G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应用。本发明提供了GIT2蛋白在制备有如下功能产品中的应用：（1）与TRAF6蛋白结合；（2）与TRAF6蛋白相互作用；（3）与CYLD蛋白结合；（4）与CYLD蛋白相互作用；（5）促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合；（6）促进CYLD蛋白对泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；（7）促进泛素化的TRAF6蛋白发生去泛素化；（8）抑制NF-κB信号通路的活化；（9）治疗和/或预防炎症；（10）治疗和/或预防炎症性肠炎；（11）治疗和/或预防脓毒症；（12）抑制巨噬细胞活化；（13）治疗和/或预防由巨噬细胞活化导致的炎症。本发明对严重危害人类疾病的炎症性肠炎及脓毒症的治疗具有重要的社会效益及经济效益。
【专利说明】G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应
用
【技术领域】
[0001]本发明涉及G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应用。
【背景技术】
[0002]细菌感染是临床常见疾病，可以导致机体局部或全身性感染，甚至会导致多器官功能障碍综合症。一旦重度感染导致多功能器官衰竭，死亡率高达80%。
[0003]随着Toll样受体的发现，机体针对微生物所产生免疫反应的细胞及分子学机制逐步得到了人们的认识。Toll样受体是一类模式识别受体，可以通过识别病原体的相关分子激活相应的信号通路，如NF- K B信号通路及MAPK信号通路，调节炎症细胞因子的表达。NF-kB信号通路是生物体内重要的信号通路之一。该通路参与了许多生理过程的调节，其中包括细胞增殖、分化和凋亡，特别在免疫和炎症反应中起关键的调控作用。许多因素都能激活NF-K B通路，如细胞因子刺激、细菌或病毒感染、DNA双链断裂。在未激活的状态下，NF- K B转录因子与I K B抑制蛋白结合，被阻滞在细胞质中。IKK激酶复合体是NF- κ B通路活化的重要节点。IKK复合体包括3个亚基:催化亚基IKK a、IKK β和调节亚基IKK Y。活化的IKK激酶复合体可以磷酸化I K B蛋白，磷酸化的I K B被泛素化降解，使NF- K B进入细胞核调控靶基因转录。G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2 (简称GIT2蛋白)含有多个结构域，在很多种组织中都广泛分布，通过与细胞内的其他蛋白的相互作用调节这些分子在不同的细胞区室内运动。
[0004]TRAF6蛋白和CYLD蛋白均为已知的参与炎症反应的蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供G蛋白偶联受体相互作用蛋白2在制备抗炎症药物中的应用。
[0006]本发明提供了 GIT2蛋白在制备广品中的应用；所述广品的功能为如下(I)至(13)中的至少一种:(I)与TRAF6蛋白结合；(2 )与TRAF6蛋白相互作用；(3 )与CYLD蛋白结合；
(4)与CYLD蛋白相互作用；(5)促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合；(6)促进CYLD蛋白对泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；(7)促进泛素化的TRAF6蛋白发生去泛素化；(8)抑制NF- K B信号通路的活化；(9)治疗和/或预防炎症；(10)治疗和/或预防炎症性肠炎；
(11)治疗和/或预防脓毒症；(12)抑制巨噬细胞活化；(13)治疗和/或预防由巨噬细胞活化导致的炎症。
[0007]本发明还保护一种产品，其活性成分为GIT2蛋白；所述产品的功能为如下(I)至
(13)中的至少一种:(1)与TRAF6蛋白结合；(2)与TRAF6蛋白相互作用；(3)与CYLD蛋白结合；(4)与CYLD蛋白相互作用；(5)促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合；(6)促进CYLD蛋白对泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；(7)促进泛素化的TRAF6蛋白发生去泛素化；
[8]抑制NF-K B信号通路的活化；(9)治疗和/或预防炎症；(10)治疗和/或预防炎症性肠炎；(11)治疗和/或预防脓毒症；(12 )抑制巨噬细胞活化；(13 )治疗和/或预防由巨噬细胞活化导致的炎症。所述产品中还可包括可被接受的载体。产品可以制成注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、肠溶衣、豪微球、微乳或复乳。
[0008]以上任一所述GIT2蛋白是如下(a)或(b)或(C)或(d)或(e)或(f)或(g):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(g)将序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由其衍生的蛋白质。
[0009]以上任一所述GIT2蛋白可为从体内纯化获得的天然蛋白质或体内重组表达的蛋白质。
[0010]以上任一所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i):(h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(i) 将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列8衍生的蛋白质。以上任一所述CYLD蛋白是如下(j)或(k):(j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(k)将序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列10衍生的蛋白质。以上任一所述(8)中，所述NF-K B信号通路的活化是由脂多糖激活的TLR4蛋白激活的。以上任一所述(8)中，所述NF-K B信号通路的活化是由细胞因子IL-1 β激活的。
[0011]本发明发现GIT2蛋白可以抑制细菌感染后炎症因子的产生，提高内毒素休克、大肠杆菌感染及肠炎的存活率，保护肝脏、肾脏等器官免于炎症损伤。本发明对严重危害人类疾病的炎症性肠炎及脓毒症的治疗具有重要的社会效益及经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为实施例1中各组小鼠的存活率结果。图2为实施例1中各组小鼠的平均体重变化。图3为实施例1中的HE染色照片。图4为实施例1中检测细胞因子TNF-α和细胞因子IL-6的浓度的结果。图5为实施例2中小鼠的存活率结果。图6为实施例2中小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血尿素氮的浓度结果。图7为实施例2中的HE染色照片。图8为实施例2中的脾脏并称重结果。图9为实施例2中检测细胞因子TNF-α和细胞因子IL-6的浓度的结果。图10为实施例3中检测细胞因子TNF-α和细胞因子IL-6的浓度的结果。图11为实施例5中的Western Blot检测结果。图12为实施例6中的WesternBlot检测结果。图13为实施例7中的Western Blot检测结果。图14为实施例8中的Western Blot检测结果。图15为实施例9中的Western Blot检测结果。图16为实施例10的结果。
【具体实施方式】
[0013]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例2中所用的大肠杆菌，获自ATCC，ATCC编号为25922。HEK293细胞:购自美国标准生物品收藏中心。针对Flag的抗体:购自Sigma公司，产品目录号F-3165。针对Myc的抗体:购自Santa Cruz公司，产品目录号sc_40。针对HA的抗体:购自Cal1-bio公司，产品目录号CB100301。细胞因子IL-1 β:购自P印roTech，200-01B。
[0014]GIT2基因如序列表的序列2所示,具有六种不同的剪辑方式，即GIT2蛋白如序列表的序列1、序列表的序列3、序列表的序列4、序列表的序列5、序列表的序列6或序列表的序列7所不。TRAF6蛋白如序列表的序列8所不,TRAF6基因如序列表的序列9所不。CYLD蛋白如序列表的序列10所不，CYLD基因如序列表的序列11所不。TLR4蛋白如序列表的序列12所示。
[0015]GIT2基因敲除小鼠是将C57BL/6小鼠进行GIT2基因敲除得到的，提及C57BL/6小鼠和GIT2基因敲除小鼠(在文献中对应的名称为“Git2v mice，，)的文献:Mazaki Y，Hashimoto S，Tsujimura T，Morishige M，Hashimoto A，Aritake K，YamadaA, Nam JMj Kiyonari H，Nakao K，Sabe H.(2006)Neutrophil direction sensing andsuperoxide production linked by the GTPase-activating protein GIT2.NatureImmunology7:724-727.)。
[0016]质粒pcDNA3/poly-HA_tagged ubiquitin(简称质粒 HA-Ubiquitin):参考文献:Zhang Yj Wang J，Yuan Y，Zhang Wj Guan Wj Wu Zj Jin C，Chen H，Zhang L，Yang X，HeF..(2010)Negative regulation of HDM2to attenuate p53degradation by ribosomalprotein L26.0ncogene.2010Jul22; 29 (29): 4157-69)。质粒 HA-Ubiquitin 是在 HA 空载体中导入泛素蛋白酶体通路元件得到的质粒。
[0017]pcDNA3-HA vector (简称 HA 空载体):参考文献:Nakahata S，YamazakiS，Nakauchi H，Morish ita K..(2010)Downregulationof ZEBland overexpression ofSmad7contribute to resistance to TGF-betal—mediated growth suppression in adultT-cell leukemia/lymphoma.Nucleic Acids Res.20100ct;38(19):6544-54.)。
[0018]质粒 Flag-tagged TRAF6 (mammalian expression plasmids for Flag-taggedTRAF6 (简称质粒 Flag-tagged TRAF6):参考文献:He X，Li Y，Li C，Liu LJj Zhang XDj LiuY，Shu ΗΒ..(2012)USP2a negatively regulates IL-1β-and virus-1nduced NF-κ Bactivation by deubiquitinating TRAF6.J Mol Cell Biol.2012Jul5)。质粒Flag-taggedTRAF6表达具有Flag标签的TRAF6蛋白。
[0019]质粒Myc_TLR4、含有NF-κΒ的荧光素酶报告基因质粒在文献中的名称为luciferase reporter plasmid( κ B-Luc)，TK海肾焚光素酶报告基因质粒在文献中的名称为Renilla luciferase expression vector (pRL-TK)，提及上述三个质粒的文献如下:Zhang Wj Wang Jj Zhang Y，Yuan Y，Guan Wj Jin C，Chen H, Wang X，Yang X，He F.(2010)The scaffold protein TANK/1-TRAF inhibits NF-kappaB activation by recruitingpolo-like kinasel.Mol Biol Cell.2010Jull5;21 (14):2500-13.?
[0020]实施例1、GIT2基因敲除小鼠更容易患炎症性肠炎
[0021]分组处理前一天作为实验第O天，实验第I天开始进行分组处理如下:
[0022]第一组(WT+DSS ；10只C57BL/6小鼠):实验第I天至第5天，小鼠连续5天自由饮用含2g/100mL葡聚糖硫酸钠(DSS)的水，以诱导肠炎，从实验第6天开始小鼠自由饮用正常水；
[0023]对照组(K0+DSS ；9只GIT2基因敲除小鼠):实验第I天至第5天，小鼠连续5天自由饮用含2g/100mL葡聚糖硫酸钠(DSS)的水，以诱导肠炎，从实验第6天开始小鼠自由饮用正常水；
[0024]实验第I天至第11天，每天统计每组小鼠的存活率，存活率=(当天还存活的小鼠只数/实验第O天该组小鼠的总只数)X 100。各组小鼠的存活率结果见图1。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠炎症性肠炎的死亡率上升，即GIT2蛋白能够降低小鼠炎症性肠炎的
死亡率。
[0025]分别于实验第O天、第2天、第4天、第6天和第8天对存活小鼠进行称重(早晨和晚上各一次) ，以校正体重的波动，每组小鼠的平均体重变化=(特定某天的平均体重/实验第O天的平均体重)X 100。各组小鼠的平均体重变化见图2。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠由于发生炎症性肠炎导致的体重下降幅度显著增加，即GIT2蛋白能抑制小鼠炎症性肠炎引起的体重的下降。
[0026]实验第8天，处死小鼠，分别收集血清和结肠。将结肠切片后用甲醛固定，然后进行苏木精-伊红染色，照片见图3。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠结肠组织的损伤程度增加了，即GIT2蛋白能降低硫酸葡聚糖钠对结肠组织的损伤。分别利用小鼠TNF-α ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司，EMC102a)和小鼠IL-6ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司，EMC004a)按试剂盒说明书检测血清中的细胞因子TNF-α和细胞因子IL_6的浓度，结果见图4 (各组小鼠均取平均值)。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠由结肠炎引起的炎症因子水平升高了，即GIT2蛋白能降低由结肠炎引起的炎症因子的分泌。
[0027]实施例2、GIT2基因敲除小鼠脓毒症症状更为严重
[0028]1、用PBS缓冲液(pH7.4,0.01M)悬浮大肠杆菌，得到菌悬液。
[0029]2、将步骤I得到的菌悬液腹腔注射C57BL/6小鼠(WT)或GIT2基因敲除小鼠(K0)，每只小鼠的注射剂量为IO7CFU大肠杆菌。
[0030]以注射时刻计时，注射前作为第O小时。
[0031]每8个小时统计小鼠的存活率，结果见图5。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠患大肠杆菌导致的脓毒症的死亡率上升了，即GIT2蛋白能降低小鼠大肠杆菌导致脓毒症的死亡率。
[0032]第20小时，每组取5只存活的小鼠，检测小鼠血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和血尿素氮(BUN)的浓度,结果见图6。谷草转氨酶和谷丙转氨酶表征肝功能,血尿素氮表征肾功能。结果表明，敲除GIT2基因后小时的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和血尿素氮浓度均高于野生型小鼠，即敲除GIT2基因后小鼠的肝功能和肾功能的异常程度增加，GIT2蛋白能降低由脓毒症导致的肝功能异常和肾功能的异常。
[0033]第20小时，每组取5只存活的小鼠，取肺脏，切片后用甲醛固定，然后进行苏木精-伊红染色，照片见图7。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠肺脏的损伤程度增加了，SPGIT2蛋白能降低由脓毒症导致的肺脏的损伤。
[0034]第20小时，每组取5只存活的小鼠，取脾脏并称重，重量见图8。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠脾脏的重量增加了，即GIT2蛋白能抑制脓毒症引起的脾脏肿大。
[0035]第20小时，每组取5只存活的小鼠，利用小鼠TNF- a ELISA试剂盒和小鼠IL-6ELISA试剂盒按试剂盒说明书检测血清中的细胞因子TNF-α和细胞因子IL-6的浓度，结果见图9。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠的炎症因子水平升高，即GIT2蛋白能降低由脓毒症引起的炎症因子分泌。
[0036]实施例3、GIT2蛋白能够抑制骨髓来源的巨噬细胞分泌炎症因子
[0037]C57BL/6小鼠或GIT2基因敲除小鼠各3只，引颈处死；将小鼠后肢的皮毛剥置足部，连同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有无菌PBS缓冲液(pH7.2、0.01M)的培养皿中，镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在关节处剪断腿骨；用2mL注射器吸取无血清1640培养基，将针头刺入骨髓腔，反复冲洗骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液转移到50mL离心管中；取将IXlO7个骨髓细胞加入25cm2细胞培养瓶中，然后加入5mL含50ng/mL巨噬细胞集落刺激因子MCSF和10%血清的1640培养基中，置于37°C和5%C02的培养箱中培养3天；弃上清，加入5mL含50ng/mL巨噬细胞集落刺激因子MCSF和10%血清的1640培养基，培养4天；加入15mL PBS缓冲液(pH7.2,0.01M)，洗涤贴壁细胞，然后加入3mL胰酶消化细胞至细胞脱落；进行细胞计数，将IX IO5个骨髓细胞加入到24孔培养板中培养24小时，每孔加入10ng/ml脂多糖(LPS，脂多糖用于诱发炎症)，从加入脂多糖开始计时，间隔时间收取上清，利用小鼠TNF-a ELISA试剂盒和小鼠IL-6ELISA试剂盒按试剂盒说明书检测细胞因子TNF-α和细胞因子IL-6的浓度，结果见图10 (黑色填充色代表C57BL/6小鼠，白色填充色代表GIT2基因敲除小鼠)。结果表明，敲除GIT2基因后小鼠的炎症因子水平升高了，即GIT2蛋白能够抑制骨髓来源的巨噬细胞分泌炎症因子。
[0038]实施例4、重组质粒的构建
[0039]一、GIT2基因表达载体的构建
[0040]1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0041]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用MGIT2-1和MGIT2-2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0042]MGIT2-1:5，-gtacGTCGACCatgtcgaaacggctccg-3?；
[0043]MGIT2-2:5，-tcagGCGGCCGCtcagttgttgttctc-3’。
[0044]3、用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0045]4、用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切pCMV_Myc载体(购自Clontech公司)，回收约3800bp的载体骨架。
[0046]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pMyc_GIT2。根据测序结果，对重组质粒pMyc-GIT2进行结构描述如下:在pCMV_Myc载体的Sal I和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第166-2445位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0047]二、CYLD基因表达载体的构建
[0048]1、合成序列表的序列11所示的双链DNA分子。
[0049]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用MCYLD-1和MCYLD-2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0050]MCYLD-1:5，-gtacGTCGACCatgagttcaggcttatgg-3?；
[0051]MCYLD-2:5，_tcagGCGGCCGCttatttgtacaaactc_3，。 [0052]3、用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。[0053]4、 用限制性内切酶Sal I和Not I双酶切pCMV_Myc载体，回收约3800bp的载体骨架。
[0054]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pMyc-CYLD。根据测序结果，对重组质粒pMyc-CYLD进行结构描述如下:在pCMV_Myc载体的Sal I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列11自5’末端第416-3286位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0055]三、CYLD基因表达载体的构建
[0056]1、合成序列表的序列11所示的双链DNA分子。
[0057]2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用FCYLD-1和FCYLD-2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0058]FCYLD-1:5，-gtacGCGGCCGCGatgagttcaggcttatgg-3?；
[0059]FCYLD-2:5，_tcagGTCGACttatttgtacaaactc_3，。
[0060]3、用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0061]4、用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切pFLAG_CMV_2载体(购自SIGMA公司，C6114)，回收约4300bp的载体骨架。
[0062]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pFLAG-CYLD。根据测序结果，对重组质粒pFLAG-CYLD进行结构描述如下:在pFLAG_CMV_2载体的Not I和Sal I酶切位点之间插入了序列表的序列11自5’末端第416-3286位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0063]实施例5、GIT2蛋白与TRAF6蛋白存在相互作用
[0064]1、分组处理(转染均借助Liponfetamine2000并按其说明书进行操作)
[0065]第一组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克重组质粒pMyc_GIT2和1.5微克pFLAG-CMV载体转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0066]第二组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克pCMVMyc载体和1.5微克质粒Flag-taggedTRAF6转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0067]第三组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克重组质粒pMyc_GIT2和1.5微克质粒Flag-taggedTRAF6共转染5X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0068]2、完成步骤I后，收集细胞，用PBS缓冲液(pH7.2,0.01M)冲洗后转移到1.5ml的离心管中，每管加入500 μ I免疫共沉淀裂解液，超声破碎至溶液清亮，然后4°C、12600rpm离心10分钟，收集上清液(lysate),取40 μ I上清液进行Western Blot检测(一抗分别采用针对Flag的抗体或针对Myc的抗体)。
[0069]3、将步骤2剩余的上清液中上加入2 μ g针对Flag的抗体(购自Sigma公司),用旋转混合仪4°C混合2小时以上,然后加入40 μ I蛋白A/G琼脂糖(购自Santa Cruz公司)，旋转混合仪4°C混合过夜，然后4°C、3000rpm离心5分钟，收集沉淀。
[0070]4、重复进行三次如下步骤:在沉淀中加入1ml预冷的裂解缓冲液，在旋转混合仪4°C混合10分钟，收集沉淀(IP)。[0071]5、将步骤5得到的沉淀进行Western Blot检测。Western Blot检测结果见图11。结果表明，GIT2蛋白能够与TRAF6蛋白结合并相互作用。
[0072]实施例6、GIT2蛋白与CYLD蛋白存在相互作用
[0073]1、分组处理(转染均借助Liponfetamine2000并按其说明书进行操作)
[0074]第一组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克重组质粒pMyc_GIT2和4微克pFLAG_CMV_2载体共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0075]第二组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克pCMV_Myc载体和4微克重组质粒Flag-CYLD共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0076]第三组:25cm2/50ml培养瓶中将6微克重组质粒pMyc_GIT2和4微克重组质粒Flag-CYLD共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0077]2、同实施例5的步骤2。
[0078]3、同实施例5的步骤3。、 [0079]4、同实施例5的步骤4。
[0080]5、同实施例5的步骤5。Western Blot检测结果见图12。结果表明，GIT2蛋白能够与CYLD蛋白结合并相互作用。
[0081]实施例7、GIT2蛋白、TRAF6蛋白和CYLD蛋白的相互作用关系
[0082]1、分组处理(转染均借助Liponfetamine2000并按其说明书进行操作)
[0083]第一组:25cm2/50ml培养瓶中将1.5微克质粒Flag-tagged TRAF6和8微克pCMV-Myc载体转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0084]第二组:25cm2/50ml培养瓶中将1.5微克质粒Flag-tagged TRAF6、3微克重组质粒Myc-CYLD和5微克pCMV-Myc载体共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0085]第三组:25cm2/50ml培养瓶中将1.5微克质粒Flag-tagged TRAF6、3微克重组质粒Myc-CYLD和5微克重组质粒pMyc_GIT2共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0086]2、同实施例5的步骤2。
[0087]3、同实施例5的步骤3。、
[0088]4、同实施例5的步骤4。
[0089]5、同实施例5的步骤5。Western Blot检测结果见图13。结果表明，GIT2蛋白能够促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合。
[0090]实施例8、GIT2蛋白对TRAF6泛素化修饰的影响
[0091]1、分组处理(转染均借助Liponfetamine2000并按其说明书进行操作)
[0092]第一组:25cm2/50ml培养瓶中将I微克pFLAG_CMV_2载体、7微克pCMV-Myc载体和2微克质粒HA-Ubiquitin转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。[0093]第二组:25cm2/50ml培养瓶中将 I 微克质粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc载体和2微克质粒HA-Ubiquitin共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0094]第三组:25cm2/50ml培养瓶中将I微克质粒Flag-tagged TRAF6、3微克重组质粒pMyc-GIT2、2 微克质粒 HA-Ubiquitin 和 4 微克 pCMV-Myc 载体共转染 5 X IO6 个 HEK293 细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0095]第四组:25cm2/50ml培养瓶中将I微克质粒Flag-tagged TRAF6、2微克质粒HA-Ubiquitin和7微克重组质粒pMyc_GIT2共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0096]2、同实施例5的步骤2。一抗分别采用针对Flag的抗体、针对Myc的抗体或针对HA的抗体。
[0097]3、同实施例5的步骤3。、
[0098]4、同实施例5的步骤4。
[0099]5、同实施例5的步骤5。Western Blot检测结果见图14。结果表明，GIT2蛋白可以抑制TRAF6蛋白的泛素 化，促进TRAF6蛋白的去泛素化。
[0100]实施例9、GIT2蛋白对CYLD蛋白去泛素化修饰TRAF6的影响
[0101]1、分组处理(转染均借助Liponfetamine2000并按其说明书进行操作)
[0102]第一组:25cm2/50ml培养瓶中将 I 微克质粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc载体和2微克HA空载体转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0103]第二组:25cm2/50ml培养瓶中将 I 微克质粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc载体和2微克质粒HA-Ubiquitin共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0104]第三组:25cm2/50ml培养瓶中将I微克质粒Flag-tagged TRAF6、3微克重组质粒Myc-CYLD、2微克质粒HA-Ubiquitin和4微克pCMV-Myc载体共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0105]第四组:25cm2/50ml培养瓶中将I微克质粒Flag-tagged TRAF6、3微克重组质粒Myc-CYLD、2微克质粒HA-Ubiquitin和4微克重组质粒pMyc_GIT2共转染5 X IO6个HEK293细胞，采用DMEM培养基培养6小时，然后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基培养18小时，吸弃上清。
[0106]2、同实施例5的步骤2。一抗分别采用针对Flag的抗体、针对Myc的抗体或针对HA的抗体。
[0107]3、同实施例5的步骤3。、
[0108]4、同实施例5的步骤4。
[0109]5、同实施例5的步骤5。Western Blot检测结果见图15。结果表明，TRAF6蛋白可以被泛素化，CYLD蛋白抑制所述泛素化(即CYLD蛋白具有去泛素化作用)，GIT2蛋白能够促进CYLD蛋白的去泛素化作用。[0110]实施例10、GIT2对NF- κ B信号通路的调节
[0111]一、实验一
[0112]脂多糖可以激活质粒MyC-TLR4表达的TLR4蛋白，从而激活NF- κ B信号通路。
[0113]第一组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒和0.05微克质粒Myc-TLR4共转染2 X IO5个HEK293细胞，培养24小时，然后用裂解液(Promega公司)裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪(Promega公司)进行检测。
[0114]第二组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒、0.05微克质粒Myc-TLR4和1.00微克重组质粒pMyc_GIT2共转染2 X IO5个HEK293细胞，培养24小时，然后用裂解液裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪进行检测。
[0115]第三组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒和0.05微克Myc-TLR4质粒共转染2 X IO5个HEK293细胞，培养18小时，然后加入脂多糖并使其浓度为I μ g/ml，继续培养6小时，然后用裂解液裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪进行检测。
[0116]第四组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒、0.05微克Myc-TLR4质粒和0.25微克重组质粒pMyc_GIT2共转染2X IO5个HEK293细胞，培养18小时，然后加入脂多糖并使其浓度为I μ g/ml，继续培养6小时，然后用裂解液裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪进行检测。
[0117]第五组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒、0.05微克Myc-TLR4质粒和0.50微克重组质粒pMyc_GIT2共转染2 X IO5个HEK293细胞，培养18小时，然后加入脂多糖并使其浓度为I μ g/ml脂多糖，继续培养6小时，然后用裂解液裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪进行检测。
[0118]第六组:将0.05微克含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒、0.002微克TK海肾荧光素酶报告基因质粒、0.05微克Myc-TLR4质粒和1.00微克重组质粒pMyc_GIT2共转染2 X IO5个HEK293细胞，培养18小时，然后加入脂多糖并使其浓度为I μ g/ml脂多糖，继续培养6小时，然后用裂解液裂解细胞30分钟，用双报告基因检测仪进行检测。
[0119]相对荧光活性=含有NF-κ B的荧光素酶报告基因质粒表达的荧光素的荧光强度/TK海肾荧光素酶报告基因质粒表达的荧光素酶的荧光强度。
[0120]结果见图16。结果表明，GIT2蛋白可以抑制NF-KB信号通路的活化，这一过程有一定的剂量依赖。
[0121]二、实验二
[0122]细胞因子IL-1 β可以激活NF-κ B信号通路。
[0123]用细胞因子IL-1 β (10ng/ml)代替脂多糖，每组均不转染0.05微克1^(:-1'1^4质
粒，其它同实验一。
[0124] 结果见图16。结果表明，GIT2蛋白可以抑制NF-KB信号通路的活化，这一过程有一定的剂量依赖。
【权利要求】
1.GIT2蛋白在制备广品中的应用；所述广品的功能为如下(I)至(13)中的至少一种: (1)与TRAF6蛋白结合； (2)与TRAF6蛋白相互作用； (3)与CYLD蛋白结合； (4)与CYLD蛋白相互作用； (5 )促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合； (6)促进CYLD蛋白对泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用； (7)促进泛素化的TRAF6蛋白发生去泛素化； (8)抑制NF-K B信号通路的活化； (9)治疗和/或预防炎症； (10)治疗和/或预防炎症性肠炎； (11)治疗和/或预防脓毒症； (12)抑制巨噬细胞活化； (13)治疗和/或预防由巨噬细胞活化导致的炎症。
2.如权利要求1所示的方法，其特征在于:所述GIT2蛋白是如下(a)、(b)、(C)、(d)、(e)、(f)或(g): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Ce)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cf)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (g)将序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由其衍生的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i): (h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (i)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列8衍生的蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述CYLD蛋白是如下(j)或(k): (j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (k)将序列11的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列11衍生的蛋白质。
5.一种产品，其活性成分为GIT2蛋白；所述产品的功能为如下(I)至(13)中的至少一种: (1)与TRAF6蛋白结合； (2)与TRAF6蛋白相互作用； (3)与CYLD蛋白结合； (4)与CYLD蛋白相互作用；(5 )促进TRAF6蛋白与CYLD蛋白的结合； (6)促进CYLD蛋白对泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用； (7)促进泛素化的TRAF6蛋白发生去泛素化； (8)抑制NF-K B信号通路的活化； (9)治疗和/或预防炎症； (10)治疗和/或预防炎症性肠炎； (11)治疗和/或预防脓毒症； (12)抑制巨噬细胞活化； (13)治疗和/或预防由巨噬细胞活化导致的炎症。
6.如权利要求5所示的产品，其特征在于:所述GIT2蛋白是如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Ce)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cf)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (g)将序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由其衍生的蛋白质。
7.如权利要求5或6所述的产品，其特征在于:所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i): (h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (i)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列8衍生的蛋白质。
8.如权利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于:所述CYLD蛋白是如下(j)或(k): (j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (k)将序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物体炎症反应相关的由序列10衍生的蛋白质。
【文档编号】A61K38/17GK103961687SQ201310045961
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】贺福初, 王建, 魏俊成, 韦超 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所