为了提高对在断奶期期间新引入食物的耐受性对健康年幼哺乳动物施用的益生菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明是基于在关键的断奶期(在婴儿中此时期一般从约3个约至约12，18或24个月大)对健康年幼哺乳动物施用益生菌剂，乳双歧杆菌NCC2818，从而加速年幼哺乳动物对新食物的适应。本文通过在断奶的小猪动物模型中观察的形态学和免疫学变化证明了本发明的有效性。因此，根据本发明的益生菌剂的施用具有预防效果，预防了与在断奶期引入新食物有关的严重不适和病理状态。
【专利说明】为了提高对在断奶期期间新引入食物的耐受性对健康年幼晡乳动物施用的益生菌剂
发明领域
[0001]此发明涉及通过施用益生菌剂或益生菌剂混合物提高年幼哺乳动物，特别是人婴J L对在断奶期期间新引入食物的耐受性。
[0002]发明背景
[0003]肠道免疫系统的新生后成熟
[0004]婴儿和其他年幼哺乳动物在出生时具有有功能的但幼稚(未受训的)肠道免疫系统。完全的免疫能力在出生后逐渐获得，且仅可通过逐渐接触外部刺激，例如摄入的蛋白质和/或肠道微生物群实现。此逐渐的免疫成熟最终导致分辨有害和无害刺激的能力并引起合适的免疫应答(在接触病原体时指炎症，当接触食物成分和共生菌时指耐受性)。因此，婴儿期是免疫系统的不稳定期，具有两种结果的可能性，导致耐受性和保护性免疫或病理学过敏免疫应答(Cummins 和 Thompson; 1997; Immunology and Cell Biology; 75，419-29)。
[0005]在肠道免疫系统的新生后成熟期间，母乳确保免疫保护并补偿肠道中缺乏的免疫能力。然而，专一的母乳喂养仅可在出生后有限的时间内维持充足的营养支持，即在人婴儿中为4至6个月。在此时期后，将其他食物逐渐引入饮食中以满足婴儿的营养需要，因此降低了对提供所有营养物的奶或配方的依赖性。此过程通常被称为断奶。在人婴儿中，从断奶改为补充食物逐渐发生在3个月至12个月大。然而，引入补充食物的年龄可根据地理位置和文化差异而变化(Aggett, P.J., Research priorities in complementaryfeeding:1nternational Paediatric Association (IPA) and European Society ofPaediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition(ESPGHAN)workshop.Pediatrics2000; 106:1271)。其他哺乳动物，例如狗或猫，在3_4周时自己逐渐断母乳，开始吃补充食物，并在8-10周大时变得不依赖奶。
[0006]在婴儿和年幼哺乳动物中胃肠道的成熟包括在婴儿期发生的若干生理机制，这些都促成不成熟的胃肠道系统进化为成熟的成人胃肠道系统。涉及的一个关键步骤是适应新食物，这主要在断奶期间发生。因此，将在断奶时适应新食物视为胃肠道成熟的重要部分。
[0007]免疫系统和肠道生理学在断奶期附近经历修饰
[0008]健康年幼哺乳动物的肠道免疫系统在断奶期附近被激活。此激活包括体液和细胞机制，是由于食物来源的改变(奶至固体)对大量新接触的抗原的应答。已显示，在哺乳动物中作为暴露于新食物的应答，此在断奶时的最初的免疫激活是短暂的。例如在大鼠中，断奶与肠系膜淋巴结(MLN)中增加的细胞数，增加的空肠淋巴细胞数和肥大细胞脱颗粒作用相关。人婴儿显示十二指肠肥大细胞的扩张和上皮内淋巴细胞的增力口(Thompson, F.M.，Mayrhofer G, Cummins A.G., Dependence of epithelial growthof the small intestine on T—cell activation during weaning in the rat, Gastroenterologyl996; 111:37-44)。也显示在小鼠中自发的细胞因子分泌细胞在断奶期间短暂增力口(Vazquez，E.，Gil，A.，Garcia-Olivares，E.，Rueda，R.，Weaning induces anincrease in the number of specificcytokine-secreting intestinal lymphocytes inmice, Cytokine2000;12:1267-70)。
[0009]认为在断奶期附近的短暂的免疫激活是训练肠道免疫系统所必需的，随后使得成长中的婴儿耐受无害刺激(例如食物、共生菌)。众所周知，在生理上获得肠道耐受性的方法之一是通过下调对新刺激的最初的局部免疫应答。
[0010]断奶不仅影响肠道免疫系统，而且起始代谢中实质的，食物诱导的改变和肠内形态学。肠形态学通常通过绒毛(绒毛长度或绒毛面积)和隐窝(隐窝长度和分裂)评估。例如，人婴儿显示在6-12个月大时的隐窝分裂增加，以及在12和24个月之间的隐窝长度增加和在断奶期附近绒毛面积的减少(Cummins, A.G.，Catto-Smith A.G., Cameron, D.J.等人,Crypt fission peaks early during infancy and crypt hyperplasia broadlypeaks during infancy and childhood in the small intestine of humans, J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.，2008; 47:153-7)。对免疫系统而言，大多数这些形态学变化是短暂的并在年龄约4岁的儿童中达到与成人的情况类似的平衡。
[0011]不幸的是，对生命中后来的适当的免疫应答所必需的在断奶时健康年幼哺乳动物的激活的免疫态以及肠内形态学的变化，使年幼哺乳动物对同时其可能遇到的胁迫更脆弱。此脆弱性可导致断奶相关并发症，例如非常普遍的慢性非特异性儿童腹 ?写(Kleinman, R.E., Chronic nonspecific diarrhea of childhood, NestleNutr.Workshop Ser.Pediatr.Program, 2005;56:73-9)或对食物蛋白质的免疫系统应答不足，SP，食物过敏，超敏反应和食物蛋白质诱导的小肠结肠炎(FPIES) (Nowak-ffegrzyn, A., Muraro, A., Food protein-1nduced enterocolitis syndrome, Curr.0pin.Allergy Clin.1mmunol.，2009;9:371-7)。当然，上述断奶相关的病理状态是年幼哺乳动物不适的来源。
[0012]此外，随着补充食物的摄入增加，婴儿将接触更多的潜在病原微生物(Sheth,M.,Dwivedi,R., Complementary foods associated diarrhea, IndianJ.Pediatr.，2006;73:61 -4)，因此增加感染的风险。在断奶期间，尽管增加了食物摄入，但母乳摄入逐渐减少。因此，在最需要在人类乳中发现的免疫保护性化合物时，对这些化合物的消耗较低，且年幼哺乳动物的免疫系统还不能完全提供这些因子。
[0013]在断奶附近的并发症特别有害，因为此时免疫系统的塑造可对生命中后来如何处理免疫攻击具有持久影响。这已在例如食物过敏、I型糖尿病和乳糜泻中显示。
[0014]胃肠道微生物群和断奶
[0015]驱动免疫系统发育和成熟的主要影响之一是微生物的早期肠道建群。已显示，在无菌条件下养育的动物具有严重发育低下的肠道免疫系统，这可通过引入共生菌和/或益生菌剂挽救。也已证明，在生命的最初几个月中，哺乳动物在其肠道微生物群的组成中经历相当大的波动。尽管在母乳喂养期间双歧杆菌(Bifidobacteria)占优势,随着引入补充食物后微生物群变得更复杂。然后，在断奶后占优势的是拟杆菌(Bacteroidetes)、肠球菌(Enterococci)和厌氧球菌(anaerobic cocci)。
[0016]因为断奶过程与肠道微生物群落本质的巨大改变相关，此时期代表了干预窗口，例如使用益生菌剂。此外，通过在断奶期间使用益生菌剂干预修饰发育的微生物群相比对成人施用益生菌剂可能对免疫系统后来的功能具有更显著的影响。
[0017]因此不出意料，断奶是在正常发育期间的关键的和生理上具挑战性的时间，并被认为是对年幼哺乳动物的胁迫。因此，需要帮助年幼哺乳动物以尽可能少的不适度过关键的断奶期，同时确保他消耗充足的食物以满足营养需求。需要提供可治疗处理，所述治疗处理可预防断奶相关的病况，特别是在上面的段落中提及的那些，包括慢性非特异性儿童腹泻和食物蛋白质诱导的小肠结肠炎综合征。需要提供预防治疗处理以预防或减弱断奶相关的病况的症状。
[0018]另外，需要促进和加速年幼哺乳动物的肠对在断奶期遇到的新食物的适应。
[0019]需要诱发或支持对在断奶期新引入的食物的耐受性。
[0020]需要预防和治疗年幼哺乳动物感觉到的与断奶相关的肠道不适。此不适可为轻微的，不指示特定的病理状态。可选地，不适可为严重的，引起疼痛和婴儿的持续哭泣。此严重的不适可与严重的病理病况相关。
[0021]发明概述
[0022]本发明回应了上述需要。本发明是基于在关键的断奶期(在婴儿中此时期通常从约3个约至约12，18或24个月大)对健康年幼哺乳动物施用益生菌剂，从而加速年幼哺乳动物对新食物的适应。本文通过在断奶的小猪动物模型中观察的形态学和免疫学变化证明了本发明的有效性，在所述模型中测量了肠粘膜绒毛生理学、血清中的抗原特异性IgG1和IgG2水平，和MLN (肠系膜淋巴结)细胞中B细胞滤泡的数量和类型。
[0023]因此施用益生菌剂导致在接触了新引入的食物后，体液免疫应答，特别是G类免疫球蛋白生产的短暂增加的增强。相比在未接受益生菌剂的年幼哺乳动物中出现的增加，所述增加出现的更迅速和/或程度更高。
[0024]因此相比未接受益生菌剂的年幼哺乳动物，在断奶期施用益生菌剂导致肠粘膜绒毛的高度和/或面积增加超过15%。
[0025]本发明涉及预防与断奶相关的病理状态，例如慢性非特异性儿童腹泻，对食物蛋白质不适当的免疫系统应答，即食物过敏，超敏反应和FPIES。因此，在断奶时和生命中后来预防或减轻了与缺乏对在断奶期新引入的食物的耐受性相关的症状。同时，本发明允许年幼哺乳动物的正常免疫适应。因此缩短了年幼哺乳动物由于断奶而具有增加的脆弱性的时期。
[0026]因此，施用根据本发明的益生菌剂具有预防作用，其预防了与在断奶期间引入新食物相关的严重不适和病理状态。
[0027]本发明的目的也在于预防与断奶相关的轻微的肠道不适。
[0028]施用的益生菌剂优选地是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animal issubsp.Lactis)(乳双歧杆菌)，菌株乳双歧杆菌CNCM-1-3446，又称乳双歧杆菌NCC2818。益生菌剂可为活的，或已被失活以使其不能复制。可使用的每日剂量为从IO2至lxlO11，优选IxlO6至IxlO9Cfu(cfu=菌落形成单位)或cfu的等同物在非复制微生物的情况下。
[0029]益生菌剂可以其纯的形式，或稀释在水中，或在适于对年幼哺乳动物施用的组合物中施用。后一种组合物可包含其他另外的益生菌剂，其优选地选自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BB536(ATCC BAA-999)；
[0030]鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus) (CGMCC1.3724);罗伊氏乳杆菌(Lactobacilus reuteri) (DSM17938)或其混合物。组合物还可包含益生素，例如菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链F0S)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、阿拉伯木聚糖-寡糖(AXOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶和大豆胶。组合物也可包含非益生素，例如Lactowolfberry、枸杞提取物及其混合物。
[0031]组合物可为婴儿配方、后继(follow-on)配方或成长奶、婴儿谷类食品或酸奶、婴儿餐、布丁或奶酪、奶制品或果汁饮料、果昔、点心或饼干或其他烘焙食品。组合物可为货架稳定的形式或冻干产品，或通过挤压、无菌过程或罐式灭菌甑生产。
[0032]附图简述
[0033]图1:喂食方案
[0034]A:喂食方案1:小猪断母乳，改为固体食物(分别为基于大豆或OVA(蛋)的蛋白质)，一组补充有NCC2818。从第49天起直至第77天实验终止所有组改为鱼粉。n=6。
[0035]B:喂食方案I1:从24小时龄开始用配方喂养小猪，含有或没有NCC2818。然后每组一半小猪断奶，改为基于蛋蛋白质的饮食，或根本不断奶。在第25天龄时终止实验。n=6。
[0036]图2:对喂食的大豆的血清IgG应答
[0037]在补充(大豆+NCC2818)或未补充NCC2818 (大豆饮食)的大豆喂食小猪，或未补充的，蛋喂食小猪(蛋饮食)的血清中的大豆特异性IgG1(A)和IgG2(B)的变化。误差棒=SEM(η=14)。将结果表示为相比干预前，在干预后大豆蛋白质的抗体水平的变化(抗体的变化倍数)。
[0038]图3:肠粘膜(远端小肠)的组织形态学
[0039]从24小时起用或未用NCC2818喂食的小猪的绒毛高度。小猪在第21天断奶改为固体食物(蛋饮食，蛋饮食+NCC2818)，或继续小猪配方(配方)。在第25天实验终止后进行组织形态学分析。将结果表示为平均值log1(lmm土标准差(SE)。
[0040]图4:在肠系膜淋巴结(MLN)细胞中的B细胞滤泡的荧光免疫组织学
[0041]当从第21天开始断奶时补充或未补充乳双歧杆菌NCC2818的大豆喂食小猪的滤泡总数㈧，在小结间细胞中表达IgA和IgM的滤泡总数⑶，和IgA或IgM阳性滤泡数(C)。误差棒=SEM (n=6)。
[0042]发明详述
[0043]定义
[0044]在此说明书中，以下术语具有以下含义:
[0045]“断奶期”是下述时期，在所述时期期间年幼哺乳动物从基于纯液体奶的营养转为适应半固体或固体食物，并从准唯一食物类型(一般在婴儿的情况下，母乳或婴儿配方)转为适应多种食物。
[0046]“耐受性”指对食物的低反应性的活性状态。
[0047]“益生菌剂”指对宿主的健康或康健具有有益作用的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(Salminen, S.，Ouwehand, A..Benno, Y.等人，Probiotics:how should they bedefined, Trends Food Sc1.Technol.(1999): 10107-10)。益生菌剂的定义一般是公认的并与WHO的定义一致。益生菌剂可包含唯一微生物菌株，多种菌株的混合和/或多种细菌种和属的混合。在混合物的情况下，单数术语“益生菌剂”可仍然用于表示益生菌剂混合物或制剂。为了本发明的目的，将双歧杆菌属的微生物视为益生菌剂。
[0048]“益生素”一般指不可消化的食物成分，其通过选择性刺激宿主肠中存在的微生物的生长和/或活性有益地影响宿主，因此试图改善宿主健康。
[0049]动物双歧杆菌乳亚种(乳双歧杆菌)菌株NCC2818(Nestl6培养物保藏)是以国际鉴定参考号CNCM-1-3446 (位于巴斯德研究所，巴黎，法国的国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes))保藏的乳双歧杆菌。乳双歧杆菌NCC2818在全文中使用。CNCM鉴定指位于巴斯德研究所，22rue du docteurRoux, 75724巴黎，法国的国家微生物保藏中心。
[0050]本发明涉及对健康年幼哺乳动物在断奶期期间，即当年幼哺乳动物开始消耗非奶食物并越来越少地依赖奶满足其营养需要时，施用益生菌剂，特别是乳双歧杆菌NCC2818 (乳双歧杆菌CNCM-1-3446)。在人婴儿中，此时期通常在婴儿为约3个月至12个月大时发生，尽管所述时期可延伸至18，24或甚至多达36个月大。婴儿一般继续定期接触新食物直到此后一年龄，甚至更大。
[0051]在以下段落中提供益生菌剂的详细施用模式。
[0052]如通过实施例1的实验数据所证明地，对断奶时的小猪施用乳双歧杆菌NCC2818可对肠相关的粘膜免疫系统的结构和功能具有显著效果。根据本发明的益生菌剂施用加速了年幼哺乳动物对新引入食物的适应并提高了年幼哺乳动物对新引入食物的耐受性。因此，所述干预提供了在断奶的挑战性时期支持婴儿的免疫适应的方法。所有婴儿可受益于本发明，包括由于其家族史处于患上异位性疾病的风险的婴儿。
[0053]益生菌剂的剂量
[0054]对年幼哺乳动物施用的乳双歧杆菌NCC2818的每日剂量为从IxlO6至lxlOncfu，优选IxlO6至IxlO9Cfu (cfu=菌落形成单位)。
[0055]乳双歧杆菌NCC2818可以大范围的百分比存在于对年幼哺乳动物施用的组合物中，只要其产生描述的积极效果。因此用于施用的每克干组合物中存在的益生菌剂的量可变化，只要符合上述每日剂量。然而，优选地，乳双歧杆菌NCC2818以等同于IxlO2和lxlOncfu/g干组合物,优选IxlO4至lxl09cfu/g干组合物之间的量存在于组合物中。这包括以下可能性，即细菌是活的，失活的或死的，或甚至以例如DNA或细胞壁物质的碎片存在。可使用本领域公知的方法使益生菌剂是非复制性的。因此，配方含有的细菌量以犹如所有细菌是活的时该细菌量的菌落形成能力表示，不管其是否实际上是活的、失活的或死的、成碎片的或任意或所有这些状态的混合。
[0056]施用方法
[0057]可对年幼哺乳动物口服施用乳双歧杆菌NCC2818 ;其可为纯的或稀释在例如水或母乳中，作为食品补充剂或作为婴儿配方奶中的成分。这样的配方可为婴儿“开始配方(starter formula)”，如果在婴儿为6个月大以前开始施用益生菌剂，或“后继配方”，如果婴儿大于6个月的话。在实施例2中提供了这样的开始配方的例子。配方也可为低变应原(HA)配方，其中牛奶蛋白质是水解的。
[0058]如果年幼哺乳动物在12和24个月大之间，可在成长奶、谷类食品或酸奶、婴儿餐、布丁或奶酪、奶制品或果汁饮料、果昔、点心或饼干或其他烘焙食品中施用益生菌剂。在实施例3中提供了这样的成长奶的例子。组合物可为货架稳定的形式或冻干产品，或可通过挤压、无菌过程或罐式灭菌甑生产。
[0059]与其他化合物共同施用
[0060]乳双歧杆菌NCC2818可与一种或多种另外的益生菌剂共同施用。这些益生菌剂优选地选自长双歧杆菌BB536(ATCC BAA-999);鼠李糖乳杆菌(CGMCC1.3724);罗伊氏乳杆菌(DSM17938)或其混合物。
[0061]乳双歧杆菌NCC2818可单独施用(纯的或稀释在水或奶中，包括例如母乳)，或以与其他化合物(例如膳食补充物、营养补充物、药物、载体、调料、可消化或不可消化的成分)的混合物施用。维生素和矿物质是典型的膳食补充物的例子。在优选的实施方案中，组合物与增强对后代免疫力的所述效果的其他化合物一起施用。这样的协同化合物可为协助乳双歧杆菌NCC2818递送至年幼哺乳动物的肠道的载体或基质。这样的化合物可为协同或单独影响婴儿的免疫应答和/或增强益生菌剂的效果的其他活性化合物。这样的协同化合物的例子是麦芽糖糊精。麦芽糖糊精的一种作用是提供益生菌剂的载体，增强其效果和预防聚集。
[0062]其他例子包括已知的益生素化合物，例如选自菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链F0S)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、阿拉伯木聚糖-寡糖(AXOS)、神经节苷月旨、部分水解的瓜尔豆胶(PHGG)、阿拉伯树胶、大豆胶、苹果提取物的碳水化合物化合物，和非益生素化合物，例如Lactowolfberry、枸杞提取物或其混合物。可存在其他碳水化合物，例如可与第一碳水化合物协同作用的第二碳水化合物。(一种或多种)碳水化合物可以约Ig至20g或1%至80%或20%至60%存在于组合物的每日剂量中。可选地，碳水化合物可以干组合物的10%至80%存在。
[0063]与乳双歧杆菌NCC2818共同施用的碳水化合物和所有其他化合物的每日剂量应符合公布的安全指南和法规要求。这对低于I岁的年幼婴儿的施用特别重要。
[0064]在一个实施方案中，营养组合物优选地包含蛋白质来源。优选膳食蛋白质作为蛋白质来源。膳食蛋白质可为任意合适的膳食蛋白质，例如动物蛋白(例如乳蛋白或肉蛋白)、植物蛋白(例如大豆蛋白、小麦蛋白、稻蛋白或豌豆蛋白)、游离氨基酸的混合物或其组合。特别优选乳蛋白例如酪蛋白和乳清蛋白。
[0065]组合物也可包含碳水化合物来源和/或脂肪来源。
[0066]如果本发明的组合物是营养组合物并包括脂肪来源，脂肪来源优选地提供营养组合物的约5%至约55%的能量；例如约20%至约50%的能量。组成脂肪来源的脂类可为任意合适的脂肪或脂肪混合物。植物脂肪是特别合适的，例如大豆油、棕榈油、椰子油、红花油、向日葵油、玉米油、卡诺拉油、卵磷脂等等。如果希望也可添加动物脂肪，例如乳脂。
[0067]可对营养组合物加入另外的碳水化合物来源。其优选地提供营养组合物的约40%至约80%的能量。可使用任意合适的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精或其混合物。如果希望也可添加另外的膳食纤维。如果添加，其优选地包含营养组合物的至多约5%的能量。膳食纤维可来自任意合适的来源,包括例如大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、低聚果糖或其混合物。可以满足合适的指南的量在营养组合物中包括合适的维生素和矿物质。
[0068]可在组合物中包括一种或多种必要的长链脂肪酸(LC-PUFA)。可添加的LC-PUFA的例子是二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。可以使其构成高于组合物中存在的脂肪酸的0.01%的浓度添加LC-PUFA。
[0069]如果希望可在营养组合物中包括一种或多种食品级乳化剂；例如单和二甘油酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和单或二甘油酯或其混合物。类似地可包括合适的盐和/或稳定齐U。可对组合物添加调料。[0070]施用期
[0071]施用期的开始一般与断奶期的开始一致，即当引入第一种非奶食物时。可选地，乳双歧杆菌NCC2818施用可在此时间前不久开始，例如引入第一种非奶食物前I或2周。其也可发生在引入第一种非奶食物不久之后。然而，如果益生菌剂干预与首次引入新食物一致或在此时点之前，认为积极效果最好。
[0072]对人婴儿，断奶开始的年龄可取决于婴儿出生的文化，因为根据不同的文化在不同的年龄进行断奶。断奶经常开始于婴儿约3至7个月大之间。因此，在该情况下，益生菌剂的施用将在开始断奶时开始，即当婴儿在约3至7个月大之间，或在此时点之前1-4周。
[0073]施用甚至可开始得更早，例如在断奶开始前3，4，5，6，7，8，9或10周。
[0074]益生菌剂的施用期可为连续的，例如每天施用直到婴儿至少12个月大。为达到更持续的效果，优选连续施用。然而，推测不连续的模式(例如每月I周期间的每日施用，或隔周的每日施用)可以诱导对婴儿的有益效果。
[0075]益生菌剂施用的持续时间可根据婴儿和其出生的文化不同而变化。甚至短持续时间的施用，例如1，2或3个月的施用都预期具有积极效果，如果与断奶同时或在断奶前不久开始施用。较长的持续时间将在年幼哺乳动物中提供较长时间的积极效果。一般，持续益生菌剂施用直到婴儿至少为12个月大。可继续施用直到婴儿为18个月，或24个月或甚至到3岁大。婴儿一般持续地定期接触新食物直到4岁大。
[0076]优选地，通过每日摄入或隔日摄入对婴儿施用，每日I次或2次服用益生菌剂。
[0077]益生菌剂施用的效果
[0078]在断奶期期间对婴儿施用的乳双歧杆菌NCC2818提高了对新引入食物的耐受性。这已在使用小猪断奶动物模型的一组实验中证明，如在实施例1中详述。发明人选择小猪模型研究乳双歧杆菌NCC2818在断奶时的影响，因为小猪在其出生和出生后发育中相比啮齿类更与人可比较。另外，最近在小鼠、猪和人中比较了 147个基因型、表型和功能参数，结果显示80%的这些参数在猪和人之间比在小鼠和人之间更类似(Wernersson R, SchierupMH, Jorgensen FG,等人，2OO5, Pigs in sequence space: A0.66Xcoverage pig genomesurvey based on shotgun sequencing.BMC Genomics，6:70)。
[0079]本文提供的结果明确证明在断奶时对小猪施用乳双歧杆菌NCC2818可对肠相关的粘膜免疫系统的结构和功能具有显著的效果。
[0080]在本发明的一个实施方案中，正常在断奶时观察到的对于新引入蛋白质的特异性的全身IgG的短暂增加被增强了。当断奶伴随乳双歧杆菌NCC2818的施用时，所述增加出现的更迅速且程度更高。
[0081]因此，在实施例1中，根据图1A中的喂食方案I喂食的小猪在第3周时断母乳，改为大豆饮食，补充了以4.2xl06cfu/ml (约2xl09Cfu/kg代谢wt/天)的浓度混合在配方中的乳双歧杆菌NCC2818的大豆饮食，或改为蛋饮食。在断奶后第0，7和14天测量每组中动物血清中的大豆特异性IgGl和IgG2水平(见图2)。这对应图1A中的出生后21，28和35天。观察到用免疫系统以前未知的蛋白质喂食断奶时的小猪在断奶后I和2周导致血清中特定IgG的瞬时增加。也观察到当补充乳双歧杆菌NCC2818时，大豆喂食的小猪显示了血清大豆特异性IgG2的显著较高的增加(p=0.03;图2B)和大豆特异性IgG1的较高的增加趋势(图2A)。[0082]对食物蛋白质的提升的血清IgG抗体应答已与在人中对IgE介导的变应性疾病和在猪中对断奶后腹湾的降低的易感性相联系(Li，D.F.等人，Interrelationship betweenHypersensitivity to Soybean Proteins and Growth-Performance in Early-ffeanedPigs, Journal of Animal Science, 1991; 69:4062-4069 和 Strait, R.T.，等人 Ingestedallergens must be absorbed systemically to induce systemic anaphylaxis, Journalof Allergy and Clinical Immunology;127:982-989.el.)。
[0083]因此，在实施例1的补充了乳双歧杆菌NCC2818的小猪中观察到的大豆特异性IgG的较高的短暂增加指示在断奶期间施用乳双歧杆菌NCC2818加速和增加小猪免疫系统对新引入的蛋白质的适应水平。
[0084]在另一个实施方案中，当断奶伴随乳双歧杆菌NCC2818的施用时，年幼哺乳动物的绒毛高度增加。
[0085]绒毛高度可被视为婴儿健康良好的指示物。在胃肠道的伴随疾病如乳糜泻或病毒感染中经常观察到绒毛萎缩(Cummins, A.等人，American Journal of Gastroenterology，2011，106，145-50;和 Boshuizen,等人;Journal of Virology, 2003，77(24)，13005-16)。在小猪中也有研究显示，在断奶时的肠道完整性的急性损伤特别地通过绒毛长度的减少指示。相反地，此时期之后的适应是通过空肠中的绒毛长度的增加标记的(Montagne，L.等A , British Journal of Nutrition, 2007，97，45-57)。因此，较长的绒毛高度与变得适应新食物的肠道相关。
[0086]图3显示了在图1中的喂食方案II后，动物的肠粘膜(远端小肠)的组织形态学。由于断奶在粘膜形态学中的急性改变发生在断奶后2-5天之间。因为实验目的是为了证明乳双歧杆菌NC2818对肠粘膜形态学的有益影响，相应地调整喂食方案II的实验方案。因为认为益生菌剂需要一定的喂食持续时间以实现效果，在这些动物中的喂食从24小时龄时开始。因此，测量了从出生后24小时开始喂食或未喂食乳双歧杆菌NCC2828的小猪的绒毛高度(A)。猪在第21天断奶改为固体食物(蛋饮食，蛋饮食+NCC2818)，或继续小猪配方(配方)。
[0087]在第25天测量了绒毛高度。图A证明相比未补充的组，在补充了乳双歧杆菌NCC2818的蛋组中绒毛高度的增加。一般将足够的绒毛高度视为生理上有功能的和发育良好的肠粘膜的标志。一般将绒毛高度的安全保护视为保护性的。因此，可将由乳双歧杆菌NCC2818的绒毛高度的增加视为粘膜保护的标志。
[0088]在另一个实施方案中，在断奶时补充乳双歧杆菌NCC2818似乎促进了在肠系膜淋巴结(MLN)中的某些免疫过程的转换，从较不成熟的IgM占优势的抗体应答转换为更成熟的IgA占优势的应答。
[0089]图4显示了实施例1喂食方案I的动物的MLN中的B细胞滤泡的荧光免疫组织学。比较补充组(具有乳双歧杆菌NCC2818)和非补充组，观察到淋巴结中的滤泡总数没有变化(图4A)。然而，在补充组中IgM特异性滤泡和小结间IgM生产细胞的数量都显著减少了(p〈0.0001;图4B，C)。相比非补充组，IgA特异性滤泡的数量也显著增加(分别为p=0.04和 ρ〈0.0001 ;图 4Β, C)。
[0090]这些结果显示，在断奶期间补充了乳双歧杆菌NCC2818的动物中对新引入的食物蛋白质的免疫应答变得更为“成熟”。此更成熟的应答可被视为对新弓I入食物的耐受性的提高。年幼哺乳动物的肠道系统对新食物的适应变快。因此，发明人猜想此更快的适应将转换为与断奶有关的脆弱期的缩短。因此，预防了与断奶有关的病理学症状，或降低了其严重程度。此外，预防和/或降低了在生命中后来的这些病况的长期影响。
[0091]因此，施用根据本发明的益生菌剂对年幼哺乳动物具有预防效果，预防了与可能由在断奶期间引入新食物导致的病理状态有关的轻微不适或严重不适。
实施例
[0092]实施例1:研究断奶时乳双歧杆菌NCC2818的影响的小猪模型
[0093]进行了 2个实验。
[0094]在根据喂食方案I的第一个实验中(图1A)，在生命的前三周让小猪的母亲哺乳小猪。在第3周，使动物断奶改为具有基于补充了乳双歧杆菌(NCC2818)的大豆或未补充的大豆的蛋白质内含物的固体食物，或改为未补充的卵清蛋白(OVA)饮食。所有动物在第7周转换为鱼粉饮食，一组动物持续补充乳双歧杆菌NCC2818。在第11周处死动物。
[0095]在断奶后第0，7和14天测量全身大豆特异性IgG水平(图2)，在处死时检查肠系膜淋巴结(MLN)细胞中的IgA，IgM和⑶21水平(图4)。
[0096]在根据喂食方案II的第二个实验中(图1B)，从24小时起用配方喂养小猪，所述配方补充了或未补充乳双歧杆菌NCC2828。在第21天让小猪断奶改为固体食物(蛋饮食，蛋饮食+NCC2818)，或让保持小猪配方(配方)。在第25天，即处死小猪那天测量肠粘膜样品的绒毛高度。结果显示在图3中。.[0097]下面提供实验细节。
[0098]动物模型:
[0099]根据当地的伦理准则进行所有动物住房和实验程序:所有实验在英国内政部许可下进行，且通过当地伦理审查小组的批准。使用一头公猪的精液(由Hermitage-Seaborough Ltd, North Tawton, Devon, UK 提供)人工受精 7 头远系繁殖的母猪。在分娩前6周将母猪运至临床兽医学系并喂食基于小麦的饮食(BOCM PaulsLtd, ffherstead, UK)。
[0100]喂食方案I (图1A)
[0101]在3周大时，使小猪断奶并窝匹配(litter-matched)为3组。此时一组接受动物双歧杆菌乳亚种(CNCM 1-3446)，或称为乳双歧杆菌NCC2818，益生菌剂饮食补充，其形式为混合进配方的浓度为4.2xl06CFU/ml (约2xl09cfu/kg代谢wt/天)的喷雾干燥的培养物。每日两次对合适的组喂食所需量的补充了新鲜益生菌剂的饲料，直到猪11周大时结束实验。剩余2组不接受益生菌剂补充。益生菌剂喂食的动物和对照动物在通过生物安全屏障隔开的不同套房中。接受益生菌剂的小猪断奶后改为基于大豆的饮食，而不接受益生菌剂的小猪断奶后改为大豆或卵清蛋白(蛋)饮食。所有饮食补充有适当水平的维生素和矿物质，并通过 Parnutt Foods Ltd (Sleaford, Lincolnshire, UK)订购生产。
[0102]从7周大时，对所有3组喂食不含蛋和大豆的基于鱼的饮食，酌情具有或不没有益生菌剂。
[0103]所有小猪在第3，4和5周大时通过静脉穿刺取血以收集血清。在第11周大时，给小猪服用镇静剂阿扎哌隆(azaperone)并用过量巴比妥类药物实施安乐死。在死后回收心血和组织。
[0104]喂食方案11(图1B)
[0105]在第I天大时将小猪与其母亲分开并窝匹配为2组。然后直到第21天，一组喂食补充了动物双歧杆菌乳亚种(CNCM 1-3446)，又称乳双歧杆菌NCC2818的配方，其形式为混合进配方的浓度为4.2xl06CFU/ml (约2xl09cfu/kg代谢wt/天)的喷雾干燥的培养物。第二组喂食不含乳双歧杆菌NCC2818补充的配方，直到第21天。每日两次对合适的组喂食所需量的补充有新鲜益生菌剂的饲料，直到猪25天大时结束实验。
[0106]当小猪3周大时，将乳双歧杆菌NCC2818补充组分为2组，或断奶改为补充了乳双歧杆菌NCC2818的蛋饮食，或完全不断奶。相似地，将未补充的组分为2组，或断奶改为蛋饮食，或完全不断奶。所有饮食补充了适当水平的维生素和矿物质，并通过Parnutt FoodsLtd (Sleaford, Lincolnshire, UK)订购生产。将饮食设计为含有21%的蛋蛋白质。
[0107]在第25天大时给小猪服用镇静剂阿扎哌隆并用过量巴比妥类药物实施安乐死。在死后回收组织。
[0108]抗原特异性免疫球蛋白的测量(图2)
[0109]在第0，7和14天从喂食方案I的动物中采集血清样品。通过ELISA分析样品的抗卵清蛋白IgG1和IgG2抗体，如在Bailey M,等人Effects of infection withtransmissible gastroenteritis virus on concomitant immune responses to dietaryand injected antigens, Clin.Diagn.Lab.1mmunol.2004; 11:337-43 中详细描述的。简言之，用来自鸡蛋白的卵清蛋白(Sigma)包被96孔微板，然后用在PBS-吐温20中的2%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)封闭非特异性结合位点。洗涤后，对板加入血清样品的连续稀释物和参考标准物。参考标准物是在用卵清蛋白超免疫后得到的猪血清。使用同种型特异性单克隆抗体并随后使用上述HRP缀合的山羊抗小鼠检测结合的抗大豆18匕和IgG2抗体，并通过将样品插值进参考标准物测定抗体的相对浓度。
[0110]为了比较在远系繁殖的动物中由断奶产生的血清抗体变化，所述远系繁殖的动物中初始水平不同，将结果表示为操纵后与操纵前的抗体比例(抗体的变化倍数)。
[0111]免疫组织学
[0112]样品收集
[0113]在每头实验小猪死后不久移出MLN组织。在0CT(Tissue TEK, BDH, Lutterworth, Leicestershire, UK)中包埋组织并在异戍烧中速冻,所述异戍烧在液氮气相中预冷至约-70°C。将样品储存在_80°C直到切片。使用Model OTF低温切片机(Brights InstrumentCompany Ltd.，Huntingdon.UK)切成这些组织的5 μ m切片。风干切片24小时,然后通过浸入丙酮15分钟固定。在储存于_80°C前允许切片干燥。
[0114]荧光免疫组织学和分析
[0115]用于双色荧光免疫组织学，使用小鼠抗猪单克隆抗体(同用于ELISA的IgA和IgM)以鉴定游离的和细胞结合的IgA和IgM阳性细胞(图4)。使用的缀合的二级试剂是:缀合 FITC 的山羊抗小鼠 IgG1 (Southern Biotechnology, AMS Biotechnology, Oxon, UK)和缀合 TRITC 的山羊抗小鼠 IgG2b (Southern Biotechnology)。如 Inman 等人，2010, Inman, C.F.，Rees, L.E.N.，Barker E.，Haversonj K.，Stokes, C.R.，Bailey, Μ.，Validation ofcomputer-assisted, pixel-based analysis of multiple-colour immunofluorescencehistology, Journal of Immunological Methods, 2005; 302:156-167 描述的进行组织染色、图像捕获和自动化图像分析，不同的是使用在PBS中的10%山羊血清实现Fe受体阻断。
[0116]组织形态学和分析
[0117]如上在样品收集中指示的制备样品并用苏木精和伊红染料染色，然后使用图像软件用图像捕获和自动化图像分析进行分析，以检测绒毛长度。
[0118]实施例2
[0119]开始配方
【权利要求】
1.益生菌剂，所述益生菌剂在断奶期期间对健康年幼哺乳动物施用，用于提高对新引入食物的耐受性。
2.根据权利要求1的益生菌剂，其中在暴露于新引入的食物时，体液免疫应答，特别是G类免疫球蛋白生产的短暂增加，相比在未接受益生菌剂的年幼哺乳动物中出现的短暂的增加，出现得更迅速和/或程度更高。
3.根据权利要求1或2的益生菌剂，其中相比未接受益生菌剂的年幼哺乳动物的肠粘膜绒毛的高度和/或面积，在断奶期期间肠粘膜绒毛的高度和/或面积增加了多于15%。
4.根据权利要求1至3中任一项的益生菌剂，其中益生菌剂是动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal is)。
5.根据权利要求4的益生菌剂，其中益生菌剂是动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animal is subsp.Lactis)(乳双歧杆菌(B.1actis))。
6.权利要求5的益生菌剂，其中益生菌剂是菌株乳双歧杆菌NCC2818。
7.权利要求1至6中任一项的益生菌剂，其中所述益生菌剂以从IxlO2至lxlO11，优选IxlO6至IxlO9Cfu (cfu =菌落形成单位)的每日剂量施用。
8.权利要求1至7中任一项的益生菌剂，其中对年龄在约3个月和约24个月之间的健康年幼人类施用所述益生菌剂。
9.权利要求1至8中任一项的益生菌剂，其中以其纯的形式，或稀释在水中，或在适于对年幼哺乳动物施用的组合物中施用所述益生菌剂。
10.权利要求1至9中任一项的益生菌剂，其中所述益生菌剂与一种或多种另外的益生菌剂组合施用。`
11.根据权利要求10的益生菌剂，其中一种或多种另外的益生菌剂优选地选自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) BB536 (ATCC BAA-999);鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus) (CGMCC1.3724);罗伊氏乳杆菌(Lactobacilus reuteri) (DSM17938)或其混合物。
12.根据前述权利要求中任一项的益生菌剂，其中在组合物中施用所述益生菌剂，其中所述组合物包含其他成分或益生素，所述其他成分或益生素优选地选自菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链F0S)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、阿拉伯木聚糖-寡糖(AXOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、大豆胶、Lactowo If berry、枸杞提取物或其混合物。
13.根据前述权利要求中任一项的益生菌剂，其中所述益生菌剂已被失活从而使其不能复制。
14.根据前述权利要求中任一项的益生菌剂，其中作为婴儿配方、后继配方、成长奶、谷类食品或酸奶、婴儿餐、布丁或奶酪、奶制品或果汁饮料、果昔、点心或饼干或其他烘焙食品的形式施用益生菌剂。
15.在断奶期期间对健康年幼哺乳动物施用的益生菌剂用于加速对新引入食物的适应的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中益生菌剂或益生菌剂的混合物 a.在断奶开始时或断奶前不久以每日剂量的益生菌剂对年幼哺乳动物施用，和 b.在断奶期开始后至少4周的时期继续每日施用。
17.根据权利要求16的用途，其中益生菌剂是乳双歧杆菌NCC2818。
18.根据权利要求17或18的用途，其中每日剂量为约IxlO6至约IxlO9菌落形成单位(cfu)的乳双歧杆菌NCC`2818。
【文档编号】A61K31/702GK103874427SQ201280034651
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月12日
【发明者】S·顿克尔, M·刘易斯, A·梅赛尼尔, A·辛格, M·贝利 申请人:雀巢产品技术援助有限公司