调节表观遗传dna甲基化以导致细胞采取与年轻细胞相关的dna甲基化模式的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种外用组合物，其包括：(a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基；(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；以及(c)皮肤病学上可接受的赋形剂。当本发明的所述组合物局部用于哺乳动物细胞时，能够对DNA的表观遗传甲基化发挥作用，使得甲基化状态被调节以具有较年轻细胞的表观遗传状态的较多的特征和模式。
【专利说明】调节表观遗传DNA甲基化以导致细胞采取与年轻细胞相关
的DNA甲基化模式
【技术领域】
[0001]本发明涉及在控制人体皮肤细胞中的DNA甲基化方面有效的组合物。更具体地，本发明涉及外用组合物，该组合物含有来自禾本科植物的植物分生组织条件营养培养基，以及涉及制造这些组合物的方法和使用这些组合物的方法。
【背景技术】
[0002]植物是地球上的生物体中唯一能够从老的植物的单个细胞长出新的植物的生物体。培育这样的植物细胞的方法被称为植物组织培养，并自1900年代初期以来就是公知的了。
[0003]植物细胞培养物已用于局部应用。例如:US2008/0299092A1公开了为了影响皮肤干细胞的健康的目的的、来自于苹果的分化的植物细胞在化妆品制备中的用途。同样，EP1736167A2 公开了富含韦伯思科斯(verboscosides)的欧丁香(Syringa vulgaris)的植物细胞培养物培养基的以提供对皮肤的抗氧化的影响的局部应用。US2007/0015252A1公开了来自含有类苯基丙烷的匍匐筋骨草(Ajuga reptans)的植物培养物的局部应用，该类苯基丙烷提供给提取物高含量的抗氧化剂。美国专利N0.6551625公开了来自丹参(Salviamiltiorrhiza)的作为悬浮培养物培育的未分化的植物细胞可以用在化妆品及局部应用中，以帮助防止体臭形成。EP2133323A1公开了培育积雪草(Centella asiatica)作为用于生产 3，5- 二咖啡酰-4-丙二酰奎尼酸(3，5-dicaffeoyl-4-malonylquinic acid)的组织培养物，3，5- 二咖啡酰-4-丙二酰奎尼酸在皮肤化妆品中使用时，会有金属蛋白酶的抑制活性。
[0004]然而，迄今为止，就 申请人:所知，没有现有技术披露了由植物细胞培养物制造的用于影响皮肤细胞中的表观遗传的DNA或染色质甲基化的任何局部治疗物。
[0005]表观遗传学是研究由与DNA序列变化的机制不同的机制导致的基因表达中的遗传变化的学科。改变基因的活性而不改变DNA序列并且还能被传递给子细胞的任何修饰都被视为表观遗传修饰。即使DNA序列没有变化，表观遗传变化也能传递到子细胞，并可能持续多代。表观遗传因素和表观遗传变化已经被证明在细胞的分化、发育、衰老和疾病方面发挥重要作用(Cropley et al., 2006; Weaver et al., 2006; Rakyan et al.，2003)。
[0006]已证明在整体水平和基因特异水平两方面的DNA甲基化在表观遗传记忆方面都发挥重要的作用；已证明DNA甲基化的变化与年龄有关(Gopisetty et al., 2006; Ottavianoet al., 1994; Feng et al., 2006; Boks et al., 2009) ? 有关表观遗传变化的 DNA 甲基化发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶-5上。甲基基团连接到胞嘧啶碱基上，胞嘧啶碱基再连接到鸟嘌呤二核苷酸碱基上。其中P代表与C和G连接在一起的磷酸酯(phosphate)。这有助于从CG碱基对分化出CpG。DNA甲基化也可以发生在CpA位点、CpT位点和CpC位点，但目前由于生物和技术的原因，与胞嘧啶甲基化和基因转录关联的数据中的多数来自CpG数据。
[0007]基因的CpG富集启动子区域(称为CpG岛)的碱基化已被识别为是在基因转录调节方面的重要机理(Metivier et al., 2008; Bird, 2002) XpG 岛已由 Takai 和 Jones (2002)定义为GC含量大于55%的200个碱基对的区域。人类启动子中有约70%的CpG岛(Saxonovet al., 2006) 0基因启动子区域是基因的上游的DNA的区域，在这里RNA聚合酶初始结合以开始基因的转录。CpG岛除了与启动子相关联外，还与管家基因连接。通常在正常细胞中CpG岛未甲基化，从而使得转录机理适用于DNA。在某些疾病中以及在老化情况下，CpG岛会异常地甲基化，不能调节通常的基因转录活性。甲基化在CpG 二核苷酸的两条链上的胞嘧啶残基上都对称地发生。早在胚胎发育过程中，在有机体中就进行DNA甲基化。在哺乳动物细胞中，约70-80%的CpG位点甲基化，但CpG位点和其甲基化程度在基因组中的分布是不均匀的(Bird等，1985)。CpG位点主要在人类基因的约70的启动子中被发现(Saxonov等，2006)，并且这些位点倾向于不会被甲基化。当启动子中的CpG岛甲基化时，这将导致抑制相邻基因的转录。被表达的基因通常显示在其启动子区域有低甲基化，并且在其基因体中有高甲基化(Ball等，2009)。DNA甲基化被推定改变染色质的密度和DNA对细胞机制的可亲性(accessibility),从而影响相关DNA序列的转录潜力。[0008]在特定的细胞中，特定基因的DNA甲基化水平随着时间的推移而变化。这正如当将不同类型的细胞(如人类多能干细胞和体细胞)进行比较时DNA甲基化水平的变化(Denget al., 2009) 0同卵(相同)双胞胎具有相同的基因型，因为它们来自同一受精卵。研究表明，表观遗传修饰模式随着同卵双胞胎长大而在他们中出现差别，这表明，在通过连续的细胞分裂而传递表观遗传信息方面的小缺陷可能发生(Fraga et al.，2005)。该过程被称为“表观遗传漂移”，其与年龄相关。对双胞胎的研究估计，遗传因素只决定人类寿命变化中的20-30%。变化中的其余70-80%是由于环境和其他非遗传因素决定的(Fraga etal., 2005;Mitchell et al., 2001;Herskind et al., 1996;Poulsen et al.，2007)。
[0009]影响DNA甲基化的方法是已知的。例如，美国专利N0.7，790，746中公开了使用不同的喹啉衍生物抑制DNA甲基化的方法。然而，该专利没有公开使用植物中提取的活性成分作为手段影响DNA甲基化，特别是基因的启动子的DNA甲基化。
[0010]目前在化妆品界所需要的是通过影响与哺乳动物(尤其是人类)的皮肤细胞的老化相关联的各种关键基因的启动子区域的甲基化而改善老化皮肤的特征的成分。本发明为该需求提供了答案。
【发明内容】
[0011]在一个方面，本发明涉及一种用于控制人类皮肤细胞中的DNA甲基化的外用组合物，其包括:(a)来自稻属(genus oryza)植物的植物分生组织条件营养培养基(即植物分生组织细胞悬浮液提取物)，(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；以及(C)皮肤病学上可接受的赋形剂。
[0012]在另一个方面，本发明涉及一种组合物浓缩物，其包含:(a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基(即植物分生组织细胞悬浮液提取物)，和(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂，其中按重量计，组分(a)以所述组合物浓缩物的介于0.0000001 %至99%之间的量存在，优选以介于90%到99%之间、更优选以介于97%至99%之间的量存在；并且按重量计，组分(b)以所述组合物浓缩物的介于
0.01%至10%之间的量存在，更优选以介于0.1%至5%之间、并且最优选以介于0.4%至2%之间的量存在。
[0013]在又一个方面中，本发明涉及用于制备上述外用组合物的方法。该方法包括以下步骤:(i)提供来自于稻属植物的全能性的、未分化的植物细胞；(ii)使所述植物细胞在存在或不存在化学的、气体的、或能量的应激的情况下，在液态营养培养基中生长，以产生含有水溶性组分和水不溶性组分的混合物，所述应激用于得到次级植物细胞代谢物的表达；
(iii)除去所述水不溶性组分，以产生所述植物分生组织条件营养培养基(即植物分生组织细胞悬浮液提取物);以及(iv)使所述植物分生组织条件营养培养基(即植物分生组织细胞悬浮液提取物)与防腐剂以及皮肤病学上可接受的赋形剂混合，从而制造出所述外用组合物。
[0014]在又一个方面，本发明涉及一种用于控制在人类皮肤细胞中的DNA甲基化的方法。该方法包括使皮肤与本发明所述的外用组合物接触。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是臭氧应激型分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)的HPLC色谱。
[0016]图2是非臭氧应激型稻米(rice)分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)的HPLC色谱图。
[0017]图3是示出本发明的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)对在体外生长的成纤维细胞的基因启动子的全基因组范围的甲基化水平的影响的曲线图。
[0018]图4是示出本发明的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)对在体外生长的成纤维细胞的胶原蛋白IAl基因启动子的甲基化水平的影响的曲线图。
[0019]图5是示出本发明的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)对在体外生长的成纤维细胞的胶原蛋白1A2基因启动子的甲基化水平的影响的曲线图。
[0020]图6是示出本发明的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)对在体外生长的成纤维细胞的胶原蛋白IA的蛋白水平的影响的曲线图。
[0021]图7是示出本发明的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)对在体外生长的成纤维细胞的皮连蛋白(dermatopontin)表达的影响的曲线图。
【具体实施方式】
[0022]现已惊奇地发现，当局部应用于人体皮肤细胞时，植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)，特别是那些来自于禾本科(poaceae)，优选稻属(Oryza),更优选为水稻种(species sativa)的植物分生组织条件营养培养基,诸如,例如成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞等可以调节在年轻的哺乳动物皮肤细胞中的DNA甲基化并且更具体地在内在地和外在地老化的哺乳动物皮肤细胞中的DNA甲基化，尤其是在基因的启动子区域的DNA甲基化。经处理的细胞显示DNA甲基化模式有在年轻的、未老化的细胞中发现的那些特征。含有这些植物分生组织条件营养培养基的外用组合物对于在人和兽医治疗中使用以及用于营养和美容的目的是特别有利的。
[0023]因此，在一种实施方式中，本发明提供一种用于控制人体皮肤细胞中的DNA甲基化的外用组合物，该组合物包括:(a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)，(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂，以及(C)皮肤病学上可接受的赋形剂。
[0024]与本发明的上述外用组合物相关联，按重量计，组分(a)以所述组合物的介于0.0000001%至99%之间的量存在，优选以介于0.0001%至50%之间、更优选以介于
0.001%至25%之间、并且最优选以介于0.01%至10%之间的量存在；按重量计，组分(b)以所述组合物的介于0.0I %至10 %之间的量存在，更优选以介于0.1 %至5 %之间、并且最优选以介于0.4%至2%之间的量存在；且按重量计，组分(c)以所述组合物的介于1%至98 %之间的量存在，并且最优选以介于80 %至90 %之间的量存在。
[0025]组分(a)，一种适合用于本发明的外用组合物中的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)，其来自稻属植物，优选来自植物水稻。
[0026]植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)可以通过包含下述步骤的方法制备:(i)使来自于稻属植物的分生组织在液态营养培养基中生长，以产生含有水溶性组分和水不溶性组分的混合物，以及(ii)除去所述水不溶性成分，由此产生所述植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)。
[0027]产生植物分生组织培养基的方法在本领域中是已知的。通常情况下，先将植物灭菌，然后将分生组织从植物上切下，并放置在固态营养培养基上，以便从分生组织形成未分化的愈伤组织。
[0028]固态营养培养基通常对于本领域技术人员而言是已知的。在一种实施方式中，它们包含诸如Murashige & Skoog培养基、鹿糖、Gamborg维生素、生长激素(例如IAA)、激动素和琼脂等成分。
[0029]就本发明的目的而言，优选将由分生组织形成的愈伤组织作为未分化的细胞保持。在营养培养基中，相对于激动素，较高水平的植物生长素有利于生根，反之则可导致芽的形成，并且中等水平的植物生长素则导致愈伤组织的增殖。因此，应保持在营养培养基中的生长素和激动素的水平，以便只产生未分化的细胞。
[0030]分生组织在固体培养基中生长一段适当的时间后，通过将其分割和转移到新的固体培养基上，传代培养愈伤组织。优选地，该处理至少重复几次，以获得稳定的细胞系。如本文所使用的，稳定的细胞系是指具有恒定的性状、产生可繁殖量的活性成分、以恒定的速率生长、并且在多代之后看起来相同的细胞。通常情况下，稳定的培养物在培养过程中随着时间的推移不会有什么变化，并且繁殖物将不会有什么变化。
[0031]如本领域技术 人员所知道的，组织培养可以产生克隆变种。在愈伤组织或植物组织内，细胞中有自然变异。这种体细胞无性系变异取决于细胞群的预先存在的或经培养诱导的变异。这种变异可能是遗传的或表观遗传的。愈伤组织或悬浮培养物中的这些变化对于从悬浮培养物生产次级代谢活性物有显著的益处。因此，基于本发明的目的，选择生长速度快、有稳定的性状(如颜色和大小)、生长速率恒定及有其他相关品质的传代培养细胞系。
[0032]被确定为稳定的细胞系后，来自固体培养基上的细胞，即，全能性的、未分化的植物细胞，被接种到液态营养基中。对于本领域技术人员，该液态营养基是公知的。其包含诸如Murashige & Skoog培养基、鹿糖、Gamborg维生素、如IAA之类的生长素、以及激动素等要素成分。
[0033]在一种实施方式中，在存在用于引出次生植物细胞代谢物的表达的化学的、气体的、或能量应激的情况下，能让细胞在液态营养培养基中生长。
[0034]虽然可使用各种化学或能量应激来诱导次生代谢产物的生产，但臭氧是优选的应激原，因为通过用于将细胞保持在反应器中的氧气环境中的氧气进给源，很容易将臭氧引入细胞培养物中。
[0035]暴露于臭氧有助于促进细胞合成更多的次级代谢产物。本发明的次级代谢产物包括但不限于:植物生长调节剂、植物细胞因子、黄酮类、类胡萝卜素、植物留醇、皂甙、芥子油苷、蛋白酶抑制剂、植物雌激素、硫化物、肌醇六酸、生物碱、萜类化合物、甙类、酚类、吩嗪、多酮类化合物、多肽、多酚等。
[0036]在一定的阈值下，来自臭氧的适度应激可通过植物补偿，导致产生出更多的活性成分。然而，在较高的水平下，重度应激的不利影响可能会造成不可逆转的损害。此外，应激容限阈值不仅取决于臭氧条件下的应激原类型和曝光时间，而且取决于特定物种植物的应激应对能力。优化施加到稻米悬浮培养物的臭氧量以获得特定的应激相关的结果，这是可能的。可用于本发明的典型的臭氧水平可以是在0.0001到50mM之间的范围内。更优选的臭氧水平是在0.01mM至5mM之间的范围内。最优选的臭氧水平是在0.1mM至0.5mM之间的范围内。可以根据植物的种类、臭氧浓度、曝气量、温度等将植物细胞暴露在臭氧中持续若干分钟至若干天。
[0037]另一种监测植物分生组织条件营养培养基发酵过程中的氧化应激的方法是应用臭氧，直到一定数量的植物 细胞已经死亡。测量植物细胞活力的方法对本领域的技术人员而言是公知的，并且可以包括，例如，MTT法，这是一种比色分析法，其证明有活性的线粒体功能，从而证明是活的细胞而不是死的细胞。一种在应用臭氧应激后优选的细胞存活率计数将是50%、更优选的水平是75%，最优选的水平是80%的植物细胞存活率。
[0038]市售的用于植物细胞的臭氧处理的臭氧产生器可以在例如Erwin SanderElektroapparatebau GmbH, Uetze-Eltze (德国)找到。在大多数情况下，除了臭氧发生器还使用臭氧检测器。合适的臭氧检测器能从Dasibi，Glandlae，加利福尼亚得到。
[0039]虽然臭氧在这里被描述作为优选的应激原，但也可以使用本领域的技术人员公知的其他应激原，以诱导次生代谢产物。这些应激原包括，但不限于，植物生长调节剂、植物病原体蛋白质、和如几丁质之类的聚合物以及各种形式的外部能量，包括但不限于热和紫外线辐射。
[0040]允许这些细胞生长一定长的时间，直到获得足够量的生物量。如果有必要，可以加入新鲜的液态营养培养基。在一种实施方式中，允许细胞生长到100-400的光密度，在这之后，收获生物量以及进行提取以提供植物分生组织条件营养培养基。提取过程对于本领域技术人员是已知的，例如，可以过滤掉不溶性成分并且所得到的可溶成分为植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)。
[0041]不被任何理论所束缚，据说通过植物细胞生长，这些细胞能通过代谢营养培养基中的化合物并将这些代谢物以及其他各种植物细胞产生的化合物一起排泄到些该营养培养基中，从而调整该营养培养基。由于植物组织的最初来源是植物的分生组织，因此，就本专利申请的目的而言，条件培养基被称为“植物分生组织条件营养培养基”。
[0042]如有必要，这样获得的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)可以通过本领域技术人员公知的方法进一步处理，以改善颜色或气味，或浓缩或甚至完全干燥该产品。
[0043]可以通过将植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)包括在诸如，例如，脂质体、尼亚质体(niasomes)、聚合质体(polymerisomes)、枝状质体(dendrimerosomes)等运输系统中，或通过诸如例如离子电渗疗法等渗透增强机制,而进一步提高该培养基的疗效。[0044]也可通过在本领域技术人员公知的，诸如例如冷冻式干燥法、喷射式干燥法、带式干燥法之类的任何方法，去除提取溶剂，而使植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)包括在无水体系中。对于无水的形式，培养基可以被包括在无水凝胶(诸如，例如，硅酮凝胶)中或在无水粉末(诸如，例如，底粉和粉饼)中。
[0045]植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)适合用于本发明的外用组合物中。此外，通过额外的植物或微生物发酵，该条件培养基还可以是用于进一步的修饰物的基础物，其中植物分生组织营养培养基作为二次发酵营养源加入到正在进行的发酵工艺中。
[0046]本发明的外用组合物的组分(b)是以相对于组分(a)(植物分生组织条件营养培养基)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂。
[0047]防腐剂对于本领域技术人员而言是公知的，并且可以包括例如以下成分:如有机酸，诸如，例如，水杨酸或山梨酸；有机醇，诸如，例如，苯氧乙醇、苄醇、乙二醇和乙醇；四元成分(quaternary ingredients),诸如，例如，季铵-15 ;酶，诸如，例如，组合有底物的葡萄糖氧化酶和乳过氧化物酶，该底物如由Arch Personal Care (南平原镇,新泽西)以Biovert市售的葡萄糖等；或这些防腐剂的组合。
[0048]优选的防腐剂选自由水杨酸、山梨酸、苯氧乙醇、苄醇、乙醇、季铵盐-15、组合有底物的葡萄糖氧化酶和乳过氧化物酶、以及它们的组合组成的群组中。
[0049]应以足以作为实质上对植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)进行灭菌的抗生素或作为使植物分生组织条件营养培养基保持在使得该培养基中的活体微生物不会繁殖的状态的生物稳定剂的浓度向植物分生组织条件营养培养基添加防腐剂。确定防腐系统的功效的方法对于本【技术领域】的技术人员而言是公知的。最常用的防腐效力测试的方法被称为挑战(chalIenge)测试。在这种测试方法中，微生物以受控方式被导入液态植物分生组织条件营养培养基中，并被允许在培养基上试验和生长。如果微生物水平在规定的时间内减少或保持不变，则认为该培养基受到充分保护，不受微生物污染。
[0050]特别优选的防腐剂是苯氧乙醇。
[0051]防腐剂，特别是苯氧乙醇，优选以占组合物的至少0.5% (重量)、更优选为1.0%(重量)、最优选1.2% (重量)的量使用。
[0052]如果所述产品被分离作为固体，则还可能会要求防腐剂将所述产品保持足够长久，以便对所述产品进行干燥，并且在干燥过程后防腐剂将保持在粉末状的该产品中。干燥的方法对于本领域技术人员而言是公知的，并且可以包括，例如，喷射式干燥、冷冻式干燥、转鼓式干燥、薄膜式干燥等。特别优选的干燥方法是喷射式干燥方法，其例如在US2003/0198682A1 中被公开。
[0053]上面已经描述了组分(a)及(b)。本发明的组合物中的组分(C)是一种皮肤病学上可接受的赋形剂。如本文所用的短语“皮肤病学上可接受的赋形剂”意指适于外用于皮肤、具有良好的美学特性、与本发明的活性成分和任何其他组分兼容、并且不会造成任何难以处理的安全性或毒性问题的赋形剂。
[0054]赋形剂可以是各种各样的形式。例如，可用于本发明的乳状液的载体，其包括但并不限于，水包油型乳状液、油包水型乳状液、水包油包水型乳状液、以及有机硅包水包油型乳状液。这些乳状液可以涵盖广范围的粘度，例如，从约100厘泊至约200,000厘泊。也可以使用常规的推进剂、利用机械泵容器或加压的喷雾器容器以喷雾的形式输送这些乳状液。这些载体也可以摩丝的形式输送。其它适宜的外用载体包括:无水液体溶剂,例如油、醇、有机娃(例如，矿物油、乙醇、异丙醇、聚二甲基硅氧烷、环聚二甲基硅氧烷等)；/Κ基单相液体溶剂(例如，水-醇溶剂系统)；这些无水和水基单相溶剂的增粘型(例如，其中，溶剂的粘度增大到通过加入适当的树胶、树脂、蜡、聚合物、盐等以形成固体物或半固体物)。可使用在本发明的载体系统中的实施例在以下四个参考文献中有描述:“Sun ProductsFormulary^Cosmetics & Toiletries, 105卷，122 - 139页(1990年 12月)；“Sun ProductsFormulary，，，Cosmetics & Toiletries, 102 卷，117 - 136 页(1987 年 3 月)；Figueroa 等的美国专利N0.4，960，764 ;以及Fukuda等的美国专利N0.4，254，105。
[0055]在授权给Blank等的美国专利N0.5, 605, 894和在授权给Bissett的美国专利N0.5，681，852中发现有对合适的赋形剂的更详细的讨论。赋形剂也可以是粉末型的外用组合物，诸如，例如，粉末状粉底。
[0056]此外，本发明的外用组合物可以可选地包含其他功能性成分，例如，水、表面活性剂、乳化剂、调理剂、润肤剂、蜡、油、聚合物、增粘剂、固定剂、着色剂、湿润剂、保湿剂、稳定剂、稀释剂、溶剂、香料等，以及活性成分，诸如，例如植物性物质(botanicals)、营养素(neutraceuticals)、药妆品、治疗剂、药剂、抗真菌剂、抗微生物、留体类激素、去头屑剂、抗粉刺组分、防晒剂、防腐剂等等。
[0057]本发明的外用组合物可以是本领域技术人员已知的任何形式，例如，霜剂、洗剂、凝胶、乳清剂、皂剂、粘剂、粉末或类似物。组合物可以应用于作为免洗型产品或作为拟在应用后立即从皮肤清洗掉的产品(这样的产品包括沐浴液，洗发液等之类的东西)。
[0058]已经令人惊讶地发现，应用本发明的外用组合物可以影响与年龄有关的遗传学改变及延迟和减轻皮肤的老化的某些方面。通过局部应用含有植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)组合物，已经令人惊奇地发现，可以以使老化细胞经历转型并重新获得他们的更年轻的未老化细胞所具有的DNA CpG甲基化模式这样的方式来调节DNA甲基化。在基因组水平以及在特定的基因的DNA甲基化模式可以通过应用植物分生组织条件营养培养基进行调节。基因组和单个基因的识别具有可逆的甲基化状态，并且植物分生组织条件营养培养基可以影响皮肤细胞的甲基化状态，产生新的局部治疗机会。
[0059]虽然基因组在两个个体中可能是完全一样的，但是通过表观遗传修饰进行的调控基因表达可以在有机体或组织的寿命和健康之间的巨大差异性方面发挥作用。通过调节细胞的DNA甲基化模式，可以获得潜在地治疗脱发、皮肤炎症状态、色素沉着与老年斑、皱纹、与老化有关的皮肤干燥、失去弹性和皮肤纹理以及其它疾病的机会。
[0060]表观遗传的模式化和维护对于正常细胞运行是非常重要的。通过分析年轻的和老化的皮肤组织的CpG甲基化，可以注意到老化和UVB照射在甲基化变化方面的特征。由于老化和甲基化之间的最强的正相关性发生在基因的启动子区域中的CpG岛内的位置，因此关于植物分生组织条件营养培养基的功效的研究集中在这些重要位点的甲基化。
[0061]在另一实施方式中，本发明还涉及一种组合物浓缩物，该浓缩物包括:(a)来自水稻属植物的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)，(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂，其中按重量计，组分(a)以所述组合物的介于0.0000001%至99%之间的量存在，优选以介于90%至99%之间、并且更优选以介于97%至99%之间的量存在；并且按重量计，组分(b)以所述组合物的介于
0.01%至10%之间的量存在，更优选以介于0.1%至5%之间、并且最优选以介于0.4%至2%之间的量存在。
[0062]在一优选的实施方式中，组合物浓缩物的组分(a)是来自于水稻植物的植物分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)。
[0063]本发明的组合物浓缩物可适合通过本领域技术人员已知的任何方法并入如上所述的外用组合物中。
[0064]然而，本发明的另一实施方式是用于制备本发明的组合物的工艺，所述方法包含以下步骤:
(i)提供来自于稻属植物的全能性的、未分化的植物细胞；
(ii)使所述植物细胞在存在或不存在化学的、气体的、或能量的应激的情况下，在液态营养培养基中生长，以产生含有水溶性组分和水不溶性组分的混合物，所述应激用于得到次级植物细胞代谢物的表达，
(iii)除去所述水不溶性组分，以产生所述植物分生组织条件营养培养基，以及
(iv)将所述植物分生组织条件营养培养基与防腐剂以及皮肤病学上可接受的赋形剂混合，从而制造出本发明的组合物。
[0065]在该工艺的优选的实施方式中，步骤(i)的植物细胞来自于水稻植物。
[0066]在该工艺的另一优选实施方式中，在步骤(ii)，植物细胞在存在臭氧的情况下生长。
[0067]在该工艺的一个特别优选的实施方式中，步骤(i)的植物细胞通过包括以下步骤的方法制备:
(1)使来自于所述稻属植物的植物分生组织在固态营养培养基中生长；以及
(2)选择稳定的培养物，从而产生所述植物细胞。
[0068]然而，本发明的另一实施方式是一种用于控制人类皮肤细胞中的DNA甲基化的方法，该方法包括使皮肤与包含下述组分的局部用组合物接触:
(a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基，
(b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；以及 (C)皮肤病学上可接受的赋形剂。
[0069]用于控制在人体皮肤细胞中的DNA甲基化的上述方法优选是非治疗性的方法，例如，化妆的方法。[0070]本发明进一步在下面给出的实施例中描述。以下实施例用来说明本发明的范围而不以任何方式限制本发明的权利要求。除另有说明，否则此处给出的所有百分数都是基于所述组合物的总重量计算的重量百分数。
[0071]实施例1:
[0072]从水稻(稻米(rice))生产植物分生组织条件营养培养基
[0073]让稻米分生组织培养物在固态培养基(Murashigie & Skoog与GamborglX维生素，30克/升蔗糖，I毫克/升激动素，0.2毫克/升IAAjP 1%琼脂，pH为5.6)上生长，并传代培养至少三个月。将来自相同培养物系的愈伤组织接种到多个含有约60毫升无琼脂的上述培养基的250mL烧瓶中。两周后，将培养物移到含有约130毫升的液态营养基的500mL烧瓶中，该液态营养基包含:Murashige & Skoog培养基，GamborglX维生素,30克/升蔗糖，I毫克/升激动素，0.2毫克/升IAA，pH为5.6。两周后，将培养物移到含有约300mL的液态营养基的I升烧瓶中。培养发酵14天之后，将600mL的培养物移到具有2.3升工作容积的3升的生物反应器中。发酵三周后，将5升的培养物移入具有22升的工作容积的30升的生物反应器中。在发酵三周后，将40升的培养物移到具有200升的工作容积的250升的生物反应器中。发酵四周后，将200升培养基移到具有总计400升的液态营养基的1000升的生物反应器中。经过2周的发酵后，加入350升的新鲜培养基以使总体积达到750升。让培养物生长2周，然后将0.5ppm的臭氧加入到空气管线中。让培养物再额外生长一周以产生次级代谢产物，然后，使用Niix)均质机将培养物均质化并过滤，以除去固体物质。所得到的物质被称为稻米分生组织条件营养培养基(植物分生组织细胞悬浮液提取物)或简称为稻米培养物。
[0074]实施例 2:
[0075]实施例1的臭氧施加应激的稻米分生组织条件营养培养基的HPLC色谱图
[0076]对实施例1的分生组织条件营养培养基提取物进行HPLC分析。多个峰被观察到，但只有一个峰是来自生物素，这表明臭氧会导致稻米培养物产生次级代谢产物。使用Phenomenex Kinetex2.6微米，100X4.6毫米柱进行分析。溶剂A为甲醇。溶剂B为50mM的磷酸钠(PH4.5)。等度洗脱地(isocratically)使用10%的溶剂A和使用90%的溶剂B。流率为1.0毫升每分钟，柱温为30°C。在200nm波长进行检测。HPLC分析结果示于图1中。
[0077]实施例3:
[0078]无臭氧施加应激的稻米分生组织条件营养培养基的HPLC色谱图
[0079]根据实施例1的步骤制备稻米分生组织提取物，但不添加臭氧。在实施例1中所描述的条件下进行HPLC分析。其结果示于图2中。如该图2所示，观察到很少的次级代谢物峰。
[0080]实施例4:
[0081]应用实施例1的经臭氧处理的稻米分生组织条件营养培养基,在体外(in vitro)生长的成纤维细胞中，在所有基因启动子基因组范围处的平均CpG甲基化下降。
[0082]如上所述，年轻细胞的一个重要特点是与较老的细胞相比，它们具有低的甲基化水平。这个实施例表明，施加实施例1的2%的植物分生组织条件营养培养基到体外生长的成纤维细胞的应用，与未处理的对照样本相比，造成基因启动子基因组范围处的甲基化水平下降。
[0083]测试方法概要
[0084]在这项研究中，人类皮肤成纤维细胞或者经过一段组合的内在和外在的老化(顺序细胞传代和反复的UVB照射)期间获得，或者不是老化的。对于内在老化过程而言，成纤维细胞是通过8个细胞培养传代(培养3周)得到的。细胞生长在12孔培养板中，并生长直至汇合(每48至72小时)，收获并按50%的原始细胞密度重新接种，使每个传代大致代表一个群体倍增。对于外在老化方面，每周用UVB对细胞照射三次。虽然这项研究的初衷也是使该组通过8个传代，但这是不可能的。到了第三传代，细胞复制的速度已经放慢到不再能够使细胞传代的地步。该组保持在培养物中持续3周并进行9次UVB照射。
[0085]除了老化处理外，还用在整个老化过程中存在的测试材料对成纤维细胞进行处理。处理组列表如下:
1.非老化细胞(培养几天后收获)
2.内在老化+外在老化
3.内在老化+外在老化+2%的实施例1的稻米培养物
[0086]培养期间结束时，收集细胞培养物培养基并分析其变化。
[0087]方法
[0088]成纤维细胞的 制备及处理
[0089]将成纤维细胞接种到在I毫升的Fibroblast Growth Medium(FGM)中的12孔板的单个的孔中，并且在37 ± 2°C，5 ± I %的CO2下培养，培养基每48至72小时进行更换。达到汇合后，收获细胞，然后按50%的原始密度重新接种。对于在内在加外在老化组中的UVB照射，细胞培养物培养基用磷酸盐缓冲盐水代替，并将细胞曝光于5-7mJ/cm2的UVB。该照射每周进行三次，照射之间的时间至少为24小时。
[0090]如上文所述，将细胞培养3周。在这段时间，内在老化加外在老化组经历了 3个群体倍增和9次UVB曝光。在三周的期间结束时，在最后的培养基改变后48小时收集细胞培养物培养基和细胞。细胞用磷酸盐缓冲盐水漂洗，以除去任何残余的测试材料，然后将200微升的裂解缓冲液(在磷酸盐缓冲生理盐水中制备的ImM EDTA，0.5%的Triton X-100，IOmM的氟化钠，150mM的氯化钠，20mM的β -磷酸甘油，ImM的DTT，10微克/毫升亮肽素，10微克/毫升胃蛋白酶抑制素，3微克/毫升抑肽酶)加入至每孔。将细胞在冰上孵育约15分钟以使其完全裂解。然后收集溶胞产物，并贮存于_75°C直至分析。
[0091]甲基化阵列报告
[0092]DNA CpG甲基化阵列芯片产自安捷伦(Agilent)，并且覆盖27，627个CpG岛。对于该阵列，总基因组DNA(5微克)从体外成纤维细胞分离出，然后剪切成片段(约400至800个碱基长度)。这5微克的剪切基因组DNA的样品中，I微克的总基因组DNA被搁置，而余下的4微克被用来隔离甲基化DNA。甲基化DNA使用具有专用于甲基化DNA的抗体的免疫-沉淀物分离。所述I微克的总基因组DNA和甲基化DNA然后进行荧光标记，并应用到DNA甲基化阵列。杂交后，然后扫描该阵列，然后确定在阵列上的特征的荧光强度。将在所有的基因启动子的所有的CpG位点的值进行平均，以确定平均值。结果列于图3中。
[0093]图3中的数据表明，相比未经处理的类似细胞，2%的稻米分生组织条件营养培养基的局部应用显示内在地和外在地老化的成纤维细胞中的启动子区域中的总的CpG甲基化下降。
[0094]实施例5:
[0095]使用实施例1的经臭氧处理的稻米分生组织条件营养培养基，在体外生长的成纤维细胞中的胶原蛋白IAl启动子的平均CpG甲基化水平下降。
[0096]在老化过程中已增加启动子甲基化水平的基因之一是胶原蛋白IAl (Takatsu等，1999)。这个实施例说明，向体外生长的成纤维细胞应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基造成该细胞与未经处理的类似细胞相比，其胶原蛋白IAl基因启动子的甲基化水平下降。检测如上所述进行。对胶原蛋白IAl启动子中的所有CpG位点的甲基化水平进行平均，得到平均值。结果列于图4中。
[0097]图4中的数据表明，与未经处理的相似细胞相比，局部应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基显示在已内在和外在老化的细胞中，胶原蛋白IAl基因启动子的DNA CpG甲基化水平下降。
[0098]实施例6:[0099]使用实施例1的经臭氧处理的稻米分生组织条件营养培养基，在体外生长的成纤维细胞中的胶原蛋白1A2启动子的平均CpG甲基化水平下降。
[0100]这个实施例说明，向体外生长的成纤维细胞应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基造成该细胞其胶原蛋白1A2基因启动子的甲基化水平下降。检测如上所述进行。对胶原蛋白1A2启动子中的所有CpG位点的甲基化水平进行平均，得到平均值。结果列于图5中。
[0101]图5中的数据表明，与未经处理的相似细胞相比，局部应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基显示在已内在和外在老化的细胞中，胶原蛋白1A2基因启动子的DNA CpG甲基化水平下降。
[0102]实施例7:
[0103]使用实施例1的经臭氧处理的稻米分生组织条件营养培养基，在体外生长的成纤维细胞中的胶原蛋白水平提高。
[0104]这个实施例说明，向体外成纤维细胞应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基造成该细胞其胶原蛋白的产量增加。如上所述，让细胞生长并对其处理。对在24小时时间点收集的培养基样品和在48小时时间点收集的培养基两者的胶原蛋白进行检测。对于该检测，制备范围从O毫微克/毫升到640毫微克/毫升的一系列型I C-肽的标准值。接着，通过从板框架去除任何不需要的条带，制备ELISA微孔板，然后对在试验中所使用的每一个孔添加100微升的过氧化物酶标记的抗型前胶原蛋白1-C肽抗体。然后，将二十(20)微升的样品(收集的组织培养液培养基)或标准物加入适当的孔中，并覆盖微孔板，在37°C下将其孵育3±0.25小时。在孵育后，对孔进行抽取并用400微升的洗涤缓冲液将其洗涤三次。将最后的洗涤物去除后，向每个孔中添加100微升的过氧化物酶底物溶液(过氧化氢+四甲基联苯胺作为色原体)，并在室温下将板孵育15±5分钟。孵育后，将100微升的停止溶液(IN硫酸)加入到各孔中，并用酶标仪在450nm处读取板。结果列于图6中。
[0105]图6中的数据表明:相比于未经处理的类似生长的细胞，局部应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基显示已内在地和外在地老化的细胞中的IA型胶原蛋白增加了。
[0106]实施例8:
[0107]应用实施例1的经臭氧处理的稻米分生组织条件营养培养基，在体外生长的成纤维细胞中的皮连蛋白(Dermatopontin)的蛋白水平增加。
[0108]这个实施例说明，应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基到体外生长的成纤维细胞中导致该细胞增加其皮连蛋白的产量。细胞生长并如上处理。使用免疫印迹法检测皮连蛋白的蛋白水平。
[0109]细胞裂解液的微滤渗透和免疫检测
[0110]膜在Tris缓冲液(TBS:20mM Tris, pH7.5，150mM NaCl)中平衡，并装配到Bio-Dot微滤装置中。装配后，将200微升的TBS溶液加入到在Bio-Dot中使用的各孔并施加真空以确保有充足的流量通过所有孔。接着，各细胞裂解物样品(约5微克)被分配在该装置的孔中以及应用于合适的孔中。在低真空下对样品进行过滤。将TBS溶液加入未分配到样品的孔中，以确保膜在操作过程中不干燥。在渗透过程结束时，另外的200微升TBS被施加，并过滤通过各孔。然后将膜从Bio-Dot装置去除，在TBS中洗涤5-10分钟，然后放入封闭溶液(Tris缓冲盐溶液[20mM Tris, pH7.5，150mM NaCl, 1%的非脂奶粉])，并让其在摆动平台上在室温下孵育至少I小时。
[0111]抗体孵育和检测
[0112]封闭后，将膜转移到具有适当稀释的检测抗体的20毫升的TBST(含0.1%Tween-20的TBS)和0.1 %的脱脂奶粉中，并让其在摆动平台上在4°C下孵育过夜。孵育后，在TBST中洗涤膜3次(IX 15分钟和2X5分钟)。在室温下，在15毫升含0.1 %非脂奶粉的TBST中利用该膜孵育次级抗体(与荧光共轭)，持续I小时，然后用TBS洗涤3次(I X 15分钟，2X5分钟)。
[0113]最后一次洗涤后，将膜放置到BioRad Molecular Imager FX中，并使用适合于荧光的激发激光器和发射过滤器的组合扫描。使用ImageJ图像分析软件对用扫描仪产生的图像进行分析。结果列于图7中。
[0114]图7中的数据显示，与在类似的条件下生长的未处理的细胞相比，对老化细胞局部应用实施例1的2%的稻米分生组织条件营养培养基导致皮连蛋白的表达的显著增强。
[0115]实施例9:
[0116]水包油型乳状液
[0117]使用下面的配方和工艺将实施例1 (稻米培养物)的稻米分生组织条件营养培养基配制成水包油型乳状液:
【权利要求】
1.一种用于控制人类皮肤细胞中的DNA甲基化的外用组合物，其包括: (a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基， (b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；以及 (C)皮肤病学上可接受的赋形剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中按重量计，组分(a)以所述组合物的介于0.0000001 %至99%之间的量存在，优选以介于0.0001 %至50%之间、更优选以介于0.001%至25%之间、并且最优选以介于0.01%至10%之间的量存在；按重量计，组分(b)以所述组合物的介于0.0I %至10 %之间的量存在，更优选以介于0.1 %至5 %之间、并且最优选以介于0.4%至2%之间的量存在；且按重量计，组分(c)以所述组合物的介于1%至98 %之间的量存在，并且最优选以介于80 %至90 %之间的量存在。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中组分(a)来自水稻植物的植物分生组织条件营养培养基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述植物分生组织条件营养培养基通过下述步骤制备:(i)使来自于所述稻属植物的分生组织在液态营养培养基中生长，以产生含有水溶性组分和水不溶性组分的混合物，以及(ii)除去所述水不溶性组分，从而产生所述植物分生组织条件营养培养基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述植物分生组织在化学的、气体的、或能量的应激的存在下，在液态营养培养基中生长，所述应激用于得到次级植物细胞代谢物的表达。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述植物分生组织细胞在臭氧的存在下，在液态营养培养基中生长。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述防腐剂选自由水杨酸、山梨酸、苯氧乙醇、苄醇、乙醇、季铵盐-15、组合有底物的葡萄糖氧化酶和乳过氧化物酶、以及它们的组合组成的群组中。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述防腐剂为苯氧乙醇。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中基于所述组合物的总重量，所述防腐剂以所述组合物的至少0.5wt%的量存在。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其还包括至少一种成分，该成分选自:水、表面活性剂、乳化剂、调理剂、软化剂、蜡、油、聚合物、增粘剂、固定剂、着色剂、湿润剂、保湿剂、稳定剂、稀释剂、溶剂、香料、植物性物质、营养素、药妆品、治疗剂、药物、抗真菌剂、抗微生物剂、留体类激素、去头屑剂、抗痤疮组分、防晒剂、防腐剂、以及它们的组合。
11.一种组合物浓缩物，其包括: (a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基，和 (b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；其中按重量计，组分(a)以所述组合物的介于0.0000001%至99%之间的量存在，优选以介于90%到99%之间、更优选以介于97%至99%之间的量存在；并且按重量计，组分(b)以所述组合物的介于0.0I %至10 %之间的量存在，更优选以介于0.1 %至5 %之间、并且最优选以介于0.4%至2%之间的量存在。
12.根据权利要求11所述的组合物浓缩物，其中组分(a)是来自水稻植物的植物分生组织条件营养培养基。
13.一种用于制备根据权利要求1所述的组合物的方法，其包括以下步骤: (i)提供来自于稻属植物的全能性的、未分化的植物细胞； (?)使所述植物细胞在存在或不存在化学的、气体的、或能量的应激的情况下，在液态营养培养基中生长，以产生含有水溶性组分和水不溶性组分的混合物，所述应激用于得到次级植物细胞代谢物的表达， (iii)除去所述水不溶性组分，以产生所述植物分生组织条件营养培养基，以及 (iv)使所述植物分生组织条件营养培养基与防腐剂以及皮肤病学上可接受的赋形剂混合，从而制造出根据权利要求1所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，步骤(i)中的所述植物细胞来自于水稻植物。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中在步骤(ii)中，所述植物细胞在臭氧的存在下生长。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述植物细胞通过包括下述步骤的方法制备: (1)使来自于所述稻属植物的植物分生组织在固态营养培养基中生长；以及 (2)选择稳定的培养物，从而生产所述植物细胞。
17.一种用于控制人类皮肤细胞中的DNA甲基化的方法，该方法包括使皮肤与包含下述组分的外用组合物 接触: (a)来自稻属植物的植物分生组织条件营养培养基， (b)以相对于组分(a)足以提供灭菌或生物稳定疗效的量存在的防腐剂；以及 (C)皮肤病学上可接受的赋形剂。
【文档编号】A61K8/97GK103841956SQ201280025287
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年3月26日 优先权日:2011年3月27日
【发明者】詹姆斯·文森特·格鲁伯, 菲利普·雷德特·路德维格 申请人:奥麒化工有限公司