良好的行为(P > 0.05)(图8a)。分析游泳速度，表明其在组之间每天并无差异(图Se)，这排除了游泳速度对行为的影响。
然后，进行探索式评价动物的记忆。在该探索试验中，假手术对照小鼠显示出偏好在之前存在平台所在的目标象限中停留，这以在目标象限中超过25%的停留时间来表示(35.18±3.99% )(图Sb)。乱序肽治疗的小鼠在靶象限中停留较少的时间(27.01±2.11%, P = 0.09，相对于假手术组)(图Sc)，表明它们关于之前存在的平台的位置的记忆被削弱。值得注意，TNR10118治疗小鼠显示出实质性的参考记忆(32.56±4.82%，P = 0.3，相对于乱序肽治疗组)(图8d)。这些数据表明，接受TNR10118治疗的TBI损伤小鼠显示出比接收对照肽治疗的TBI损伤小鼠显著更好的学习和记忆。
实施例7-TNR0118治疗改善创伤后的运动行为
转杆试齡
已经证明，中等水平的冲击导致显著的运动协调缺乏。我们进一步利用对于坠落感的天然恐惧来进行转杆(rotarod)试验[60，61，69，70]。在CCI手术前一天，转杆试验结果显示，在分配于假手术组(52.26± 1.93s)、乱序肽治疗组(51.26±1.74s)和TNR10118治疗组(52.67± 1.32s)的小鼠中持续时间一致(n = 16, p > 0.05)。假手术小鼠在损伤3天后表现出在转杆上维持平衡和动量方面轻微下降(47.48± 1.73s)，然后在损伤7天后自然恢复至对照水平(51.83±2.32s)。在TBI后第3天和第7天，用乱序肽治疗的小鼠(第3日，36.63±2.25s;第7日，41.54±2.72s, p < 0.05)显示出比在假手术对照组小鼠(第3目，47.48± 1.73s ;第7日， 51.83±2.32s)在转杆上更短的持续时间。
然而，与假手术对照组相比较，TNR10118治疗组小鼠显示出相当的持续时间(第3日，45.46± 1.66s ;第7日，48.38± 1.42s，P > 0.05)。尽管在损伤7天后观察到转杆行为的恢复并未与假手术小鼠一样好，但该差异并非统计学上显著的(P>0.05)。在TBI损伤14天后，转杆试验对于检测各组小鼠间的任何差异都足够灵敏。
这些数据证明，在损伤后乱序肽治疗小鼠明显难以在转杆上保持平衡和动量。相比之下，在损伤后本发明的肽治疗的小鼠与假手术小鼠保持平衡和动量上表现出相似的转杆行为水平。
粘着物去除试验
为进一步确认在CCI损伤后TNR10118治疗对于运动功能的恢复，我们在手术前以及在手术后第3、7和14日进行另一个行为试验——前肢的粘着物去除试验，其是一种用于在小鼠中评价感觉运动缺陷的灵敏方法[71]。在左前肢(图9a)和右前肢(图9b)的接触时间(time-to-contact)方面均未观察到缺陷。在3组之间从左前肢除去粘合带的时间没有差异。然而，在损伤后第3天和第7天，在用乱序肽治疗的小鼠中，在对应于大脑左半球CCI区的右前肢中观察到去除时间的短暂缺陷。相比之下，该缺陷在TNR10118治疗的小鼠中并未观察到。这些结果表明，在损伤后，用该小肽治疗TBI损伤小鼠不仅减少病变，而且改善运动功能。
结论
我们证明了在TBI损伤后，通过阻断DAPKl与NMDA受体NR2B亚型的相互结合显著减少了 NR2B S1303磷酸化、选择性抑制细胞毒性激活、显著减少神经元死亡并改善行为结果，并且未显示出明显的副作用。这些数据为本发明的肽例如TNR10118的神经保护效果提供了证据。
虽然在本文已经非常详细地描述了治疗神经损伤的组合物和方法的各种实施方案，但该实施方案仅仅作为本文描述的公开内容的非限制性实例而提供。因此，本领域技术人员将理解，可以对本发明进行各种变化和改变，而不偏离本发明的范围。实际上，本公开内容不旨在是穷尽性的或旨在限制本发明的范围。
进一步，在代表性实施方案的描述中，本公开内容已经以特定步骤顺序给出本发明的方法和/或过程。然而，该方法或过程不应限于所描述的特定步骤顺序。其它步骤顺序是可能的。因此，本文公开的特定步骤顺序不应解释为对本发明的限制。此外，针对方法和/或过程的公开内容不应限于以所描述的顺序进行它们的步骤。这样的顺序可以变化并且仍在本发明的范围内。
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权利要求
1.有效量的抑制N-甲基D-天冬氨酸受体2B亚型活性的肽在制备用于在创伤性脑损伤后抑制神经细胞损伤的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述肽包含SEQID NO:1或其功能等效变体，所述变体具有1、2或3个保守氨基酸取代、添加或删除。
3.权利要求2的用途，其中所述肽具有选自与SEQID NO:1具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%同一性的序列。
4.权利要求3的用途，其中所述肽在其N端或C端进一步包含信号肽。
5.权利要求4的用途，其中所述信号肽选自TAT序列、MAP序列、MTS序列或R9序列。
6.权利要求1的用途，其中所述肽被化学修饰。
7.权利要求1-6任一项的用途，其中所述药物被制备成在创伤性脑损伤后一段时间内施用，所述一段时间选自一周、72小时、48小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时或I小时。
8.权利要求1-6任一项的用途，其中所述有效量在0.1-lOOOmg/kg体重的范围内。
9.权利要求1-8任一项所定义的肽在制备用于在创伤性脑损伤后治疗哺乳动物的药物中的用途。
10.用于在创伤性脑损伤后治疗神经损伤的组合物，所述组合物包含权利要求1-8任一项所定义的肽和药学上可接受的载`体。
全文摘要
本申请提供使用肽抑制创伤性脑损伤后神经细胞损伤的方法、以及包含所述肽的组合物和所述肽的用途。
文档编号A61P25/00GK103230581SQ201210448778
公开日2013年8月7日 申请日期2012年11月12日 优先权日2011年11月10日
发明者陈锦辉 申请人:陈锦辉