用于治疗IFNα相关病况的方法
【专利摘要】本发明涉及一种包含与载体蛋白分子偶联的IFNα的免疫原性产物及其用于治疗IFNα相关病况的用途，所述免疫原性产物能够在体内诱导抗-IFNα抗体。
【专利说明】用于治疗IFNa相关病况的方法
发明领域 [0001] 本发明涉及一种免疫原性疫苗及其用于治疗IFNa相关病况例如系统性红斑狼疮的用途。
[0002]发明背景
[0003]I 型 IFN 家族包括 IFNa、IFNP、IFNS、IFN1、IFNk、IFNt 和 IFNco。主要形式是IFNa和单个IFN0，其中IFNa在人中描述了 13种紧密联系的蛋白。尽管事实上不同的I型IFN形式可促进不同的生物学应答，但所有的I型IFN在结构上是相关的(其基因缺少内含子并且位于9号染色体的短臂上)并且通过相同的受体亚基转导信号(VanBoxel-Dezaire 等，Immunity 2006 ；25:361-372)。
[0004]如今I型IFN与自身免疫性病症之间的联系的兴趣日益增加，因为其被诱导的信号，所谓的干扰素标记(signature)，最近已报道于患有不同的自身免疫性疾病的患者中(Baccala等Immunol Rev 2005;204:9-26)。事实上，由于其免疫调制剂作用，I型IFN似乎涉及各种自身免疫性病况的数种致病途径。
[0005]自身免疫中I型IFN致病相关性的范例为系统性红斑狼疮(SLE)。SLE是一种慢性疾病，其特征在于多器官累及，这归因于由针对自身抗原的自身抗体所导致的器官反常的损伤。SLE的病因复杂,涉及遗传因素和环境因素。SLE中IFNa的血清水平显示与疾病的严重性相关(Dali，era 等 Ann Rheum Dis 2005 ；64:1692-7)。
[0006]干燥综合征(Sjdgreifs syndrome (SS)),也被称作舍格伦综合征(sicca
syndrome),是影响外分泌腺,尤其是唾液腺和泪腺的慢性、全身性的自身免疫性病况。在患有该疾病的患者的血清中也已观察到升高的IFNa活性。最后，其它病况例如糖尿病、类风湿性关节炎、硬皮病、脉管炎和自身免疫性甲状腺炎也已显示出与IFNa的高水平相关。
[0007]Sedaghat等近来也提示I型IFN可能在HIV+患者中CD4+T细胞的缺失中起作用，因为他们显示I型IFN通过使平衡偏移向为短寿细胞的Thl效应物而非长寿记忆性T细胞来影响正常 CD4+T 细胞的稳态(Sedaghat 等 J.Virol.2008,82(4):1870-1883)。这在 Mandl等中被确认，其中提示了消除由浆细胞样树突状细胞的IFNa产生以缓解病理的免疫激活(Mandl 等 Nat.Med.2008)。
[0008]此外，已报道IFNa的施用加剧了患有牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎和多发性硬化症的患者中的潜在疾病并在无自身免疫性疾病既往史的患者中诱导了 SLE样综合征。
[0009]因此，有抑制IFNa活性的药物的需要。
[0010]目前在临床试验中正在用罗利珠单抗(rontalizumab)和西法木单抗(sifalimumab)测试利用单克隆中和抗体的被动免疫用于SLE的治疗。然而,所述治疗具有对于IFNa来说仅靶向这13个子集的一个子集的缺点并且被动施用单克隆抗体的用途可被抗药物抗体的诱导所限制。所述抗药物抗体可中和或以其他方式降低药物的临床疗效并且还可伴有与自体蛋白交叉反应相关的严重不良事件(De Groot等Trends.1mmunol.2007,28 (11))。
[0011]因此本发明提供了通过施用治疗有效量的免疫原性产物在体内抑制IFNa活性的方法及其用于治疗IFN α相关病况的用途，所述免疫原性产物允许主动免疫，其可打破B细胞的免疫耐受并产生高滴度的针对IFNa的多克隆中和抗体。
【发明内容】
[0012]本发明的一个目标是包含与载体蛋白分子偶联的IFNa的免疫原性产物，用于预防或治疗需要其的受试对象中的IFNa相关病况，其中待施用给受试对象的免疫原性产物的治疗有效量为每次施用高于30mcg、优选至少60mcg的免疫原性产物。
[0013]在本发明的一个实施方案中，所述治疗有效量的免疫原性产物的施用防止与IFNa的过量产生相关的疾病症状的发生。
[0014]在本发明的另一个实施方案中，所述治疗有效量的免疫原性产物的施用防止与IFNa的过量产生相关的疾病的爆发。
[0015]在本发明的另一个实施方案中，所述IFNa相关病况包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
[0016]在本发明的另一个实施方案中，待施用给受试对象的免疫原性产物的治疗有效量为每次施用35mcg-1000mcg,优选60mcg-1000mcg的免疫原性产物。
[0017]在本发明的另一个实施方案中，将所述免疫原性产物在一个月内至少两次施用给受试对象。
[0018]在本发明的另一个实施方案中，将所述免疫原性产物每三个月另外施用给受试对象至少一次。
[0019]在本发明的另一个实施方案中，当在从受试对象获得的血清样品中检不出抗-1FNa抗体的量时，将所述免疫原性产物另外施用给所述受试对象。
[0020]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物是强烈失活的，其意味着所述产物在测试B的条件中显示低于5%的抗病毒活性。
[0021]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物在测试C的条件中能够中和IFNa的抗病毒活性。
[0022]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含至少一种亚型的IFNa。
[0023]在本发明的另一个实施方案中，所述IFNa的亚型为IFNa 2b并且所述载体蛋白分子为KLH。
[0024]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物为疫苗，优选呈乳剂的形式。
[0025]本发明的另一个目标是包含高于30mcg的免疫原性产物的单位剂型，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNa。
[0026]本发明的另一个目标是包含高于30mcg的免疫原性产物的医疗装置，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNa。
[0027]本发明的另一个目标为一种试剂盒，其含:至少一个包含高于30mcg、优选至少60mcg的免疫原性产物的小瓶，所述免疫原性产物包含如上文定义的与载体蛋白分子偶联的IFNa ;至少一个包含佐剂的小瓶；以及用于使所述免疫原性产物与所述佐剂接触和用于乳化水性溶液与所述佐剂的混合物的工具。
[0028]在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含
[0029]-至少一个包含高于30mcg、优选至少60mcg的根据本发明的免疫原性产物的小瓶，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNa ;以及用于溶解所述免疫原性产物优选于水性溶液中的工具，或者
[0030]-至少一个包含溶液、优选水性溶液的小瓶，所述溶液、优选水性溶液包含高于30mcg、优选至少60mcg的根据本发明的免疫原性产物，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNa ;和
[0031 ]-至少一个包含佐剂的小瓶；以及用于使所述溶液与所述佐剂接触和用于乳化所述溶液与所述佐剂的混合物的工具。
[0032]定义
[0033]本文所用术语“干扰素a，，或“ IFN a，，是指与IFN a I (Genbank号NP_076918或由Genbank号NM_024013编码的蛋白)具有75 %或更高序列同一性的由干扰素α基因座的功能基因编码的IFNa蛋白。人IFNa亚型的实例包括:IFNa I (Genbank号NP_076918)、IFN a 2a(Genbank 号 ITF_A)、IFN a 2b (Genbank 号 AAP20099) ,IFN α 4 (Genbank号ΝΡ_066546) ,IFN α 5 (Genbank 号Ρ01569) ,IFN α 6 (Ρ05013)、IFN α 7 (Genbank 号Ρ01567)、IFN α 8 (Genbank 号 Ρ32881)、IFN α 10 (Genbank 号 Ρ01566)、IFN α 14 (Genbank 号 Ρ01570)、IFNa 16 (Genbank 号 ΝΡ_002164)、IFNa 17 (Genbank 号 Ρ01571)和 IFN α 21 (Genbank 号NP_002166)。如本领域技术人员众所周知的，非人的哺乳动物IFNa亚型的实例可见于Genbank (综述参见 Pestka 等 Immunological reviews 2004,202:8-32)。
[0034]本文所用术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原递呈细胞、吞噬细胞以及由以上细胞或肝脏产生的大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的活动。
[0035]本文所用“抑制IFN α的生物活性”或“中和IFN α的生物活性”的抗体意指例如通过使用功能性测定例如实施例中所述的那些，与不存在所述抗体的情况下该细胞因子的活性水平相比，以至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多来抑制该细胞因子的活性的抗体。
[0036]本文所用术语“载体蛋白分子”是指长度为至少15个氨基酸的蛋白或肽，当与IFNa分子部分共价相连以形成异源复合体时，允许大量的IFNa抗原被提呈给B淋巴细胞。
[0037]本文所用术语“受试对象”包括任何的人或非人的哺乳动物，例如灵长类动物、犬、
猫、牛、羊等。
[0038]本文所用术语“患者”是指受IFNa相关病况影响的受试对象。
[0039]本文所用术语“有效量”是指足以导致有益的或所需的临床结果(例如临床症状的改善)的量。
[0040]本文所用术语“治疗”是指临床干预，力图改变待治疗受试对象或待治疗患者疾病的自然病程，并且可用于预防或在临床病理过程期间进行。所需效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、遏制、减少或抑制疾病的任何直接或间接的病理后果、降低疾病的进展速度、改善或缓和疾病状态、并引起缓解、维持缓解状态或改善的预后。
【具体实施方式】
[0041]尽管体内天然存在IFNa的调节物，其调节疾病(例如SLE和SS)中细胞因子水平的能力显得有所不足。本发明的抗-1FNa治疗性免疫的目的旨在提高针对细胞因子的抗体水平，同时增强它们的亲和力和中和活性，从而导致过量的细胞因子的减少并抑制其致病作用，而不干扰其他的代谢过程和生理过程。
[0042]本发明的一个目标是用于治疗需要其的受试对象中IFNa相关病况的方法，所述方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的包含与载体蛋白分子偶联的IFNa的免疫原性产物，其中所述治疗有效量为每次施用高于SOmcg(Ug)的免疫原性产物。
[0043]在本发明的一个实施方案中，所述治疗有效量为每次施用至少60mcg(y g)的免疫原性产物。[0044]在本发明的一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至lOOOmcg、优选高于60mcg至lOOOmcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至750mcg，、优选高于60mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至500mcg、优选高于60mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至450mcg、优选高于60mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至400mcg、优选高于60mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至350mcg、优选高于60mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至300mcg、优选高于60mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至250mcg、优选高于60mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至200mcg、优选高于60mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至150mcg、优选高于60mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为高于30mcg至lOOrncg、优选高于60mcg至lOOrncg。
[0045]在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至lOOOmcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为35mcg至lOOrncg。
[0046]在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至lOOOmcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至lOOrncg。
[0047]在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为从 40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、lOOrncg、llOmcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg、290mcg、300mcg、3lOmcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg 至 400mcg。
[0048]在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg至240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为240mcg。
[0049]在一个实施方案中，所述治疗有效量对应于利用如本领域熟知的Bradford蛋白测定来确定的总蛋白的量。
[0050]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物至少两次。
[0051]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用两次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述受试对象可在第O天给药一次并在第7天和第28天之间第二次给药。在另一个实施方案中，受试对象在第O天给药一次并在第7天和第21天之间第二次给药。在一个实施方案中，受试对象在第O天给药一次并在第28天第二次给药。
[0052]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在一个月内被施用三次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述待治疗的受试对象可在第O天给药一次，在第7天和第14天之间第二次给药并在第21天和第28天之间第三次给药。在一个实施方案中，所述受试对象在第O天给药一次，在第7天第二次给药并在第28天第三次给药。
[0053]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在三个月内被施用四次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。在该实施方案中，所述待治疗的受试对象可在第O天给药一次，在第7天和第14天之间第二次给药，在第21天和第28天之间第三次给药并在第77天和第84天之间第四次给药。在一个实施方案中，受试对象在第O天给药一次，在第7天第二次给药，在第28天第三次给药并在第84天第四次给药。[0054]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0055]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内三次给药，并接着每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0056]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在三个月内四次给药，并接着每三个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0057]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每六个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0058]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每六个月另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0059]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0060]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0061]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每五年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0062]在本发明 的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每五年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0063]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象可每十年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0064]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并接着每十年另外被施用一次如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0065]在本发明的另一个实施方案中，当针对IFN α的抗体的量在从受试对象中获得的血清样品中检不出时，所述待治疗的受试对象可另外被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0066]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象如上文所述在一个月内给药三次或在三个月内给药四次，并当针对IFNa的抗体的量在从所述受试对象中获得的血清样品中检不出时，接着另外被施用如上文所述的治疗有效量的免疫原性产物。
[0067]血清样品中针对IFNa的抗体的量的定量可通过本领域已知的常规方法如抗-1FN的ELISA来进行。
[0068]进行此类方法的一个实例为以下:
[0069]-用IOOng用于制备所述免疫原性产物的IFNα的亚型例如IFN a -2b包被96孔板并在2V _8°C下将板孵育过夜，
[0070]-在37°C下，90分钟期间用封闭缓冲液封闭板，
[0071]-在37°C下,90分钟期间用血清样品和空白(naive)样品库孵育板:以两倍系列稀释典型地稀释血清样品，从稀释200倍起始，至至少8次稀释，
[0072]-用标记的二抗例如与HRP结合的羊抗人的免疫球蛋白孵育板，
[0073]-复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液显色。在终止酶反应后，所得颜色的强度通过分光光度法于492nm处确定。
[0074]各样品的抗IFN滴度表示为平均OD值高于临界值的最小稀释度:
[0075]临界值=空白血清库的平均OD X 2.08
[0076]其中N临界值等于2.08。
[0077]接下来，各样品的抗IFN滴度将表示为平均OD值高于所述临界值的最小稀释度。最初稀释度为200，若在1/200的OD低于所述临界值则患者视为阴性(Mire-Sluis等2004J.Tmmunol Meth.289:1_16)。
[0078]在本发明的一个实施方案中，待治疗的受试对象患有IFNa相关病况。
[0079]在本发明的另一个实施方案中，待治疗的受试对象在血清中显示检不出量的抗-1FNa抗体。
[0080][作用机制]
[0081]本发明还涉及可用于在施用了其的哺乳动物中诱导免疫应答(包括体液免疫应答，其中抗体中和了内源性 细胞因子IFNa的免疫抑制性质、凋亡性质或血管生成性质)的免疫原性产物。
[0082]本发明还涉及用于在需要其的哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括将如上文所述的免疫原性产物施用给所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述免疫应答包括体液免疫应答，其中中和内源性细胞因子的免疫抑制性质、凋亡性质或血管生成性质的抗体被诱导。
[0083]在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物是失活的且是与T辅助刺激外来载体蛋白例如KLH化学偶联的IFNa的免疫原性细胞因子衍生物。所述免疫原性产物具有破坏B细胞对IFN a的耐受而非T细胞对IFN a的耐受的能力。针对自身的辅助性T细胞的耐受通过将IFNa连接所述外来载体蛋白来避免。
[0084]特异性针对IFN a的B细胞在抗原结合后被激活，内吞免疫原性产物，并且载体特异性肽经由主要组织相容性复合体(MHC) II类分子来提呈。在T依赖性抗原的情况下该活化信号不足以诱导B细胞的分化，但由于B细胞加工自身抗原和所述载体抗原，T细胞辅助可通过特异性针对所述自身蛋白或所述载体蛋白的T细胞来实现。由于T细胞的选择是非常严格的，因此没有针对自身抗原的特异性T细胞活化。
[0085]树突状细胞(DC)也可摄取自身抗原和载体分子并经由其MHC II类分子提呈载体特异性肽。因此DC能够激活特异性针对载体的初始T辅助细胞。T辅助细胞反过来能够将载体-特异性T辅助细胞提供给特异性针对自身抗原的B细胞和将载体肽提呈在其MHCII类分子上。
[0086]特异性针对载体的T辅助细胞与特异性针对自身抗原的B细胞相互作用，引发针对自身抗原的正常的抗体应答。
[0087]所述免疫原性产物主要用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的疫苗组合物中。
[0088]更特别地，本发明涉及用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的方法，其包括向受试对象施用治疗有效量的本发明的免疫原性产物的步骤。
[0089]本发明还涉及用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用防止了所述疾病的症状的发生。
[0090]本发明还涉及用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用防止了所述疾病的爆发。
[0091]本发明还涉及用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用诱导了中和内源IFNa活性的抗体的产生。 [0092]本发明还涉及用于治疗与IFNa的过量产生相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物的施用诱导了内源IFNa的活性的中和。
[0093]与IFNa的过量产生相关的疾病的实例包括但不限于:系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
[0094]本发明的另外的目标由诱导抗体产生的方法组成，所述抗体中和受试对象中内源IFNa的活性，所述方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的免疫原性产物的步骤。
[0095][免疫原性产物]
[0096]本发明所用的免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中所述免疫原性产物是失活的。
[0097]本发明所用的免疫原性产物为至少一种重组IFNa亚型和至少一种载体蛋白分子例如KLH之间的复合物，所述复合物通过用戊二醛偶联并随后用甲醛灭活获得。
[0098]在本发明的一个实施方案中，所述载体蛋白分子可为免疫学中常规使用的任何载体分子例如:KLH(钥孔戚血蓝蛋白)、卵清蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、破伤风类毒素、白喉类毒素(toxoid diphteric)、霍乱毒素B、突变的无毒性白喉毒素(CRM197)、脑膜炎奈瑟氏菌外膜囊泡的外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白、铜绿假单胞菌毒素A、病毒样颗粒(VLP)等。在一个优选的实施方案中，所述载体为KLH。优选地，所述KLH起始产物由从对海洋腹足软体动物大锁孔帽贝(Megathura cremulata)的淋巴中提取的高度纯化的KLH。天然产生的KLH —般由二 -十聚体结构组成，其为20个亚基的非共价管状组合体。
[0099]在本发明的另一个实施方案中，重组IFNa亚型可为IFNa 1、IFNa 2a、IFNa 2b、IFN a 4、IFN a 5、IFN a 6、IFN a 7、IFN a 8、IFN a 10、IFN a 14、IFN a 16、IFN a 17 和 IFN a 21中的任何亚型。
[0100]重组IFN a亚型可由本领域已知的常规方法利用如上文所述的来自Genbank的序列来获得。例如，重组IFNa亚型的产生可通过培养包含含有所述IFNa亚型的基因的表达质粒的细胞并接着收获包涵体并最后纯化所述IFNa亚型来进行。
[0101]在本发明的一个实施方案中，重组IFNa亚型为IFNa2b亚型。
[0102]在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物至少包含IFNa 2b亚型。
[0103]在本发明的一个实施方案中，重组IFNa亚型在液态溶液中，优选在呈pH在
3.5-7.8、优选6-7.8的缓冲液中。
[0104]在一个实施方案中，当待治疗的受试对象为人时，所用重组IFNa为人的。
[0105]在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFN a，其中所述免疫原性产物被抗-1FN a抗体识别。[0106]免疫原性产物被抗-1FNa抗体的识别可通过本领域已知的常规方法例如夹心ELISA抗-1FNa/载体蛋白来进行。所述ELISAOIHiD)通过本领域已知的任何比色方法来显色，所述比色方法例如使用生物素标记的检测抗体、聚链霉亲和素HRP扩增体系和邻苯二胺二盐酸盐底物溶液。
[0107]所述方法的一个实例为以下:
[0108]-用捕获抗体例如兔多克隆抗-KLH抗体包被板，
[0109]-在37°C下，90分钟期间用封闭缓冲液(例如含2%酪蛋白的PBS)封闭板，
[0110]-在37°C下，90分钟期间用从250ng/ml至8次两倍稀释的系列稀释的免疫原性产物或阴性对照例如KLH和IFN a孵育板，
[0111]-在37°C下将板用检测抗体例如生物素化的抗-1FNa抗体孵育90分钟，
[0112]-在37°C下，30分钟期间用链霉亲和素-HRP孵育板并在30分钟期间将复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物显色。终止酶反应后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
[0113]当包含所述免疫原性产物的孔的光密度是包含阴性对照的孔的光密度至少10倍高时，本领域的技术人员认为所述免疫原性产物被抗-1FNa抗体识别并且所述免疫原性产物中的IFNa与KLH偶联。
[0114]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中所述免 疫原性产物是强免疫原性的，这意指所述产物在以下测定的测试A的条件中能够在体内诱导抗-1FNa的抗体。
[0115]测试A依据以下方法进行:
[0116]将OJ-1Oyg所述免疫原性产物的总蛋白(如通过Bradford蛋白测定确定)在30天内(优选在第O天和第21天)两次注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前的血清样品)并在第30天至第40天之间、优选在第31天获得血清样品(测试血清样品)。抗-1FNa ELISA如上文所说明的进行。
[0117]简言之，用IOOng用于制备所述免疫原性产物的IFNa亚型例如IFNa-2b包被96孔板并在2°C _8°C孵育过夜。然后将板在37°C下90分钟期间用封闭缓冲液封闭，将以1/2500稀释的100 μ I免疫前样品和从1/2500至8次两倍系列稀释的(免疫前和测试)血清样品加入孔中。最后将标记的抗小鼠免疫球蛋白的二抗例如HRP结合的抗体加入孔中并用本领域中已知的任何比色法例如邻苯二胺二盐酸盐底物溶液将ELISA显色。
[0118]当包含所述测试血清样品的孔的光密度是包含所述免疫前血清样品的孔的光密度的至少2倍高时，本领域的技术人员认为所述免疫原性产物是有免疫原性的，其意指其已在体内诱导了抗-1FNa的抗体。
[0119]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中IFNa是强烈失活的，其意指在下面引用的测定B的条件中所述产物显不出低于5%、优选低于I %的IFNa的抗病毒活性。在一个实施方案中，浓度为500ng/mL或更高的本发明的免疫原性产物在测定B的条件中显示出低于5 %、优选低于I %的浓度在500ng/mL或更高的IFNa的抗病毒活性。
[0120]该测定是基于IFNa对水泡性口炎病毒(VSV)之于马-达氏牛肾(MDBK)细胞的细胞病变效应(CPE)的保护作用。该测定也可利用H印-2C或A549人细胞及EMCV病毒进行。
[0121]测定B依照以下方法进行: [0122]将所述免疫原性产物和用于制备所述免疫原性产物的重组IFNa亚型(阳性对照)各自以至少500ng/ml和至少1000U/ml稀释于基础培养基(补充了 2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠、ImM Hepes的RPMI)中。将50 μ I的免疫原性产物和阳性对照置于96孔板中并以两倍稀释系列稀释于基础培养基中。将含2 X IO4个MDBK细胞的50 μ I细胞培养基(补充有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM Ifepes的RPMI)加入各孔中并将板在37°C、5% CO2下孵育过夜。接着将病毒稀释于基础培养基至至少10倍TCID5tl(组织培养感染剂量50:杀死50%感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并加入100 μ I所述稀释的病毒。接着将板于37°C，5% CO2下孵育过夜。
[0123]在培养结束时，所述MDBK细胞的生活力用本领域熟知的方法来评价。所述方法的一个实例为以下:将2(^ I/孔的 MTS/PMS 溶液(100 μ I MTS/5 μ I PMS ；Promega G5430)加入孔中并将板在37°C、5% CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
[0124]如下计算抗病毒活性的百分比:
[0125]抗病毒活性[ (0D产物-OD病毒)/平均OD细胞-OD病毒)]*100
[0126](?^^表示含所述免疫原性产物或含所述阳性对照(IFNci亚型)的孔的光密度。
[0127]ODfrt表不仅含病毒的对照孔的光密度。
[0128]ODffllfi表示含IFNa和病毒的对照孔的光密度。
[0129]EC5tl值，相对应导致50%抑制病毒介导的死亡的免疫原性产物的量，通过将在生活力/浓度图上的X轴上插入所述EC5tl值来确定。
[0130]对比所述免疫原性产物的EC5tl与所述阳性对照(用于制备所述免疫原性产物的重组IFNa亚型)的EC5tl允许确定所述免疫原性产物是否显示低于5%、优选低于1%的抗病毒活性。
[0131]可计算失活系数EC5(l^/EC5raFNa:当所述免疫原性产物显示出低于5%、优选显示出低于I %的抗病毒活性时，所述失活系数大于20，优选大于100。
[0132]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中所述免疫原性产物能够在以下引用的测试C的条件中中和IFNa的抗病毒活性。依照本发明，进行该测定以评价从免疫了所述免疫原性产物的小鼠中获得的血清的中和能力。所述中和能力可通过存在在MDBK细胞中复制的水疱性口炎病毒的情况下评价细胞生活力来评估。该测定还可利用H印-2C人细胞及EMCV病毒进行。
[0133]测定C依照以下方法进行:
[0134]将OJ-1Oyg所述免疫原性产物的总蛋白(如通过Bradford蛋白测定确定的)在30天内(优选在第O天和第21天)两次注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前的血清样品)并在第30天至第40天之间、优选在第31天获得血清样品(测试血清样品)。
[0135]将25 μ I的免疫前血清样品和测试血清样品以1/200稀释从1/200至8次稀释接种于96孔板中。将阳性对照(来自PBL，Piscataway，NJ，ref.31100-1的多克隆抗-1FNa )以3125UI/孔-100Π/孔而典型地稀释于基础培养基(补充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM hepes的RPMI)中以能够中和IFNa活性并取25 μ I也接种于板中。[0136]将25 μ I含25U/孔(终浓度)IFN α的基础培养基加入各孔中并将板在室温下孵育60分钟。
[0137]将含20000个MDBK细胞的测定培养基(补充有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37°C、5% CO2下孵育过夜。
[0138]将病毒稀释于病毒培养基(补充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM hepes的RPMI)中至至少10倍TCID5tl(杀死50%感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并将IOOy I病毒加入各孔中，接着将板于37°C、5% CO2下孵育24小时。
[0139]在培养结束时，MDBK细胞的生活力用本领域熟知的方法来评价。所述方法的一个实例为以下:将2(^ I/孔的 MTS/PMS 溶液(100 μ I MTS/5 μ I PMS ；Promega G5430)加入孔中并将板在37°C /5% CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
[0140]如下计算相对细胞生活力:
[0141]%= [(OD样品-OD病毒)/平均 ODifn+病毒)]*100
[0142]0D#S表示含从免疫了所述免疫原性产物的小鼠中获得的血清或含阳性对照(多克隆抗IFN的抗体)的孔的光密度。
[0143]ODfrt表不仅含病毒的对照孔的光密度。
[0144]ODifn+_表不含IFNa和病毒的对照孔的光密度。
[0145]NC5tl值，对应于导致50%中和病毒介导的死亡的血清的稀释度，表示为稀释系数或中和单位/ml，通过将NC5tl值插入在生活力/浓度图上的X轴上来确定。
[0146]在测试C中，显示从免疫了免疫原性产物的小鼠中获得的血清并不使MBDK细胞免受死亡的结果意味着，所述免疫原性产物具有诱导直接针对IFNa的中和其抗病毒活性的抗体的能力。
[0147]在一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中所述免疫原性产物能够在测试C的条件中中和至少50%的IFNa的抗病毒活性。在所述实施方案中，可计算NC5tlt5若血清的稀释度并不能够在测试C的条件中中和至少50%的IFN a的抗病毒活性，则不能计算所述产物的NC5Q。
[0148]在本发明的一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中IFNa/载体的重量比为0.06-0.6。
[0149]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中IFNa/载体比率为0.1-0.5。
[0150]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的IFNa，其中IFNa/载体比率为0.3。
[0151]在本发明的另一个实施方案中，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子例如KLH偶联的 IFNa，其中 IFNa / 载体比率为 0.05,0.1,0.2,0.21,0.22,0.23,0.24,0.25,0.26、0.27,0.28,0.29,0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.5。
[0152]所述比率可依 据基于如实施例10中所述的紫外光检测和荧光检测(测试E)的方法来计算。
[0153][获得免疫原性产物的方法]
[0154]在本发明的一个实施方案中，依据以下方法获得IFNa kinoid:
[0155]a)将至少一种重组人IFNa亚型和至少一种载体蛋白分子与戊二醛混合并通过加入选自以下的淬灭化合物来阻断反应:(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸，
[0156]b)移除分子量小于IOkDa或小于8kDa的化合物
[0157]c)加入甲醛；
[0158]d)通过加入选自以下的淬灭化合物来阻断与甲醛的反应:(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸，
[0159]e)收集所述免疫原性产物。
[0160]在步骤a)的一个实施方案中，首先将IFNa和载体蛋白分子例如KLH以合适的量混合，并接着加入戊二醛。
[0161]在一个实施方案中，在步骤a)中IFNa和KLH以10: 1-40: I的IFNa:亚基KLH摩尔比混合。在另一个实施方案中，在步骤a)中IFNa和KLH以15: 1-25: I的IFNa:亚基KLH摩尔比混合。在另一个实施方案中，在步骤a)中IFNa和KLH以20: 1-25: I的IFNa:亚基KLH摩尔比混合。
[0162]在步骤a)的一个实施方案中，在反应混合物中所用的戊二醛的终浓度为lmM-250mM、优选20mM-30mM、更优选22.5mM-25mM。在步骤a)的一个实施方案中，将戊二醛与IFNa和KLH孵育15分钟-120分钟的时间、优选约30、35、40、45、50、60、70、80、90分钟的时间。在一个实施方案中，在约45分钟期间以22.5mM加入戊二醛。有利的是，在18°C -37°C、优选在18°C -27°C的温度下，进行与戊二醛孵育的步骤a)。
[0163]根据实施 方案，在移除分子量小于IOkDa的化合物(步骤b)之前，与戊二醛的反应(步骤a)通过加入淬灭化合物、优选选自以下的淬灭化合物:(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸及其混合物构成的组的氨基酸来终止。
[0164]还原剂可以由本领域中已知的任一种还原剂组成，由于其还原性，其具有还原醛处理期间产生的剩余的亚胺基(imine groupment)的能力。所述还原剂可选自由硼氢化钠和氰基硼氢钠构成的组。
[0165]根据实施方案，在其中所述淬灭化合物为氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在步骤b)的一些实施方案中，当甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与戊二醛的反应时，所选氨基酸在反应混合物中所用终浓度为0.01M-1M、优选0.05M-0.5M，并最优选0.08M-0.2M，例如如本文的实施例中所示的0.1M。在一个实施方案中，用淬灭化合物孵育进行一段时间，所述时间范围为从I分钟-120分钟、优选5分钟-60分钟，例如如本文的实施例中所示的30分钟。在另一个实施方案中，该步骤在18°C -30°C、优选18°C _25°C的温度下进行。
[0166]在步骤b)中，移除了反应混合物中存在的小于IOkDa的小化合物。这些小化合物主要包括未与IFNa也未与KLH反应的过量的戊二醛和过量的淬灭化合物分子。步骤b)可根据允许移除小于IOkDa的化合物的任何已知的技术进行，该技术包括用IOkDa截留的透析膜的透析或用IOkDa截留的滤膜的过滤。说明性地，步骤b)可由利用IOkDa截留的滤膜的切向流过滤的步骤组成，如本文实施例中所示。在步骤b)结束时收集不含非所需小化合物的过滤截留物。若需要，步骤b)可包含移除在步骤b)结束时获得的反应混合物中存在的最终化合物聚集物的预备步骤。所述预备步骤可由用于移除最后存在于液体溶液中的悬浮液中的聚集物的常规过滤步骤组成，例如使用适当的滤膜的过滤步骤，例如孔径为0.2μπι的滤膜。
[0167]在所述方法的步骤c)的一个实施方案中，加入终浓度为6mM-650mM、优选25mM-250mM的甲醛。在所述方法的步骤c)的一个实施方案中，以从I小时-336小时、优选I小时-144小时的时间段加入甲醒。在一个实施方案中，在20-50小时期间、优选40小时期间应用终浓度为50-100mM、优选66mM的甲醛。
[0168]在步骤C)，如在本发明的实施例中所示，用甲醛孵育优选在30°C _40°C、例如37°C的温度下进行。
[0169]在所述方法的步骤d)，与甲醛的反应通过加入淬灭化合物来终止，淬灭化合物优选选自(i)还原剂和(ii)选自由赖氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸。
[0170]所述还原剂可以由本领域中已知的任一种还原剂中组成，由于其还原性，其还原还原醛处理期间产生的残留亚胺基。所述还原剂可选自由硼氢化钠和氰基硼氢钠组成的组。根据实施方案，在其中所述淬灭化合物为氨基酸的实施方案中，所述氨基酸由甘氨酸组成。在步骤b)的一些实施方案中，当甘氨酸和/或赖氨酸用于阻断与甲醛的反应时，所选氨基酸在反应混合物中所用终浓度为0.01M-1.5M、优选0.05M-1M,并最优选0.1M-0.2M，例如如本文的实施例中所示的0.1M。在一个实施方案中，用淬灭化合物孵育进行一段时间，所述时间范围从5分钟-120分钟,优选10分钟-60分钟,例如如本文的实施例中所示的30分钟，如在本发明的实施例中所示。在另一个实施方案中，该步骤在18°C -30°C、优选18°C -25 °C的温度下进行。
[0171]根据所述方法的一个实施方案，就在步骤e)收集前，技术人员可通过本领域已知的用于从液态溶液移除分子量小于IOOkDa的物质的任何技术，进行分子量小于IOOkDa的物质的移除。在第一实施方案中，所用技术为使用截留值为至少IOOkDa的滤膜来进行的过滤步骤，其包括超滤步骤或切向流过滤步骤。在第二实施方案中，所用技术由使用截留值为至少IOOkDa的滤膜的切向流过滤步骤组成。在另一个实施方案中，就在步骤e)收集前，可通过使用截留值为至少300kDa的滤膜来进行分子量小于300kDa的物质的移除。
[0172][包含此类乳剂的组合物、乳剂和疫苗]
[0173]本发明涉及包含如本文上述的免疫原性产物的组合物。本发明还涉及本发明的产物的制剂，其中所述产物在乳剂内。有利的是，本发明的疫苗组合物包含所述乳剂或由所述乳剂组成。此类乳剂包含本发明的免疫原性产物，油和表面活性剂或至少一种油和至少一种表面活性剂的混合物。优选所述油或所述油/表面活性剂的混合物为药学上可接受的赋形剂。更优选地，油和表面活性剂的混合物为佐剂，甚至更优选为免疫佐剂。优选的佐剂是ISA51。可用的免疫佐剂的另一个实例是SWE(基于角鲨烯的水包油型乳剂)。可用的免疫佐剂的另一个实例是SWE-a(基于角鲨烷的水包油型乳剂)。本发明的乳剂可为油包水型乳剂或水包油型乳剂。
[0174]在另一个实施方案中，根据本发明的免疫原性产物的量为所述乳剂的总重量的高于 0.01% (w/w)和低于 1% (w/w) ο
[0175][佐剂]
[0176]本发明的乳剂或疫苗组合物可包含佐剂、特别是免疫佐剂。在一个实施方案中，所述佐剂的量为疫苗组合物的总重量的0.00001% (w/w)-1%，优选0.0001-0.1%，更优选0.001-0.01% (w/w) O[0177]技术人员已知的任何合适的佐剂可用于以上的疫苗组合物，包括油基佐剂，例如如弗氏不完全佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如，海藻糖二霉菌酸酯)、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即胞壁质、粘肽或糖蛋白如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]、或者MDP类似物)、MPL (单磷酰脂A)、蛋白聚糖(例如从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的蛋白聚糖)、链球菌制剂(例如0K432)、必思添(Biostim).TM.(例如，01K2)、EP 109 942、EP180 564和EP 231 039的“ Iscoms (免疫刺激复合物)”、氢氧化铝、皂甙、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol( 二辛酸/癸酸丙二醇酯))、植物油(如花生油)、脂质体、普朗尼克(Pluronic).RTM.多元醇、Ribi佐剂系统(见例如，GB-A-2 189 141)、或白介素，特别是刺激细胞介导的免疫的那些。美国专利第4，877，612号中已经描述了由放线菌目中的一个细菌属无枝酸菌属(Amycolata)的提取物构成的可选佐剂。另外，也可使用SWE(含角S烯3.9%、司盘(span) 0.47%，吐温80 0.47%的柠檬酸盐缓冲液)和SWE_a(含角鲨烷3.9%、司盘0.47%，吐温80 0.47%的柠檬酸盐缓冲液)。此外，专属佐剂混合物是市售的。所用佐剂将部分取决于受体生物体。施用佐剂的量也将取决于动物的种类和大小。最佳剂量可很容易通过常规方法来容易确定。
[0178]适用于油包水型乳剂的油佐剂可包含矿物油和/或可代谢油。矿物油可选自Bayol ?、Marcol.⑩和 Drakeol,包括 Drakeol K； 6VR(SEPPIC,法国)?。可代谢油可选自 SP 油(下文描述)、Emulsigen (MPV Laboratories,罗尔斯顿，新西兰(Ralston, NZ))、Montanide264, 266, 26 (Seppic SA,巴黎，法国)以及植物油，例如花生油、大豆油、动物油例如鱼油、角鲨烷和角鲨烯、和生育酚及其衍生物。
[0179]此外，所述佐剂可包含所述佐剂体积的约0.1% -25%、更优选约1-10%、以及更优选约1-3%的量的一种或多种润湿剂或分散剂。特别优选的湿润剂或分散剂为非离子型表面活性剂。可用的非离子型表面活性剂包含聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物，特别以商标Pluronic (普朗尼克)⑩出售并且可来自BASF公司(Mt.0live，N.J)的那些。其他可用的非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯酯例如商标为吐温80⑩的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯或二缩甘露醇单油酸酯。所需的可以是佐剂中包含多于一种、例如至少2种润湿剂或分散剂作为本发明的疫苗组合物的一部分。
[0180]合适的佐剂可包括但不限于本领域的技术人员已知的表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、N, N-双十八烷基-N' -N-双(2-羟乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和普朗尼克多元醇；聚阴离子(polanion)，如吡喃、硫酸葡聚糖、聚1C、聚丙烯酸、聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸(aimethylglycine)、促吞曬素、油乳剂、明帆、及其混合物。其他潜在的佐剂包括大肠杆菌不耐热毒素的B肽亚基或霍乱毒素的B肽亚基。McGhee, J.R.,等，"On vaccinedevelopment, " Sem.Hematol.,30:3-15(1993)。
[0181][另外的表面活性剂]
[0182] 在含乳剂的根据本发明的疫苗组合物的实施方案中，所述疫苗组合物除所述免疫原性产物和一种或多种油质免疫佐剂物质的组合之外，优选还包含一种或多种表面活性剂。表面活性剂的示例性实施方案包括二缩甘露醇单油酸酯例如由Arlacel (SEPPIC，France)出售的 Montanide ? 80。
[0183]在一个实施方案中，表面活性剂的量为疫苗组合物的总重量的0.00001% (w/w)-1%、优选 0.0001-0.1%、更优选 0，001-0.01% (w/w) O
[0184][冻干产品]
[0185]根据一个实施方案并出于储存的目的，本发明的产物或疫苗组合物可被冻干。因此疫苗组合物可呈冷冻干燥(冻干)的形式。在所述的实施方案中，根据本发明的免疫原性产物结合一种或多种冻干辅助物质。各种冻干辅助物质为本领域的技术人员所众所周知的。辅助物质的冻干包括糖例如乳糖和甘露糖醇。
[0186]在此类实施方案中，当疫苗组合物由冻干的组合物组成，用于以包含表面活性剂的液体乳剂来使用时，所述疫苗组合物优选包含所述疫苗组合物的总重量的高于0.1%(w/w)并小于10% (w/w)的量的根据本发明的免疫原性产物。
[0187][稳定剂]
[0188]在一些实施方案中，所述疫苗可与稳定剂混合，例如以保护易发生降解的蛋白不被降解、以提高疫苗的保质期或提高冷干效率。可用的稳定剂是1.a, SPGA (Bovarnik等；J.Bacteriology 59:509 (1950))、碳水化合物(例如:山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白质(例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物)、氨基酸的混合物(所述氨基酸例如赖氨酸或甘氨酸)以及缓冲液(例如碱金属磷酸盐)。
[0189][给药途径]
[0190]本发明的疫苗组合物可通过任何常规的方法施用于待免疫的受试对象，包括通过注射，例如皮内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射，或通过局部递送，例如通过经皮递送。所述治疗可由一段时间内的单一剂量或多个剂量来组成。
[0191][剂型]
[0192]适于注射使用的形式可包括无菌溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。预防微生物污染可通过在所述疫苗组合物中添加例如各种抗细菌剂和抗真菌剂的防腐剂来实现，所述防腐剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，可优选的是包括等渗剂，例如糖或氯化钠，以在注射过程中减轻疼痛。注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
[0193]根据一种实施方案，本发明的冻干的疫苗组合物溶解于注射用水中并轻轻混合；然后添加免疫佐剂优选ISA51 ;将混合物轻轻混合以乳化并装入合适的注射器中。因此，本发明还涉及一种医疗装置，包括装有或预装有本发明的疫苗组合物的注射器。理想地即时制备乳剂。然而，包含乳剂的注射器可在2-8°C下存储少于10个小时。在这种情况下，注射前应允许通过手之间的摩擦将乳剂温热。
[0194][单位剂量范围]
[0195]本发明的另一个目标是包含范围在高于30mcg-1000mcg的免疫原性产物的量的剂量单位。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-1000mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-750mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-500mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-450mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-400mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-350mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-300mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在35mcg-250mcg的免疫原性产物的量。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-1000mcgo在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-100mcg。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在 35mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、lOOrncg、llOmcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg>290mcg、300mcg、3lOmcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg 至 400mcg 的免疫原性产物的量。
[0196]在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在60mCg-240mCg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含范围在60mcg-120mcg的免疫原性产物的
量。
[0197]在另一个实施方案中，所述剂量单位包含60mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含120mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述剂量单位包含240mcg免疫原性产物的量。
[0198][试剂盒和医疗装置]
[0199]本发明还涉及包含以下的试剂盒:
[0200]-1个小瓶(I号小瓶)，包含(典型地3mL)本发明的免疫原性产物；
[0201]-1个小瓶(2号小瓶)，包含佐剂，优选ISA51 ;该小瓶能够包含3mL佐剂并可为8mL的容器；
[0202]-1个注射器，典型地为ImL的Braun Injekt-F Φ ；
[0203]-1个针头(I号针头)，用于乳剂制备；该针头优选为20G针头；
[0204]-1个针头(2号针头)，用于注射，优选肌内注射；该针头优选为23G针头。
[0205]本发明还涉及用于从所述试剂盒制备疫苗的方法，所述方法包括:
[0206](I)从2号小瓶中吸取0.4ml佐剂。将该注射器内容物放入含0.4ml免疫原性产物的I号小瓶中。
[0207](4)将总的小瓶内容物向上向下抽动足够多次(典型地30次)，用于乳化所述内容物，并最终抽取全部的乳剂。[0208]注射之前，优选用2号针头换掉I号针头，并且从注射器中清除空气。
[0209]在一个实施方案中，所述试剂盒包含:
[0210]-1个小瓶(I号小瓶)，包含0.4mL本发明的免疫原性产物；
[0211]-1个小瓶(2号小瓶)，包含至少0.4mL佐剂，优选ISA51 ;
[0212]-1个注射器，典型地为ImL的fcaun Injekt-F ? ；
[0213]-1个针头(I号针头)，用于乳剂制备；该针头优选为20G针头；
[0214]-1个针头(2号针头)，用于注射，该针头优选为23G针头。
[0215]在另一个实施方案中，所述免疫原性产物呈冻干形式。因此，所述试剂盒包含:
[0216]-1个小瓶(I号小瓶)，包含(典型地3mL)本发明的冻干产物；
[0217]-1个小瓶(2号小瓶)，包含(典型地2mL)注射用水；
[0218]-1个小瓶(3号小瓶)，包含佐剂，优选ISA51 ;该小瓶能够包含3mL佐剂并可为8mL的容器；
[0219]-1个注射器，典型地为ImL的Braun Injekt-F Φ ；
[0220]-1个针头(I号针头)，用于乳剂制备；该针优选为20G针头；
[0221]-1个针头(2 号针头)，用于注射，优选肌内注射；该针优选为23G针头。
[0222]本发明还涉及用于从所述试剂盒制备疫苗的方法，所述方法包括:
[0223](I)将2号小瓶中的注射用水通过利用与I号针头连接的注射器注入I号小瓶中；
[0224](2)轻轻旋转I号小瓶1-5分钟直至制剂完全溶解；
[0225](3)用同一个注射器和针头，抽取3号小瓶的佐剂。将该注射器内容物放入I号小瓶中；
[0226](4)将总的小瓶内容物向上向下抽动足够多次(典型地30次)，用于乳化所述内容物，并最终抽取总乳剂。
[0227]本发明还涉及一种医疗装置，其为包含装有或预装有本发明的组合物、乳剂或疫苗的注射器。
[0228]在一个实施方案中，所述注射器为双室注射器，其中一室包含含本发明的免疫原性产物的溶液而另一室包含佐剂。
[0229]本发明还涉及一种医疗装置，其包含预装有本发明的产物或本发明的疫苗组合物的小瓶或卡普耳瓶(carpule)。
[0230]在一个实施方案中，所述医疗装置包含高于35mCg-1000mCg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-1000mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-750mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-500mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-450mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-400mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-350mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-360mcg免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg-250mcg免疫原性产物的量。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-1000mcgo在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-750mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-500mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-450mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-400mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-350mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-300mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-250mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-240mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-200mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-150mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-120mcg。在本发明的另一个实施方案中，每次施用所述免疫原性产物的治疗有效量为60mcg-100mcg。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含35mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、lOOrncg、llOmcg、120mcg、130mcg、140mcg、150mcg、160mcg、170mcg、180mcg、190mcg、200mcg、210mcg、220mcg、230mcg、240mcg、250mcg、260mcg、270mcg、280mcg、290mcg、300mcg、3lOmcg、320mcg、330mcg、340mcg、350mcg、360mcg、370mcg、380mcg、390mcg-400mcg 的免疫原性产物的量。
[0231]在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mCg-240mCg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mcg-120mcg的免疫原性产物的量。
[0232]在另一个实施方案中，所述医疗装置包含60mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含120mcg的免疫原性产物的量。在另一个实施方案中，所述医疗装置包含240mcg的免疫原性产物的量。
【专利附图】
【附图说明】
[0233]图1:中期报告期间显示IFNa中和活性的已免疫患者血清样品的百分比。
[0234]图2:在治疗患者对比安慰剂患者中IFN-诱导基因的差分进化。在基线显示出升高水平的IFN-诱导基因表达的11名患者中，8名用免疫原性产物治疗而3名接受安慰剂注射。在SLE患者中显示出过表达的最高水平的250种IFN-诱导基因的水平用高密度微阵列评价。结果描述为log2(在Vl的表达水平)-log2(在V6的表达水平)的平均值。P值用学生t检验计算。
[0235]图3:对比接受安慰剂患者,在基线处具有阳性IFN-标记或阴性IFN-标记的治疗患者中IFN-结合抗体的滴度。星号表示P值< 0.05。
[0236]图4:对比接受安慰剂患者,在基线处具有阳性IFN-标记或阴性IFN-标记的治疗患者中，在VlO和VO之间或Vll和VO之间，IFN-诱导基因的差分进化。结果描述为DeltaLog(表达水平)的平均值。星号表示P值<0.05。
[0237]图5:在基线处具有阳性IFN-标记的治疗患者中和在接受安慰剂患者中，血清C3值的进化算法。星号表示P值<0.05。
[0238]实施例
[0239]实施例1:免疫原性产物的制备
[0240]将钥孔戚血蓝蛋白(KLH)从海洋腹足软体动物大锁孔帽贝的淋巴中提取出来并接着在GMP条件下纯化。在2-8°C的温度下，在储存条件下进行的稳定性测定的结果显示，在2-8 °C下纯化的KLH的保质期为36个月。
[0241]重组人IFNa 2b在GMP条件下在大肠肝菌中产生。
[0242]本发明产品在350mcg IFNa级别的批次用以下开发的生产工艺产生。
[0243]a)用戊二醛偶联
[0244]将过滤的KLH基于紫外浓度以20:1的IFN α: KLH比率(相应于20个单体的IFN α对I个亚基的KLH的摩尔比)加入到IFN a 2b溶液(含IFN a 2b的70mM磷酸氢二钠PH7.8)中。偶联用戊二醛(添加以在反应介质达到22.5mM的终浓度)和pH9的硼酸(添加以在反应介质达到28.5mM的终浓度)进行，以获得8.5的pH。
[0245]接着在23+2°C下，45分钟期间混合pH8.5的该溶液。
[0246]b)用甘氨酸淬灭
[0247]在30分钟期间用0.1M的甘氨酸淬灭反应。
[0248]c)第一切向流过滤(TFFl)
[0249]第一 TFF用Pall Minim II TFF系统和用0.5M NaOH消毒并用工作缓冲液(70mM磷酸氢二钠PH7.8)平衡的截留分子量为IOkDa的0.02 μ m2的聚醚砜膜进行。
[0250]接着将溶液通过0.22 μ m过滤来澄清。中间体用工作缓冲液两倍稀释并接着通过切向流过滤(TFF)和12体积 的工作缓冲液来渗滤。收获渗余物并存储少于20小时。
[0251]d)用甲醛灭活
[0252]用蠕动泵将甲醛加入渗余物中以达到66.6mM的终浓度。灭活反应在设定在37±2°C的恒温箱中在40小时期间进行，每天用磁力搅拌器搅拌溶液。
[0253]e)用甘氨酸淬灭
[0254]在30分钟期间用0.1M的甘氨酸淬灭反应。
[0255]f)第二切向流过滤(TFF2)
[0256]第二 TFF用PalI Minim II TFF系统和用0.5M NaOH消毒并用配制缓冲液(formulation buffer) (70mM憐酸氢二钠ρΗ7.8)平衡的截留分子量为IOOkDa的0.02m2的
聚醚砜膜进行。
[0257]将溶液通过0.22 μ m过滤来澄清。浓缩中间体至具有约900mL的起始切向体积并接着用12体积的配制缓冲液(70mM磷酸盐缓冲液)通过TFF过滤以消除IFNa的低分子量均聚物和非反应性试剂。收获渗余物并接着稀释至基于通过Bradford蛋白测定的浓度确定的300 μ g/mL的理论浓度并接着0.2 μ m过滤以得到本发明的免疫原性产物。
[0258]实施例2:产物的抗原性
[0259]如下进行夹心ELISA抗IFNa/KLH。简言之，用捕获抗体:兔多克隆抗-KLH抗体包被96孔板，并在37°C下90分钟期间用封闭缓冲液(例如含2%酪蛋白的PBS)封闭板。在37°C下90分钟期间用从250ng/ml至8次两倍稀释的系列稀释的免疫原性产物或用阴性对照例如KLH和IFNa孵育板。接着加入检测抗体例如生物素化的抗-1FN a抗体持续90分钟。最后在37°C下30分钟期间用链霉亲和素-HRP孵育板并在30分钟期间将复合物用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物显色。酶反应终止后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
[0260]该测定证实产物包含有抗原性的IFN a，即被抗-1FN a抗体识别并且所述IFN a与KLH偶联。[0261]实施例3:产物的免疫原性(测试A)
[0262]将总蛋白为4yg的产物(通过Bradford蛋白测定确定的)在第O天和第21天注射至7只6-8周的Balb/c小鼠中。
[0263]在第31天，将小鼠放血并收获血清。
[0264]对免疫前血清和收获血清如下进行抗IFN a ELISA:
[0265]-用100ngIFN a -2b包被96孔板并在2°C~8°C孵育过夜，
[0266]-在37°C下90分钟期间加入封闭缓冲液，
[0267]-将免疫原性产物以1/2500稀释至8次两倍稀释加入并将板在37°C下孵育90分钟；
[0268]-在37°C下90分钟期间将板用抗小鼠免疫球蛋白的标记抗体例如HRP结合的抗体孵育；
[0269]-将ELISA用邻苯二胺二盐酸盐(OPD)底物溶液显色。酶反应终止后，所得颜色的强度通过分光光度法于490nm处确定。
[0270]该测定证明在这7只小鼠中用免疫原性产物免疫导致抗IFN α抗体滴度的出现。
[0271]实施例4:产物的残留活性(测试B)
[0272]该测试是基于IFNa对水泡性口炎病毒(VSV)之于马-达氏牛肾(MDBK)细胞的细胞病变效应(CPE)的保护作用。
[0273]将所述免疫原性产物和用于制备所述免疫原性产物的重组IFN a 2b (阳性对照)各自以至少500ng/ml和至少1000U/ml稀释于基础培养基(补充了 2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠、ImM Hepes的RPMI)中。将50 μ I的免疫原性产物和阳性对照置于96孔板中并以两倍稀释连续稀释于基础培养基中。将含2 IO4的MDBK细胞的50 μ I细胞培养基(补充有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37°C,5% CO2下孵育过夜。接着将病毒稀释于基础培养基至至少10倍TCID5tl(组织培养感染剂量50:杀死50%感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并加入100 μ I稀释的病毒。接着将板于37°C，5% CO2下孵育过夜。
[0274]在培养结束时，将20 μ I/ 孔的 MTS/PMS 溶液(100 μ I MTS/5 μ I PMS ；PromegaG5430)加入孔中并将板在37°C，5% CO2下再孵育4小时。接着将板在分光光度计上于490nm处读数。
[0275]计算免疫原性产物的抗病毒活性百分比并且对于测试的两批产物，抗病毒活性小于IFNa抗病毒活性的1%。
[0276]实施例5:产物的中和能力(测试C)
[0277]产物的中和能力通过存在在MDBK细胞中复制的水疱性口炎病毒的存在情况评价细胞生活力来评估。
[0278]将总蛋白为4yg的产物(通过Bradford蛋白测定确定的)在第O天和第21天注射至6-8周的Balb/c小鼠中。在免疫前获得血清样品(免疫前血清样品)和第31天获得血清样品(测试血清样品)。
[0279]将25 μ I的免疫前血清样品和测试血清样品以1/200稀释从1/200至8次稀释接种于96孔板中。将阳性对照(来自PBL，Piscataway，NJ，ref.31100-1的多克隆抗-1FNa )以3125UI/孔-100Π/孔稀释于基础培养基(补充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImMhepes的RPMI)中并将25 μ I也接种于板中。
[0280]将含25U/孔(终浓度)IFN α的25 μ I基础培养基加入各孔中并将板在室温下孵育60分钟。
[0281]将含20000MDBK细胞的检测培养基(补充有4%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM Hepes的RPMI)加入各孔中并将板在37°C，5% CO2下孵育过夜。
[0282]将病毒稀释于病毒培养基(补充有2mM谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠和ImM hepes的RPMI)中至至少10倍TCID5tl(杀死50%感染细胞的稀释度的10倍)。倾空板并将IOOy I病毒加入各孔中，接着将板于37°C、5% CO2下孵育24小时。
[0283]在培养结束时，将20 μ I/ 孔的 MTS/PMS 溶液(100 μ I MTS/5 μ I PMS ；PromegaG5430)加入孔中并在37 °C，5 % CO2下将板再孵育4小时。接着将板在分光光度计上在490nm处读数。
[0284]计算所有7种测试样品的NC:平均NC = 253789IU/ml (SEM = 172526)，证明所有血清包含能够中和IFNa的抗病毒活性的抗-1FN a抗体。
[0285]实施例6:包含免疫原性产物的组合物和疫苗的实例
[0286]包含免疫原性产物的一种示例性组合物描述于表1中。
[0287]表1
[0288]
【权利要求】
1.一种免疫原性产物，其包含与载体蛋白分子偶联的IFNa，用于治疗需要其的受试对象中的IFNa相关病况，其中待施用给所述受试对象的所述免疫原性产物的治疗有效量为每次施用高于30mcg的免疫原性产物。
2.权利要求1的免疫原性产物，其中所述治疗有效量的所述免疫原性产物的施用防止与IFNa的过量产生相关的疾病的症状的发生。
3.权利要求1的免疫原性产物，其中所述治疗有效量的所述免疫原性产物的施用防止与IFNa的过量产生相关的疾病的爆发。
4.权利要求1-3中任一项的免疫原性产物，其中所述IFNa相关病况包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、脉管炎、HIV、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎和肌炎。
5.权利要求1-4中任一项的免疫原性产物，其中待施用给所述受试对象的所述免疫原性产物的治疗有效量为每次施用35mcg-1000mcg的免疫原性产物。
6.权利要求1-5中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物在一个月内被施用给所述受试对象至少两次。
7.权利要求1-6中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物每三个月另外被施用给所述受试对象至少一次。
8.权利要求1-6中任一项的免疫原性产物，其中当在从所述受试对象获得的血清样品中检不出抗-1FN a抗体的量时，将所述免疫原性产物另外施用给所述受试对象。
9.权利要求1-8中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物是强烈失活的，其意味着所述产物在测 试B的条件中显示低于5%的抗病毒活性。
10.权利要求1-9中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物在测试C的条件中能够中和IFNa的抗病毒活性。
11.权利要求ι-?ο中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物包含至少一种亚型的IFNa。
12.权利要求1-11中任一项的免疫原性产物，其中IFNa的所述亚型为IFNa2b且所述载体蛋白分子为KLH。
13.权利要求1-11中任一项的免疫原性产物，其中所述免疫原性产物为疫苗，优选呈乳剂的形式。
14.一种单位剂型，其包含高于30mcg的根据权利要求1-13中任一项的免疫原性产物，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNa。
15.—种医疗装置，其包含高于30mcg的根据权利要求1-13中任一项的免疫原性产物，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNa。
16.—种试剂盒，其包含:至少一个小瓶,所述小瓶包含高于30mcg的根据权利要求1-13中任一项的免疫原性产物，所述免疫原性产物包含与载体蛋白分子偶联的IFNa ;至少一个包含佐剂的小瓶；以及用于使所述免疫原性产物与所述佐剂接触和用于乳化含所述佐剂的混合物的工具。
【文档编号】A61K38/21GK103608031SQ201280028221
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年4月4日 优先权日:2011年4月7日
【发明者】G·格鲁阿德-沃格尔, O·德赫林, B·范格特, P·温德帕派理尔勒, C·罗凯洛尔 申请人:尼奥瓦克斯公司