用于检测、预防和治疗白斑病的mia（黑素瘤抑制性活性蛋白）抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测、预防和治疗白斑病的抑制MIA（黑素瘤抑制性活性蛋白）活性的肽、修饰的肽和抗体或抗体片断。
【专利说明】用于检测、预防和治疗白斑病的ΜΙΑ (黑素瘤抑制性活性蛋白)抑制剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物领域，具体而言，本发明涉及用于检测、预防和治疗白斑病的制剂。
【背景技术】
[0002]白斑病，一般普遍称为白癜风，是一种后天皮肤和粘膜性色素紊乱，其特征为有边界的褪色斑点和斑块。白斑病是进行性疾病，其中，受影响的皮肤中的一些或全部黑素细胞被选择性地破坏。白斑病侵袭0.5%至2%的世界人口，平均发病年龄为20岁。
[0003]非节段性白斑病为最常见的白斑病亚型。非节段性白斑病为后天慢性色素紊舌L特征为白色斑块，通常对称，一般随时间增加而增大尺寸，对应于功能性表皮黑素细胞的大量损失，有时对应于毛囊黑素细胞的大量损失(Taieb A, Picardo M; VETF Members.The definition and assessment of vitiligo:a consensus report of the VitiligoEuropean Task Force.Pigment Cell Res2007;20:27-35)。
[0004]尽管对白斑病皮肤进行了许多研究，但是该皮肤病的确切的发病机理还有待阐明，多年来已经提出了若干发病机制，包括自身免疫机制、细胞毒性新陈代谢机制、神经组分和遗传组分机制； 还没有产生描述所有这些影响因素的相互作用的令人信服的模型(Schallreuter KU，Bahadoran P，Picardo M，et al.Vitiligo pathogenesis:autoimmunedisease, genetic defect, excessive reactive oxygen species,calcium imbalance, orwhat else?Exp Dermatol2008; 17:139-40)。到目前为止，两个主要特征可明确地归因于白斑病:在组织结构上缺少炎症以及在临床上与其它自身免疫紊乱相关。最近，已经启示白斑病发展中的主要且可能的基本诱发因素可能是黑素细胞的缺陷性粘附，基于体内和体外观察(Gauthier Y, Cario-Andre Mj Lepreux S，Pain C，Taieb A.Melanocyte detachmentafter skin friction in non lesional skin of patients with generalized vitilig0.Br J Dermatol2003;148:95-101;Cario-Andre ' M，Pain C，Gauthier Yj Taieb A.Themelanocytorrhagic hypothesis of vitiligo tested on pigmented, stressed, reconstructed epidermis.Pigment Cell Res2007; 20:385 - 393)，机械性创伤和各种化学应激物可代表主要的诱发事件。该理论认为白斑病为由慢性脱离引起的疾病，该疾病称为黑素细胞流失(黑素细胞透过表皮损失)(Gauthier Y, Cario-Andre M，LepreuxS，Pain C，Taieb A.Melanocyte detachment after skin friction in non lesionalskin of patients with generalized vitilig0.Br J Dermatol2003;148:95-101;Cario-Andre f M，Pain C，Gauthier Y，Taieb A.The melanocytorrhagic hypothesis ofvitiligo tested on pigmented, stressed, reconstructed epidermis.Pigment CellRes2007;20:385 - 393;Gauthier Yj Cario Andre M，Tdieh A.A critical appraisal ofvitiligo etiologic theories.1s melanocyte loss a melanocytorrhagy?Pigment CellRes2003; 16:322-32)，所述黑素细胞流失可能为白斑皮肤消除其色素的沉默(silent)方式。
[0005]在治疗白斑病过程中可考虑若干种疗法(Sehgal VN, Srivastava G.Vitiligotreatment options:an evolving scenari0.J Dermatolog Treat2006;17:262-75)。
[0006]单一的白斑病疗法中没有一种在所有患者中产生预期良好结果；对单一疗法的响应高度可变。总体而言，治疗必须个体化，并且应当使患者明白与疗法相关的风险。用于非节段性白斑病的最常见的治疗为:
[0007]窄谱紫外线B (UVB-NB)光疗法:具有良好临床结果广泛使用，基于发射光谱为310-315nm且最大波长为311nm的窄谱荧光灯。治疗频率为每周2至3次，但不在连续的天数治疗。该治疗可安全地用于儿童、孕妇和哺乳期妇女。短期的不良反应包括皮肤瘙痒和干燥。长期的不良反应并未清楚定义，因为UVB的致癌潜力还有待阐明。该疗法对脸部和躯干的白斑斑块达到了最好结果；一般对手部和足部白斑病具有非常差的结果。
[0008]皮质类固醇疗法:局部地、全身地或病灶内使用皮质类固醇；通常首先选择局部类固醇治疗局部白斑病但是该治疗结果已被报道部分成功，特别是在患有局部白斑病的患者和/或其白斑具有炎症性组分的患者中，尽管所述炎症为亚临床的。使用局部、全身或病灶内类固醇可能具有像毒性(全身)或皮肤萎缩(局部或病灶内)之类的副作用；此外，该疗法一般对手部和足部白斑病具有非常差的结果。
[0009]局部钙调神经磷酸酶抑制剂(他克莫司(Tacrolimus)和吡美莫司(Pimecrolimus))法:他克莫司和吡美莫司可成功用于治疗脸部和颈部白斑斑块；最近，由于这些药剂的微量全身吸收引起的肿瘤形成的理论上的风险，食品和药物管理局(FDA)对局部钙调神经磷酸酶抑制剂给予“黑框警告(black box warning)”;此外，该疗法一般对手部和足部白斑病具有非常差的结果。
【发明内容】
[0010]对于白斑病的治疗存在外科替代方案；然而，由于外科疗法耗费时间的特性，这些治疗方案限于节段性白斑病或局部白斑病。
[0011]到目前为止，这些疗法中没有一种可以在所有患者中实现白斑斑块中色素完全重新沉着。
[0012]这些疗法起作用的准确机制还是未知，一般归因于其免疫抑制活性。然而，值得注意的是，在暴露于UVB-NB辐射之后，该辐射使α5β I整合素在黑素细胞上的表达增加(Neitmann M, Alexander M, Brinckmann J, Schlenke P,Tronnier M.Attachmentand chemotaxis of melanocytes after ultraviolet irradiation in vitr0.Br JDermatol1999;141:794-801)。
[0013] 整合素的一个特殊亚类(称为α5β1)，似乎与黑素细胞粘附有关并涉及白斑病治疗(Swope VBj Supp APj Schwemberger S，Babcock G，Boyce S.1ncreased expressionof integrins and decreased apoptosis correlate with increased melanocyteretention in cultured skin substitutes.Pigment Cell Res2006; 19:424-33)。黑素细胞与基底膜之间的相互作用由整合素介导(Hara Mj Yaar Mj Tang A, Eller MS, ReenstraWj Gilchrest BA.Role of integrins in melanocyte attachment and dendricity.JCell Scil994; 107:2739-48)并且许多该皮肤病的有用的疗法似乎在这些分子的表达中起作用(Neitmann M, Alexander Μ, Brinckmann J, Schlenke P, Tronnier Μ.Attachmentand chemotaxis of melanocytes after ultraviolet irradiation in vitr0.Br JDermatol1999;141:794-801)。
[0014]主动脱离和α5β I整合素在另外的且更严重的黑素细胞紊乱(例如恶性黑色素瘤)中也是非常令人感兴趣的特征。恶性黑色素瘤是最严重的皮肤癌症并且其转移形式与最差的预后有关(Thompson JF, Scolyer RA, Kefford RF.Cutaneous melanoma.Lancet2005;365:687-701)。
[0015]最近发现恶性黑色素瘤(黑素细胞衍生的肿瘤)的转移性扩散可由肿瘤细胞的主动脱离介导，并且这种脱离可由恶性黑色素瘤细胞分泌的小蛋白引起，称为黑素瘤抑制性活性蛋白"MIA (Bosserhoff AK, Stoll R, Sleeman JP, Bataille F, BuettnerR, Holak TA.Active detachment involves inhibition of cell—matrix contacts ofmalignant melanoma cells by secretion of melanoma inhibitory activity.LabInvest2003; 83:1583-94)。已经证实 MIA 与整合素 α 5 β I 相互作用(Bauer R, HumphriesM, Fassler R, Winklmeier A, Craig SE, Bosserhoff AK.Regulation of integrin activityby MIA.J Biol Chem2006; 281:11669-77)。因此，恶性黑素细胞自身产生的蛋白(MIA)与自身黑素细胞粘附分子(α 5β I整合素)之间的相互作用会导致恶性黑色素瘤中瘤黑素细胞的主动脱离。
[0016]W003/64457公开了抑制MIA活性的肽、修饰的肽和抗体或抗体片断及其在治疗实体瘤、白血病和退行性紊乱中的用途。
[0017]本发明的技术问题为提供避免已知疗法的副作用的化合物，所述副作用例如皮肤瘙痒和干燥或皮肤萎缩、毒性和潜在的致癌作用或肿瘤形成作用。
[0018]同时，理想地是，本发明提供引起色素完全重新沉着的化合物，不论治疗什么部位，甚至对于手部和足部均提供良好结果，所述手部和足部一般恢复较差。
[0019]另一技术问题为提供可用于上述疾病的早期检测和进一步跟踪的标记物。
[0020]还亟需能够抑制易患所述疾病的患者中该疾病发作的活性药剂。
[0021]本发明的发明人意外地且出乎意料地发现MIA蛋白存在于患有白斑病的患者中，而不存在于正常人体，MIA蛋白涉及导致白斑斑块形成的实际发病机制。
[0022]MIA的存在解释了为何白斑斑块中缺少明显的临床炎症。因为基底膜附近没有细胞坏死或细胞凋亡，所以黑素细胞的脱离没有活化炎症路径。
[0023]如今，因为还未发现任何靶分子，所以靶向疗法无法用于白斑病。
[0024]MIA抑制剂代表了用于非节段性白斑病的靶向疗法。
[0025]由于其特异性结合于MIA，这些MIA抑制剂分子不产生一般报道的在实际治疗中的副作用，如皮肤萎缩、瘙痒、毒性或肿瘤形成潜力。
[0026]此外，抑制MIA (通过避免对黑素细胞的破坏)使所治疗的组织部位的色素重新沉着，由此可对诸如手部和足部等难治部位实施治疗。
[0027]对于白斑病而言治疗抗性的部位(例如手部和足部)被认为是由于这些部位中缺少黑素细胞存储库；我们的数据显示针对这些部位的黑素细胞的大量MIA的存在可能是因为这些区域的持续摩擦。MIA的抑制剂(通过除去所有MIA分子)成功地治疗这些部位。因此，抑制MIA活性的肽、修饰的肽和抗体或抗体片断能够通过诱导色素重新沉着而用于治疗白斑病。
[0028]上述化合物还可用作白斑病发展的早期标记物并用作跟踪白斑病患者的工具，还可用于预防出现白斑斑块。
[0029]所述化合物还可用于使已知疗法更加有效。因此，本发明的目的为至少一种序列ID号为I至49的肽在检测、预防和治疗白斑病中的用途。
[0030]在本发明的一种实施方式中，所述肽中的一个或一个以上氨基酸由天然氨基酸或非天然氨基酸代替。
[0031]在本发明的另一实施方式中，所述非天然氨基酸为修饰的天然氨基酸，其中，所述修饰为一个或一个以上原子被替换为含有I至12个选自C，H, N, S，O, P, F，Cl, Br, I, Se的原子的官能团。
[0032]在本发明的另一实施方式中，上述肽包含额外的氨基酸或者在所述肽中删除一个
氨基酸。
[0033]在本发明的另一实施方式中，序列ID为I至49的肽的氨基酸的修饰是指糖基化、乙酰化、羟基化(羟脯氨酸)、羧化(Y -羧基谷氨酸)、磷酸化、烷化、豆蘧酰化(N-末端)、棕榈酰化和异戊烯化以及非天然生成的氨基酸，包括反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、异-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型-谷氨酰胺(Homo-glutamin)、哌啶酸、叔-亮氨酸、戊氨酸、2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基丙氨酸、4-氮杂苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
[0034]本发明的目的还包括提供至少一种抗-MIA抗体或其片断在检测、预防和治疗白斑病中的用途。
[0035]优选的抗-MIA抗体选自:抗-α4_整合素(A4_PUJ1，UBI)、抗-α4_整合素(Ρ1Η4, Chemicon)、抗-α 5-整合素(A5-PUJ5, UBI)、抗-α 5-整合素(P1D6, Chemicon)。
[0036]本发明的另外特征可通过参考试验实施例和说明书附图，从下面的详细描述中清楚地理解。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1显示导致白斑病的黑素细胞中的α5β I整合素和MIA的作用机制。A图显示由α 5 β I整合素介导的黑素细胞与基底膜的正常粘附。图B显示被与α 5 β I整合素结合的MIA侵袭的白斑黑素细胞。图C显示在MIA与α 5β I整合素结合之后,诸如氧化应激、物理创伤或自身抗体等其它诱发因素的出现导致黑素细胞部分脱离。在图D中，显示了黑素细胞完全脱离并在皮肤上形成白斑斑块(黑素细胞流失)。图E显示了与MIA结合并使其失活的抗-MIA药物。图F显示甚至在存在诱发因素的条件下，仍然保持与基底膜粘附的白斑黑素细胞。
【具体实施方式】
[0038]定义
[0039] 在本发明的主旨中，白斑病是指皮肤和粘膜后天进行性色素紊乱，特征为有边界的褪色斑点和斑块。[0040]在本发明的主旨中，肽通过结合MIA抑制MIA的活性。
[0041]在本发明的主旨中，天然氨基酸为存在于天然蛋白质和肽中的20种氨基酸。
[0042]在本发明的主旨中，非天然氨基酸为非遗传编码的氨基酸，该氨基酸为天然生成
或化学合成的。
[0043]在本发明的主旨中，修饰的氨基酸是指通过糖基化、乙酰化、羟基化(羟脯氨酸)、
羧化(Y -羧基谷氨酸)、磷酸化、烷化、豆蘧酰化(N-末端)、棕榈酰化和异戊烯化修饰的氨基酸。
[0044]本发明的目的为提供抑制MIA活性的肽、修饰的肽和抗体或抗体片段在检测、预
防和治疗白斑病中的用途。
[0045]所述抑制MIA活性的肽为:
SEQ ID N0:01VPHIPPN
SEQ ID N0:02MPPTQVS
SEQ ID N0:03QMHPWPP
SEQ ID N0:04QPPFWQF
SEQ ID N0:05TPPQGLA
SEQ ID NO:06IPPYNTL
SEQ ID N0:07AVRPAPL
SEQ ID N0:08GAKPHPQ
SEQ ID N0:09QQLSPLP
SEQ ID N0:10GPPPSPV
SEQ ID N0:11LPLTPLP
SEQ ID NO:12QLNVNHQARADQ
SEQ ID NO:13TSASTRPELHYP
SEQ ID NO:14TFLPHQMHPWPP
SEQ ID N0:15VPHIPPNSMALT
SEQ ID NO:16RLTLLVLIMPAP
(W003064457;Stoll et al., 302001, EMBO J.20:340-349).SEQ ID NO:17YNLPKVSSNLSP
SEQ ID NO:18MPPTQVSKFRLI
SEQ ID NO:19ANIDATPLFLRA
SEQ ID N0:20LLRTTETLPM FL
SEQ ID N0:21SALEPLV
SEQ ID N0:22GSPTPNA
SEQ ID N0:23APSHATH
SEQ ID N0:24TTVGHSD
SEQ ID N0:25THFSTFT
SEQ ID N0:26SLLLDTS
SEQ ID N0:27SVAMKAHKPLLP
SEQ ID N0:28NTIPGFASKSLD
【权利要求】
1.选自ID号为I至ID号为49的肽在检测、预防和治疗白斑病中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，白斑病为非节段性白斑病。
3.如权利要求1所述的用途，其中，在ID号为1至ID号为49的所述肽中，一个或一个以上氨基酸可被天然氨基酸或非天然氨基酸替换。
4.如权利要求1所述的用途，其中，ID号为1至ID号为49的所述肽能包含额外的氨基酸。
5.如权利要求1所述的用途，其中，在ID号为1至ID号为49的所述肽中，删除一个氨基酸。
6.如权利要求1所述的用途，其中，ID号为1至ID号为49的所述肽包含至少一个通过糖基化、乙酰化、羟基化(羟脯氨酸)、羧化(Y -羧基谷氨酸)、磷酸化、烷化、豆蘧酰化(N-末端)、棕榈酰化和异戊酰化修饰的氨基酸。
7.如权利要求1所述的用途，其中，ID号为1至ID号为49的所述肽包含至少一个被非天然存在的氨基酸修饰的氨基酸，所述非天然存在的氨基酸选自反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、异-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型-谷氨酰胺、哌啶酸、叔-亮氨酸、戊氨酸、2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基丙氨酸、4-氮杂苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
8.抗-MIA抗体或其片断在检测、预防和治疗白斑病中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中，白斑病为非节段性白斑病。
10.如权利要求8所述的用途，其中，所述抗MIA抗体选自抗-α4-整合素、抗-α 4-整合素、抗-α 5-整合素、抗-α 5-整合素。
11.组合物,其包含至少一种如权利要求1至6中的任一项所述的肽和/或至少一种如权利要求8至10所述的抗-MIA抗体以及药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
【文档编号】A61K38/08GK103930122SQ201280024894
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年3月12日 优先权日:2011年3月22日
【发明者】马特奥·博尔迪尼翁 申请人:马特奥·博尔迪尼翁