从无花果枝叶提取的具有抗癌作用的成分和方法
【专利摘要】本发明是从无花果枝叶中提取的水溶性抗癌成份及其提取分离和纯化方法，属于中药【技术领域】，它是将新鲜无花果枝和叶经一定溶剂和工艺提取分离和纯化后获取的无花果枝叶提取物。经体内外实验证明：本发明可在体外抑制肝癌、胃癌、肺癌等肿瘤细胞的生长，在体内可抑制肝癌实体瘤的生长，且无毒副作用，可以作为开发预防和治疗癌症的药物或保健食品。
【专利说明】从无花果枝叶提取的具有抗癌作用的成分和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物有效成分开发利用领域，特指无花果枝叶中分离出的具有抗癌作用的成分及其提取分离和纯化方法。
【背景技术】
[0002]无花果系桑科榕属植物(Ficus C arica I)，具有广泛的营养价值和药用价值。其果实含有多种人体所需的维生素、氨基酸、酶类以及微量元素，可以药食两用。近年来的研究表明，无花果及叶具有抗疲劳、抗衰老、抗病毒、抗肺癌等作用。现代医学研究发现无花果果实和叶中含有多种抑癌活性物质:如苯甲醛、补骨脂素、香豆素类化合物、呋喃类芳香化合物，大环萜类化合物和佛手柑内脂等，特别是无花果是富硒植物，叶片和果实中含硒量很高，上述多种抑癌物质协同作用，能抑制、破坏癌细胞蛋白酶的生成，提高人体免疫功能，使癌细胞失去营养而死亡。虽然目前从无花果果实和叶中发现了不少抗癌成分，但这些抑癌活性物质均不溶于 水或微溶于水，而本发明从无花果枝叶的水提液中分离出具有广谱抗癌效果的成分。
【发明内容】
[0003]本发明利用成本较低的新鲜无花果枝叶，优化提取方法，提供一种从中提取分离水溶性抗癌活性成分的方法。
[0004]上述提取方法如下:
[0005]新鲜无花果枝叶(各占一半重量)，切碎，超临界CO2萃取，萃取物加入10-20倍重量的蒸馏水，超声破碎l_2h，沸水煮40-60min，过滤，滤液留存。离心取上清，在冰浴中加入15% -30%三氯醋酸，直至溶液不再浑浊。4°C放置4-10h，离心除去沉淀，冷冻干燥冻干成粉末状，取冻干粉末，加入10-20倍重量的70% -95%乙醇，4°C静置过夜，用无水乙醇多次清洗醇沉物，挥干醇。DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱进行层析分离,用
0.05-2.0mol/L NaCl-PBS溶液梯度洗脱，流速lml/min，每瓶收集8ml。作洗脱曲线，合并主峰部分，冻干，获得两个粗提物(F1、F2)。合并流分，硫酸-蒽酮法结合紫外检测。葡聚糖凝胶过滤层析，取粗提物溶于蒸馏水中，以0.lmol/L NaCl溶液洗脱，控制流速为lml/min，每瓶收集8ml，以苯酚-硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰，冻干，获取纯化的F1、F2。
【具体实施方式】
[0006]下面结合实施例对本发明进一步阐述:
[0007]具体实施例1.称取新鲜无花果枝叶(各占一半重量)200g，粉碎至100目，在26MPa/40°C下超临界CO2萃取，萃取物加入2000ml蒸馏水，超声破碎Ih(20-30KHZ，超声10s，间断10s)，沸水煮40min，过滤，滤液留存，方法如前，重复三次，合并滤液。离心取上清，在冰浴中加入15%三氯醋酸，直至溶液不再浑浊。4°C放置4h，离心除去沉淀，冷冻干燥冻干成粉末状，取冻干粉末10g，加入100ml95%乙醇，4°C静置过夜，用无水乙醇清洗醇沉物三次，挥干醇。纤维素阴离子交换剂用0.5mol/L NaOH、HCl和蒸馏水依次处理至中性，重复处理3次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱，用PH = 7.6PBS溶液平衡。取粗提粉末2.0g,溶于少量蒸懼水，离心除去不溶物，上清用DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱进行层析分离，用0.lmol/L NaCl-PBS溶液梯度洗脱，流速lml/min，每瓶收集8ml。以苯酚-硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰部分，冻干，获得两个粗提物(F1、F2)。合并流分，硫酸-蒽酮法结合紫外检测。S^hadex G200葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡10h，再以100°C溶胀4h后抽气装柱，用0.lmol/L NaCl溶液液平衡48h，称取500mg粗提物，溶于少量蒸馏水中，上样，S^hadex G200葡聚糖凝胶过滤层析，以0.lmol/L NaCl溶液洗脱，控制流速为lml/min,每瓶收集8ml，以苯酚-硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰，冻干，获取纯化的F1、F2。
[0008]具体实施例2.称取新鲜无花果枝叶(各占一半重量)200g，粉碎至100目，在26MPa/40°C下超临界CO2萃取，萃取物加入3000ml蒸馏水，超声破碎2h(20_30KHZ，超声10s，间断10s)，沸水煮60min，过滤，滤液留存，方法如前，重复三次，合并滤液。离心取上清，在冰浴中加入15%三氯醋酸，直至溶液不再浑浊。4°C放置10h，离心除去沉淀，冷冻干燥冻干成粉末状，取冻干粉末10g，加入100ml70%乙醇，4°C静置过夜，用无水乙醇清洗醇沉物三次，挥干醇。纤维素阴离子交换剂用0.5mol/L Na0H、HCl和蒸馏水依次处理至中性，重复处理3次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱，用PH = 7.6PBS溶液平衡。取粗提粉末2.0g,溶于少量蒸懼水，离心除去不溶物，上清用DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱进行层析分离，用0.lmol/L NaCl-PBS溶液梯度洗脱，流速lml/min，每瓶收集8ml。以苯酚-硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰部分，冻干，获得两个粗提物(F1、F2)。合并流分，硫酸-蒽酮法结合紫外检测。S^hadex G200葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡10h，再以100°C溶胀4h后抽气装柱，用0.lmol/L NaCl溶液液平衡48h，称取500mg粗提物，溶于少量蒸馏水中，上样，S^hadex G200葡聚糖凝胶过滤层析，以0.lmol/L NaCl溶液洗脱，控制流速为lml/min,每瓶收集8ml，以苯酚-硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰，冻干，获取纯化的F1、F2。
[0009]用实施例1和实施例2所得的无花果枝叶提取物进行抗癌活性检测，具体方法和结果如下:
[0010]1.从无花果枝叶中提取、纯化获取物F1、F2体外是否具有抗癌活性
[0011](I)用RPM1-1640培养液溶解F1、F2，离心两次，取上清，0.22μπι滤膜过滤，备用。将癌细胞(肝癌H印G2、胃癌SGC7901、肺癌Α549)种于96孔培养板中，细胞浓度为5000个/mL。放培养箱(37°C，5% CO2)中培养，细胞贴壁后加入不同浓度F1、F2 (0，0.1,0.5mg/mL)，每种剂量设四个重复。并设人正常细胞作为对照，加入25mg/mL FLE作为阴性对照。
[0012](2) MTT法检测细胞增殖活性:F1、F2处理细胞24h后，加入MTT (0.25mg/mL)后放入370C ,5% CO2培养箱中继续培养4h，吸除培养液，每孔加入100 μ L DMSO溶解紫色颗粒，然后用酶标仪测570nm下的吸光度(OD)值，实验重复三次，结果见表1。
[0013](3)流式细胞仪检测细胞凋亡:不同浓度F1、F2作用24h后收获细胞移入试管，PBS洗涤I次，400 μ L Binding Buffer重悬细胞。取200 μ L细胞悬液加入AnnexinV5 μ L，PIlO μ L避光20min,加入200 μ L Binding Buffer上流式细胞仪检测。用Cellquest软件获取数据，用ModFit软件进行数据分析，结果见表1。[0014]表1F1、F2对不同癌细胞增殖活性和凋亡的影响
[0015]
【权利要求】
1.无花果枝叶提取物，其特征是以枝和叶以1:1比例混合为原料，通过超声水提、层析纯化获取的抗癌活性成分及方法。
2.如权利要求1所述的无花果枝叶提取物，其特征提取方法如下: 新鲜无花果枝叶(各占一半重量)，切碎，超临界CO2萃取，萃取物加入10-20倍重量的蒸馏水，超声破碎l_2h，沸水煮40-60min，过滤，滤液留存。离心取上清，在冰浴中加入15% -30%三氯醋酸，直至溶液不再浑浊。4°C放置4-10h，离心除去沉淀，冷冻干燥冻干成粉末状，取冻干粉末，加入10-20倍重量的70% -95%乙醇，4°C静置过夜，用无水乙醇多次清洗醇沉物，挥干醇。DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换柱进行层析分离,用0.05-2.0mol/L NaCl-PBS溶液梯度洗脱，流速lml/min，每瓶收集8ml。作洗脱曲线，合并主峰部分，冻干，获得两个粗提物(F1、F2)。合并流分，硫酸-蒽酮法结合紫外检测。葡聚糖凝胶过滤层析，取粗提物溶于蒸馏水中，以0.lmol/L NaCl溶液洗脱，控制流速为lml/min，每瓶收集8ml，以苯酚 -硫酸法测0D490，作洗脱曲线，合并主峰，冻干，获取纯化的F1、F2。
3.从无花果枝叶分离纯化的水溶性成分Fl和F2或Fl和F2的复方制剂用于开发预防和治疗癌症的药物或保健食品。
【文档编号】A61K36/60GK103961409SQ201310046614
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日
【发明者】解美娜 申请人:解美娜