介导应激反应的肽抑制剂的制作方法

专利名称：介导应激反应的肽抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及由单克隆抗DNA抗体识别的肽，所述肽能够抑制真核细胞中的细胞应激反应和免疫应激反应，从而可用于治疗人变性性疾病和炎症。
背景技术：
细朐凋亡细胞凋亡，或程序性细胞死亡，对于正常生物过程包括组织胚胎发生、组织稳态的维持、多细胞生物体的细胞发育、病毒感染细胞的消除及免疫系统的发育(Ellis等，1991)具有根本的重要性。这是与变性性死亡或坏死根本不同的细胞死亡类型，因为此细胞死亡类型是基因介导的细胞自毁的主动过程，在某些情况下，具有生物意义的稳态功能。

p53p53蛋白最初被鉴定为肿瘤相关抗原，是肿瘤抑制基因的广物，其可以抑制突变或异常细胞的生长(Baker等，1990)。认为功能性p53可以检测出DNA损伤(Lee等，1995)及随后诱导异常细胞的DNA修复(Kastan等，1991)、生长停滞(Kuerbitz等，1992)或细胞凋亡(Yonish-Rouach等，1991)。具体地,p53通过消除细胞群的遗传损伤细胞而调节基因组稳定性，且其主要功能之一为预防肿瘤形成。p53蛋白具有至少两个DNA结合位点:(1)ρ53蛋白的核心，其与p53反应基因的启动子区中的DNA序列特异性相互作用(el-Deiry 等，1992);及(2)p53蛋白的C末端，其通常可识别损伤DNA的常见特征(Lee等，1995 ;Foord等，1991)。p53蛋白是一种转录因子，其可特异性结合p53依赖性基因调节序列的共有位点(el-Deiry等，1992)。在与结合特定DNA调节位点有关的主要序列编码结构域中p53基因的突变导致肿瘤抑制减少。因此，不足为奇，大部分天然的人肿瘤带有突变的p53 (Hollstein等，1991)。p53具有短的半衰期，并因此，在细胞中持续合成和降解。然而，当细胞经受应激时，p53被稳定。诱导p53稳定的细胞应激的例子如下:a)DNA损伤，例如由UV(紫外线)辐射、细胞突变、化疗、及放疗引起的损伤；b)体温过高；c)缺氧；及d)某些化疗药物引起的微管脱调节，如使用紫杉醇或长春花碱类的治疗。应激活化的p53诱导级联事件，导致应激细胞的生长停滞或细胞凋亡，从而防止异常细胞的过度生长和肿瘤形成(Ko，1996)。然而，严重应激之后ρ53的过度活化对生物体有害，这是因为组织功能可被过度的细胞凋亡损害(Komarova，2001)。
具体地，放疗和化疗显示有严重的副作用，例如对淋巴和造血系统及肠上皮的严重损伤，限制了这些治疗的效果。其他副作用，如脱发，也是由P53介导并进一步减弱癌症治疗的效果。因此，为消除或减轻在正常组织中与癌症治疗相关的不良副作用，在P53缺陷的肿瘤的治疗过程中抑制正常组织中P53的活性并由此保护正常组织是有益的。已认为P53的失活是非期望和不需要的事件，且已付出可观的努力通过恢复p53功能而促进癌症治疗。然而，P53恢复或模拟会引起上述在化疗或放疗过程中损伤正常组织细胞有关的问题。在癌症治疗过程中，这些正常细胞经受应激，使细胞中的P53引起程序性死亡。癌症治疗然后杀死肿瘤细胞和正常细胞。美国专利N0.6，593，353揭露了 p53抑制剂用于p53介导的疾病、病症及损伤的治疗。美国专利N0.6，420，136揭露了通过添加一种增强或抑制p53的生物化学活性的蛋白质而调节细胞中P53蛋白的活性的方法。美国专利N0.6，630，584揭露了一种可识别暴露于突变体而非野生型p53上的抗原表位的单链抗体，和编码所述单链Fv的DNA分子，含有所述抗体的药物组合物，以及使用所述药物组合物的治疗方法。p53和应激相关的反应p53活性对生物体的不利作用不限制于癌症治疗。p53可被损伤(如烧伤)、自然发生的疾病(如发烧有关的体温过高，及受阻断的血液供应有关的局部缺氧，中风，及局部缺血)和细胞老化(如成纤维细胞老化)及癌症治疗相关的多种应激活化。因此，临时的P53抑制还可在例如下述情况中是治疗上有效的:(a)减轻或消除中枢神经系统中的p53依赖性神经元死亡，即脑和脊 髓损伤；(b)在移植前保护组织和器官；(c)骨髓移植宿主的准备 '及(d)减轻或消除如癫痫发作过程中的神经元损伤。另外，各种变性性疾病，包括阿耳茨海默氏病(Alzheimer' s disease)、帕金森氏病(Parkinson, s disease)、缺血性中风(ischemic stroke) (Mattson2001 ；Martin,2001)、青光眼(Nickells，1999)、创伤后的继发性变性(Raghupathi，2000)、心肌梗塞(Haunstetter, 1998),与应激反应中敏感组织的过度细胞死亡有关。因此，应激相关的细胞死亡的临时抑制可预防和治疗变性性疾病(Komarova，2001)。p53的DNA结会结构域的单克隆抗体DNA抗体为许多自身免疫性疾病，特别是系统性红斑狼疮(SLE)且尤其是狼疮性肾炎所特有。然而，对于自身免疫性疾病中抗DNA抗体的流行，目前还没有普遍接受的解释。对于DNA的免疫看上去是由一种抗原(Radic等，1994)驱动，但因为哺乳动物的DNA通常不会诱导抗DNA免疫反应,所以自身DNA不太可能是驱动的抗原(Pisetsky, 1996)。据报导，使用单克隆抗体的免疫，可能通过基于免疫单克隆抗体的可变区中独特型决定簇的抗独特型连接性，可诱导延伸超越抗体的特异性的免疫反应。根据独特型抗体网络术语，Abl是第一抗体，该抗体结合抗原，Ab2是Abl的抗独特型抗体。因为抗原和Ab2均可与Abl结合，Ab2的可变区可模拟抗原的构象。Ab3是Ab2的抗独特型抗体。由于结构互补性链，Abl和Ab3可具有对于原始抗原的相似特异性。PAb-421抗体是与p53的C末端DNA结合结构域反应的原型单克隆抗体。抗p53PAb-421抗体的重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)已有资料描述(见W098/56416)。由于PAb-421抗体在体外可活化p53的DNA结合，建议其用于癌症治疗(见W094/12202)。发明人先前曾报道，使用PAb-421免疫小鼠可诱导也结合DNA的抗独特型抗体的形成(Herkel等，2000 ;和W000/23082)。这些单克隆抗独特型抗体中的两种，Id1-1和Id1-2，模拟p53调节结构域的结合特性并与PAb-421和双链和单链DNA特异性反应。本发明的发明人认为(在本发明优先权日之后)损伤DNA具有由p53和Id1-1和Id1-2抗体识别的化学上定义的结构(Herkel等，2004)。现有技术中尚未有教导或表明可能使用这些抗独特型抗体鉴定具有抗细胞凋亡和抗炎症特性的新型肽。尚需要新型组合物，所述新型组合物应可特异、安全及有效减轻正常组织中的细胞应激反应和免疫应激反应，从而减轻应激相关的变性性疾病和应激诱导的炎症的严重性。

发明内容
本发明提供了组合物和方法，其包括用于抑制对于多种应激相关疾患的细胞应激反应和免疫应激反应的肽。本发明的肽显示有抗细胞凋亡和抗炎症活性，由此增加暴露于应激的细胞或组织的细胞存活率。尽管p53的抗体用于诱导抗肿瘤免疫的用途已有描述，本发明证明了与抗p53抗体发生免疫反应的抗独特型抗体也可用于定义用于预防或减少细胞死亡的治疗。意想不到地，本发明揭露了由抗p53单克隆抗体的独特型免疫产生的单克隆抗体所识别的肽对于治疗人变性性疾病及改变炎症反应具有潜在用途。换言之，抗P53抗体(Abs)可产生抗独特型抗体，其中这些后提到的抗体可识别预防细胞死亡或炎症有用的抗原表位。本发明部分基于证明本发明的肽在缓解应激诱导的细胞死亡和p53介导的反应中的功效的实验，其 中所述细胞死亡和P53介导的反应由例如DNA损伤剂、体温过高、中毒性应激及Y辐射等刺激诱导。令人吃惊的是，本发明还发现本发明的肽无论在体外还是在体内都显示有抗炎症活性。因此，本发明证明了本发明的肽对于治疗炎症和自身免疫性疾病是有用的。根据第一方面，本发明涉及含有可与针对抗p53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的表位的肽，其中所述抗p53抗体可与p53C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应。本发明的肽显示有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在某些具体实施方案中，所述抗p53抗体可以是PAb-421。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可选自Id1-1和Id1-2。在一个具体实施方案中，所述肽可与针对抗p53抗体PAb-421的抗独特型抗体发生免疫反应(Herkel等，2000，由此通过参考完整并入本文)。在其他具体实施方案中，所述肽具有P53调节结构域的结构模拟特性，可与单克隆抗体Id1-1和Id1-2发生免疫反应(Herkel等，2004，由此通过参考完整并入本文)。在一个实施方案中，所述抗独特型抗体是一种含有选自SEQ ID NO:15和18及SEQID N0:21和24的Vf⑶1 3和￥11-⑶R3序列的分子。在另一个实施方案中，抗独特型抗体是一种含有选自SEQ ID NO:9和10,SEQ IDNO:11和12及其类似物和衍生物的Vl和Vh区的分子。
所述肽可通过本领域已知方法表征和合成。在一个实施方案中，所述肽通过质谱分析法表征及通过化学合成方法合成。根据另一个实施方案，所述肽与p53的DNA结合结构域具有结构互补性。不希望受限于任何具体理论或作用机理，假定所述肽能够结合P53，由此而防止p53结合损伤DNA。在另一个实施方案中，本发明的肽显示有结合与细胞凋亡有关的蛋白质的活性。在另一个实施方案中，本发明的肽显示有防止所述蛋白质结合损伤DNA的活性。根据某些实施方案，所述肽含有总共约5至25个氨基酸，优选地，所述肽含有约5至25个氨基酸，优选约7至12个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述肽表现有结合与细胞凋亡有关的蛋白质的活性。在某些具体实施方案中，所述肽表现有防止所述蛋白质结合损伤的DNA的活性。在某些具体实施方案中，本发明提供了具有抗细胞凋亡活性和/或抗炎症活性的新型肽，所述新型肽具有选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4、其类似物、衍生物或活性片段的氨基酸序列。本发明的肽如下:SEQ ID NO:1_LPPLPYP，被命名为应激素-1 ；SEQ ID NO:2_DLSTDALHYRTA，被命名为应激素-2 ；SEQ ID NO:3_HPTNQQSLWRWP，被命名为应激素-3 ；SEQ ID NO:4_SSLSVDYPTRYP，被命名为应激素 _4。在其他具体实施方案中，所述衍生物是反向肽，其具有SEQ ID N0:5_8中任一所述的氨基酸序列: SEQ ID NO:5-PYPLPPL( “D”同分异构形式的所有残基)；SEQ ID NO:6_ATRYHLADTSLD ( “D” 同分异构形式的所有残基)；SEQ ID NO:7-PWRWLSQQNTPH( “D” 同分异构形式的所有残基)；SEQ ID NO:8_PYRTPYDVSLSS ( “D” 同分异构形式的所有残基)。在一个具体实施方案中，所述肽具有SEQ ID NO:1、2及5中任一所述的氨基酸序列。根据其他实施方案，本发明的肽对于选择性预防正常组织的细胞死亡有用。在一个实施方案中，所述肽抑制哺乳动物细胞的细胞凋亡活性。在另一个实施方案中，所述肽抑制人细胞的细胞凋亡活性。在一个实施方案中，所述肽能够下调免疫介导的应激反应。根据某些优选实施方案，本发明的肽能够抑制细胞凋亡活性至少25%，优选至少50 %，更优选至少75 %，最优选至少95 %。本发明提供的肽具有有效抑制正常组织中细胞应激反应和免疫应激反应的能力，并对于治疗细胞内蛋白质活性的抑制能提供益处的疾病或病症有用。根据某些实施方案，本发明的肽对于治疗应激相关的人变性性疾病有用。根据其他实施方案，所述肽能够下调免疫介导的应激反应。在其他方面，本发明涉及一种含有选自SEQ ID NO:15和18及SEQ ID N0:21和24的'401 3和￥11-001 3序列的抗体分子，及其用于分离本发明的肽的用途。在一个实施方案中，所述抗体分子含有选自SEQ ID NO:9和10及SEQ ID NO: 11和12的\区和Vh区。根据另一方面，本发明提供了含有作为活性成分的本发明的肽或其盐类及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。根据另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的一种肽及药学上可接受的载体或稀释剂，所述肽含有可与针对抗P53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应，其中所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约5至25个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约7至12个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述抗p53抗体可以是PAb-421。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可选自Id1-1和Id1-2。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO: 1-4、其类似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述衍生物可具有SEQ ID NO:5_8任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO:1、2及5任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ ID N0:15和18及SEQ ID NO:21和24组成的组的Vl_CDR3和VH_CDR3序列的分子。在某些具体实 施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ IDNO:9和10、SEQ ID NO:11和12及其类似物组成的组的\区和Vh区的分子。在某些具体实施方案中，所述活性成分可以是根据本发明的任何一种肽及其药学上可接受的盐。根据另一方面，本发明提供了一种抗体分子，其含有选自SEQ ID NO: 15和18及SEQ ID NO:21 和 24 的 VL_CDR3 和 VH_CDR3 序列。根据另一方面，本发明提供了一种抗体分子，其含有选自SEQ ID NO:9和10、SEQID NO: 11和12及其类似物的Vl区和Vh区。根据另一方面，本发明提供了一种调节生物体细胞中细胞应激相关的反应及免疫应激相关的反应的方法，其包括将细胞暴露于有效量的本发明的肽、其类似物、衍生物或盐类。根据另一方面，本发明提供了一种用于调节生物体细胞的细胞应激相关反应和免疫应激相关反应的方法，其包括将所述细胞暴露于有效量的一种肽，所述肽含有可与针对抗P53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应，并且其中所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约5至25个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约7至12个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述抗p53抗体可以是PAb-421。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可选自Id1-1和Id1-2。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO: 1_4、其类似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。
在某些具体实施方案中，所述衍生物可具有SEQ ID NO:5_8任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO:1、2及5任一者所列的氨基酸序列。本发明的肽可治疗的疾病和炎症病症包括，但不限制于，阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、创伤后的继发性变性、中风、中枢神经系统中毒、青光眼、黄斑变性、I型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、自身免疫性眼葡萄膜炎、移植物抗宿主病、移植物排斥、关节炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、炎性肠病(IBD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、银屑病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、福射病、体温过高、缺氧、暴发性中毒肝(fulminant toxic liver)、肾衰竭、不育症及多种其他疾病。在某些具体实施方案中，所述肽可在体内调节细胞的细胞内蛋白质活性。在某些具体实施方案中，所述肽可离体调节细胞的细胞内蛋白质活性。 在某些具体实施方案中，可通过选自口服、局部、经皮肤及胃肠外的途径将所述肽施用于需要的受治疗者。在某些具体实施方案中，所述肽可响应正常组织或细胞的细胞应激疾患和免疫应激疾患而抑制细胞凋亡活性。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ ID N0:15和18及SEQ ID NO:21和24组成的组的Vl_CDR3和VH_CDR3序列的分子。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ IDNO:9和10、SEQ ID NO:11和12及其类似物组成的组的\区和Vh区的分子。在另一方面 ，本发明提供了一种用于治疗需要的受治疗者的变性性疾病或病症的方法，其包括施用于所述受治疗者治疗有效量的本发明的肽、其类似物、衍生物或盐类。根据另一方面，本发明提供了一种用于治疗受治疗者变性性疾病或病症的方法，其包括将治疗有效量的一种肽施用于所述受治疗者，所述肽含有可与针对抗P53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应，并且其中所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约5至25个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约7至12个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述抗p53抗体可以是PAb-421。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可选自Id1-1和Id1-2。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO: 1-4、其类似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述衍生物可具有SEQ ID NO:5-8任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO:1、2及5任一者所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述疾病或病症是应激相关的变性性疾病。在另一个实施方案中，所述受治疗者患有肿瘤性疾病并经历用于治疗癌症的化疗和/或放疗。在另一个实施方案中，所述疾病或病症选自:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、创伤后的继发性变性、中风、中枢神经系统中毒、青光眼、黄斑变性、心肌梗塞、辐射病、体温过高、缺氧、暴发性中毒肝、肾衰竭及不育症。在某些具体实施方案中，所述肽可在体内调节细胞内的细胞内蛋白质活性。在某些具体实施方案中，所述肽可离体调节细胞内的细胞内蛋白质活性。在某些具体实施方案中，可通过选自口服、局部、经皮肤及胃肠外的途径将所述肽施用于需要的受治疗者。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ ID N0:15和18及SEQ ID NO:21和24组成的组的Vl_CDR3和VH_CDR3序列的分子。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ ID N0:9和
10、SEQ ID NO:11和12及其类似物组成的组的\区和Vh区的分子。在另一方面，本发明提供一种用于治疗需要的受治疗者的炎症性疾病或病症的方法，其包括施用于所述受治疗者治疗有效量的本发明的肽、其类似物、衍生物或盐类。根据另一方面，本发明提供了一种用于治疗受治疗者炎性疾病或病症的方法，其包括将治疗有效量的一种肽施用于所述受治疗者，所述肽含有可与针对抗P53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应，并且其中所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在某些具体 实施方案中，所述肽可含有约5至25个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述肽可含有约7至12个氨基酸。在某些具体实施方案中，所述抗p53抗体可以是PAb-421。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可选自Id1-1和Id1-2。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO: 1-4、其类似物、衍生物及活性片段任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述衍生物可具有SEQ ID NO:5-8任一者所列的氨基酸序列。在某些具体实施方案中，所述肽可具有SEQ ID NO:1、2及5任一者所列的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述疾病或病症具有与选自IL-6和TNF-α的至少一种炎症前细胞因子的产生有关的病因。在另一个实施方案中，所述疾病是自身免疫性疾病。在其他实施方案中，所述疾病或病症选自:1型糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼葡萄膜炎、关节炎、全身炎症反应综合征(SIRS)、炎性肠病(IBD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、银屑病、动脉粥样硬化、移植物排斥以及移植物抗宿主病。在一个具体实施方案中，所述疾病是多发性硬化症。在某些具体实施方案中，所述肽可在体内调节细胞内的细胞内蛋白质活性。在某些具体实施方案中，所述肽可离体调节细胞内的细胞内蛋白质活性。
在某些具体实施方案中，可通过选自口服、局部、经皮肤及胃肠外的途径将所述肽施用于需要的受治疗者。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ ID N0:15和18及SEQ ID NO:21和24组成的组的Vl_CDR3和VH_CDR3序列的分子。在某些具体实施方案中，所述抗独特型抗体可以是含有选自由SEQ IDNO:9和10、SEQ ID NO:11和12及其类似物组成的组的\区和Vh区的分子。在另一方面，本发明涉及一种抗体分子用于分离一种肽的用途，所述抗体分子含有选自由SEQ ID NO:15和18及SEQ ID NO:21和24组成的组的Vl_CDR3和VH_CDR3序列，所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在另一方面，本发明涉及一种抗体分子用于分离一种肽的用途，所述抗体分子含有选自由SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12及其类似物组成的组的\区和Vh区，所述肽表现有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性。在一个实施方案中，响应正常组织或细胞中的细胞应激疾患和免疫应激疾患，所述肽抑制细胞凋亡活性。根据一个实施方案，本发明的肽在体内调节细胞内的细胞内蛋白活性。在另一个实施方案中，本发明的肽离体(ex vivo)调节细胞内的细胞内蛋白活性。根据某些实施方案，可通过任何合适给药途径将所述肽施用于需要的受治疗者，所述合适给药途径包括，但不限制于口服、局部、经皮肤、胃肠外。结合下述附图、说明书及权利要求书，本发明的这些和其他实施方案将变得明显。


图1:使用DNA损伤剂顺钼处理的L12细胞的DNA含量，用以检测p53介导的细胞死亡。图2A和2B:顺钼(80 μ Μ)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞中ρ53介导的细胞死亡。图3:当BALB/c小鼠经受6.5Gy剂量的身体辐射时，应激素肽对BALB/c小鼠的作用。图4:应激素-1抑制在对脂多糖(LPS)或CpG-寡核苷酸的反应中的RAW264.7巨噬细胞的TNF-α分泌。图5:应激素-1抑制在对脂多糖(LPS)或CpG-寡核苷酸的反应中的RAW264.7巨噬细胞的白介素-6分泌。图6:应激素-1在小鼠实验性自身免疫性疾病(EAE)的发展中的抑制作用。图7:PAb-421、Id1-l及Idi_2可变区的氨基酸序列。对轻链或重链的互补决定区(OTR)进行比对。发明详述本发明提供了组合物和方法，其包括用于抑制对于多种应激相关疾患的细胞应激反应和免疫应激反应的肽。本发明提供了利用单克隆抗DNA抗体识别的肽治疗人变性性疾病和炎症的组合物和方法，所述肽具有抗细胞凋亡和抗炎症活性。定义如本发明所使用，术语 “线性肽”是指一种肽或多肽，其中的氨基酸通过在一个氨基酸的α氨基和另一个氨基酸的α羧基之间形成的酰胺键互相连接。如本发明所使用，“细胞”是指真核细胞。典型地，所述细胞为动物来源，且可为干细胞或体细胞。合适的动物细胞可来源于，例如，哺乳动物和鸟类。哺乳动物细胞的例子包括人细胞、牛细胞、羊细胞、猪细胞、小鼠细胞、家兔细胞。所述细胞可为胚胎细胞、骨髓干细胞或其他祖细胞。当所述细胞为体细胞时，其可为，例如，上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、血细胞(包括造血细胞、红细胞、T细胞、B细胞，等)、心肌细胞、巨噬细胞、树突状细胞、神经细胞(如神经胶质细胞或星形胶质细胞)。在本发明上下文中，“调节”是指抑制，即减少表达。这种调节可使用本领域常规方法进行检测，如通过蛋白质表达的蛋白质印迹(Western blot)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，或通过蛋白质表达的免疫沉淀测定来进行检测。本发明使用的术语“治疗”包括预防疾病和治疗用途，是指缓解患者特定疾病的症状，改进特定疾病相关的可确定的检测结果，或预防特定免疫反应(例如移植排斥)。抗体，或免疫球蛋白，包括由二硫键连接在一起的两条重链及两条轻链，在“Y”形构象中，每条轻链通过二硫键与各重链连接。抗体的蛋白水解消化产生Fv (片段可变)及Fe(片段晶体)结构域。抗原结合结构域，Fab'，包括多肽序列变化的区域。术语“F(ab' )2”表示由二硫键连接在一起的两条Fab'臂。抗体的中心轴被称为Fe片段。每一条重链一端具有可变结构域(VH)，其后是多个恒定结构域(CH)。每条轻链一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域(CL)，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐，轻链恒定结构域与重链的第一恒定结构域(CHl)对齐。每对轻链和重链的可变结构域形成抗原结合位点。轻链和重链上的结构域具有相同的一般结构，每一结构域包括四个框架区，其序列相对保守，并由三个称为互补决定区(⑶R1-3)的高变结构域连接。这些结构域促成了抗原结合位点的特异性和亲和力。本发明使用的术语 “抗体”是指实质上由一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因编码的多肽配体，或其片段，所述多肽配体或其片段可特异性结合和识别抗原表位(如抗原)。如本发明所使用，此术语是指能够结合抗原表位决定簇的完整分子，如多克隆抗体或单克隆抗体(HiAb)，重组和工程抗体，以及其片段，例如Fab，F(ab' )2, Fab微型抗体(见，例如，美国专利5,910, 573，美国专利6294353，W096/37621，美国专利申请08/999，554)，Fv, scFv (如美国专利 N0.4，946，778,5, 091，513 和 5，096，815)，等等。本发明使用的抗体可使用完整多肽或含有目的小肽的片段作为免疫抗原而进行制备。用于免疫动物的多肽或寡肽可从RNA翻译获得或化学合成，并且如果需要，可与载体蛋白轭合。与肽化学偶合的常用载体例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白及钥孔虫戚血兰素。被偶合的肽然后用于免疫动物(如小鼠、大鼠或家兔)。产生抗体的非限制性方法于下文的实施例中描述；然而，本领域熟知的其他方法可被容易使用。术语“抗独特型抗体”意指针对(换言之，是指“与......发生免疫反应”)另一
种抗体的独特型决定簇的抗体。如本发明所使用，术语“独特型决定簇”是指单克隆的细胞的免疫球蛋白产物特异的抗原决定簇或抗原表位。独特型可见于抗体的可变区。术语“抗原表位”是指抗体识别的分子上的抗原决定簇。如本发明所使用，术语“可与.....发生免疫反应”是指抗体能够以提示与抗原发生免疫反应的结合亲和力结合抗原。所述亲和力为本领域技术人员熟知，包括IO5至IO14 M-1的亲和力。确定抗体组合物的亲和力的方法描述于Day, Advanced Immunochemistry,(第二版)Wiley-Liss, New York, N.Y.(1990)。应激素肽根据第一方面，本发明涉及含有可与针对抗p53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位的肽，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应。本发明的肽显示有选自抗细胞凋亡活性和抗炎症活性的至少一种活性，下文将详细描述。在一个实施方案中，通过具有p53调节结构域的结构模拟特性的抗独特型单克隆抗体筛选所述肽。根据某些实施方案，所述肽可与针对抗P53抗体的单克隆抗体发生免疫反应。在一个具体实施方案中，所述抗p53抗体是PAb-421 (Herkel等，2000)。在其他具体实施方案中，所述肽具有P53调节结构域的结构模拟特性，可与单克隆抗体Id1-1和Id1-2发生免疫反应(Herkel等，2004)。在其他实施方案中，所述肽可与含有选自SEQ ID NO: 15和18及SEQ ID N0:21和24的'-001 3和VH-CDR3序列的抗独特型抗体分子发生免疫反应。在另一个实施方案中，所述抗独特型抗体是含有选自SEQ ID NO:13-18和10及SEQ ID NO: 19-24的CDR序列的分子。在另一个实施方案中，所述抗独特型抗体是含有选自SEQ ID N0:9和10、SEQ ID NO:11和12及其类似物的\和Vh区的分子。所述肽可通过本领域已知方法表征和合成。在一个实施方案中，所述肽通过质谱分析法表征及通过化学合成方法合成，如下文所述。本发明的肽优选具有5至25个氨基酸,更优选5至15个氨基酸,最优选7至12
个氨基酸。根据某些具体实施方案，本发明提供四种所选肽，为应激素-1至4 (应激反应特异性肽抑制剂)。本发明某些肽的氨基酸序列列于表1，为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4。除非另有说明，本发明所述氨基酸残基优选为“L”同分异构形式。然而，“D”同分异构形式的残基可被任何L氨基酸残基取代，只要所述肽保留所需功能特性。在其他具体实施方案中，本发明提供了 SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的肽的类似物、片段及功能衍生物，下文将详细描述。根据某些具体实施方案，所述衍生物为具有SEQID NO:5-8任一所述的氨基酸序列的反向肽。在一个具体实施方案中，所述肽具有SEQ IDNO:1、2及5任一所述的氨基酸序列。先前，证明了单克隆抗体Id1-1和Id1-2可特异性结合PAb-421和单链或双链DNA (本发明某些发明人的Herkel等，2000)。本发明提供了针对含有选自SEQ ID NO:9和10及SEQ ID NO:11和12的可变区的PAb-421的抗体分子，及含有选自SEQ ID NO:13-18和SEQ ID NO:19-24的氨基酸序列的⑶R的抗体分子。这些抗体排除已知的名称为Id1-1和Id1-2的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体分子含有选自SEQ ID NO: 15和18的Vf⑶R3和Vh-⑶R3序列(分别对应于Id1-1的轻链互补决定区3和Id1-1的重链互补决定区3)及SEQ ID NO:21和24 (Id1-2)的Vl_CDR3和VH_CDR3序列。在另一个实施方案中，所述抗体分子含有下文表4所述的CDR序列，其具有选自SEQ ID NO: 13-18 (Id1-1)和SEQ ID NO:19-24(Id1-2)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体分子含有选自SEQ ID NO:9和IO(Id1-1)及SEQ ID NO: 11和12 (Id1-2)的Vl和Vh区(免疫球蛋白轻链和重链的可变区)。本发明的抗体分子还包括含有所述\区和Vh区的类似物和衍生物的分子，只要所述类似物或衍生物可与PAb-421的抗原结合部分发生免疫反应。在另一方面，本发明提供了如上所述的抗体分子用于分离显示有选自抗细胞凋亡和抗炎症活性中至少一种活性的肽的用途。利用这些抗体鉴定和分离本发明的肽的合适方法于下文描述。噬菌体展示f库噬菌体展示肽文库为鉴定所述肽激动剂和拮抗剂的强有力方法。见，例如Scott等，(1990) ；Devlin 等，(1990);美国专利 N0.5，223，409 ;美国专利 N0.5，733，731 ；美国专利N0.5，498，530 ;美国专利N0.5，432，018 ;美国专利N0.5，338，665 ;美国专利N0.5，922，545 ；W096/40987 ;及W098/15833。在这些文库中，通过与丝状噬菌体的衣壳蛋白融合展示了随机肽序列。典型地，所展示的肽可针对受体的抗体固定的细胞外结构域而被亲和洗脱。所保留的噬菌 体可通过亲和纯化和再生的连续循环而富集。最佳的结合肽可被测序用于鉴定肽的一个或多个结构相关家族内的关键残基。见，例如Cwirla等，(1997)，其中鉴定了两个不同的家族。所述肽序列还表明哪些残基可通过丙氨酸扫描或通过DNA水平的诱变而被安全取代。可创建和筛选突变文库以进一步优化最佳连接子的序列(Lowman,1997)。使用p53调节结构域的代用抗体从曬菌体展示文库(来自New England Biolabs,Frankfurt,Germany的Ph.D.-7或Ph.D.-12)筛选和分离本发明的肽。所述p53代用抗体通过对结合P53调节结构域的PAb-421单克隆抗体(Herkel等，2000)进行独特型免疫而产生；两种单克隆抗体Id1-1和Id1-2,模拟p53调节结构域的结合特性。对于所选的候选肽通过检测其抑制L12细胞系(Wolf，1984)对体温过高的响应而检测其干扰P53介导的细胞应激反应的能力，所述L12细胞系缺乏内源性p53活性且被p53基因或对照载体稳定转染。在这些细胞中，在对于体温过高的响应中，P53活性诱导生长停滞和细胞存活而非细胞凋亡(Nitta，1997)。鉴定了四种肽，应激素-1至应激素-4 (应激反应特异性肽抑制剂)，在体温过高之后以100μ g/ml的浓度抑制了 p53介导的生长停滞并诱导几乎所有具有活性p53的细胞死亡，此为缺乏P53活性的L12细胞的反应(表I);所述肽序列示于表2。鉴定和分离肽的可选方法蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析也可用于提出模拟大蛋白配体的结合活性的肽。在这样的分析中，晶体结构可提示大蛋白配体的关键残基的同一性和相对方位，由此而设计肽(见，例如Takasaki等，1997)。这些分析方法也可用于研究受体蛋白和噬菌体展示所筛选的肽之间的相互作用，此可提出进一步修饰所述肽以增加结合亲和力。在肽研究中，其他方法与噬菌体展示竞争。肽文库可与乳糖抑制子的羧基端融合，并在大肠杆菌中表达。另一种基于大肠杆菌的方法允许通过与肽聚糖相关的脂蛋白(PAL)融合而展示于细胞外膜上。在下文中，这些及相关方法被统称为“大肠杆菌展示”。在另一种方法中，随机RNA的翻译在核糖体释放之前终止，导致多肽文库与其相关的RNA仍然连接。在下文中，此方法和相关方法被统称为“核糖体展示”。其他方法使用了肽与RNA的化学键，见，例如，Roberts和Szostak (1997)。在下文中，此方法和相关方法被统称为“RNA-肽筛选”。已开发了化学衍生的肽文库，其中所述肽固定于稳定、非生物材料上，例如聚乙烯柱或溶剂可渗透的树脂。另一种化学衍生的肽文库使用照相平板印刷术扫描固定于载玻片上的肽。在下文中，这些方法和相关方法被统称为“化学-肽扫描”。化学-肽扫描是有利的，这是因为其允许使用D氨基酸和其他非天然类似物及非肽组分。生物方法和化学方法在Wells和Lowman (1992)中均有描述。噬菌体展示在产生用于本发明的肽中特别有用。已有说明，从随机肽文库的亲和筛选可用于鉴定任何基因产物的任何位点的肽配体(Dedman等，1993)。噬菌体展示尤其非常适于鉴定可结合作为细胞表面受体的所述目的蛋白质或具有线性抗原表位的任何蛋白质的肽(Wilson 等，1998 ；Kay 等，1998)。本发明的肽的合成本发明的肽可通过产生氨基酸序列的任何已知的化学和重组方法产生，包括肽模拟方法(Allen G.，1989 ；Young, 1963 ；Meienhofer, 1973 ；Schroder 和 Lupke, 1965)。化学合成通常通过在液相中以正确顺序使氨基酸残基或肽片段相互偶合而产生所需肽而进行。另一种常用策略是从固相(树脂)开始使氨基酸相互偶合，序列的最后一个氨基酸C-末端与固相偶合，由此，次末端氨基酸的C-末端与最后一个氨基酸的N-末端偶合，等等，最终从所述固相释放结合在一起的肽(被称为固相技术)。术语“肽”是指具有2至25个氨基酸的分子，优选具有5至20个氨基酸的分子，最优选具有7至12个氨基酸的分子。典型的肽可通过上述的任何方法随机产生，被肽文库(如噬菌体展示文库)携带，或通过蛋白的消化获得。本发明包括含有本发明的肽的任何类似物、衍生物及轭合物，其氨基酸序列示于本发明，只要所述肽能抑制细胞凋亡和/或炎症。因此，本发明包括含有非天然氨基酸衍生物或非蛋白侧链的肽。术语“类似物 ”包括具有与特别示于本发明的序列中的一种基本相同的氨基酸序列的任何肽或多肽，其中一个或多个残基被功能上相似的残基保守地取代，且所述序列展示了如本发明所述的能力。保守性取代的例子包括一个非极性(疏水)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个非极性(疏水)残基，一个极性(亲水)残基取代另一个极性(亲水)残基，例如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天门冬酰胺之间，甘氨酸和丝氨酸之间，一个碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一个碱性残基，或一个酸性残基如天门冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基。肽衍生物是指含有本发明主题肽的各种变化的氨基酸序列的分子，所述变化包括，但不限于，化学修饰、取代、插入、延伸及缺失，其中这些变化不会破坏所述肽的抗炎症或抗细胞凋亡活性，并且这样的衍生物不是已知的肽或蛋白质。“肽衍生物”意在包括肽模拟物，如下文所述。在这方面，本发明的肽对应于表I中所列的一种肽，且优选与表I中所列的一种肽相同，其中进行了一种或多种变化，只要在一种或多种如本发明定义的测定方法中，所述多肽能够保留本发明的肽的抑制功能。至于本发明的抗体分子，可变区衍生物保留特异性结合(即可与.....发生免疫反应)PAb-421的独特型决定簇的能力。具有化学修饰的肽衍生物包括，例如，具有通过侧链或功能基团的反应化学衍生的一个或多个残基的肽。这些衍生的分子包括，例如，其中自由氨基被衍生形成氢氯化胺、对甲苯磺酰基、苄酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。自由羧基可被衍生形成盐类、甲基酯或乙基酯或其他类型酯类或酰肼。自由羟基可被衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可被衍生形成N-亚氨基苯甲基组氨酸。还包括作为化学衍生物的那些含有20种标准氨基酸残基的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可取代脯氨酸；5_羟赖氨酸可取代赖氨酸；3_甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；鸟氨酸可取代赖氨酸。另外，通过化学修饰，肽衍生物可不同于本发明的肽的天然序列，所述化学修饰包括，但不限于，末端NH2酰化，乙酰化或巯乙酸酰胺化，及如使用铵、甲胺的末端羧基酰胺化，等。本发明的肽还包括具有与本发明的肽序列相关的残基的一种或多种添加和/缺失的任何肽，其序列示于本发明，只要对细胞凋亡和/或炎症的必需抑制活性被保留。术语“活性片段”因此是指本发明全长的应激素肽的肽部分，其具有相应的全长肽特征性活性的至少一种。检测细胞凋亡和炎症的抑制的合适方法的非限制性例子示于本发明。氨基酸残基的添加可在本发明的肽的任何末端进行，以提供一种“连接子”，通过该“连接子”，本发明的肽可方便与载体结合。所述连接子通常具有一个氨基酸残基，并可为40个或更多残基，更常见为I至10个残基。用于连接的典型氨基酸残基为酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸及天门冬氨酸等。本发明的肽也可自身共轭或聚集，以产生含有所述肽的巨大复合体。所述巨大复合体是有利的，这是因为其具有新的生物特性，如较长的循环半衰期或更大的活性。
_7] 肽模拟物肽模拟物为可通过模拟肽和蛋白质的某些结构方面而结合蛋白质的小分子。它们作为细胞的受体和其他受体的蛋白质和肽配体的激动剂和拮抗剂及作为酶的底物和底物类似物广泛用于科学和医学。肽模拟物设计中的基本目标是减小模拟物对于肽酶导致的裂解和失活的敏感性。在一种方法中，以基本同型空间配位的方式由多种化学功能基团取代一个或多个酰胺键，所述多种化学功能基团包括，但不限于脲键、氨基甲酸酯键、磺胺键、联氨键或任何其他共价键。在另一种方法中，多种非编码或修饰的氨基酸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸用于修饰哺乳动物肽。通过使BALB/c小鼠经受全身Y辐射(6.5Gy)，来检测应激素肽是否可以保护生物体免于过度的P53活化和组织衰竭而导致的死亡。反向肽用于测定延长的体内半衰期是否会有利(见实施例6);反向肽对蛋白酶具有抵抗力，且由反序D氨基酸组成，导致肽骨架改变，但侧链方向不变(Van Regenmortel, 1998)。如本发明所使用，例如，术语应激素-1肽的“反向肽”，如在本发明中变化使用，意在包括其中氨基酸序列与应激素-1的序列相比为反向且由反序D氨基酸组成的肽。本发明因此提供具有SEQ ID NO:5_8中任一所述的氨基酸序列的反向应激素肽。骨架可包括多种原子类型，包括碳、氮、氧、硫及磷，大多数骨架原子通常由碳组成。包括末端胍基或脒基的多个侧链部分与骨架连接。尽管邻近的侧链部分之间的间距通常恒定，本发明所使用的增强递送的运输体也可包括沿骨架的侧链部分之间的可变间距。细朐死亡和d53抑制细胞凋亡，或“程序性细胞死亡”，是一种借此细胞执行“细胞自杀”程序的过程。目前，认为细胞凋亡程序在几乎所有多细胞生物体中及在特定生物体的几乎所有细胞中为进化性保守。另外，认为在许多情况下，细胞凋亡可为必须在健康存活细胞中被主动抑制的“缺省”程序。使细胞经受细胞凋亡的判断受多种调节刺激和环境因素影响(Thompson，1995)。细胞凋亡的生理活化因素包括肿瘤坏死因子(TNF) ,Fas配体、转化生长因子-β、神经递质谷氨酸、多巴胺、N-甲基-D-天门冬氨酸，生长因子的撤退、基质连接的丧失、钙和糖皮质激素。细胞凋亡的与损伤相关的诱导因素包括热激、病毒感染、细菌毒素、致癌基因myc、rel和E1A、肿瘤抑制基因p53、溶细胞的T细胞、氧化剂、自由基和营养缺乏(抗代谢物)。治疗相关的细胞凋亡诱导因素包括Y辐射、紫外线辐射和多种化疗药物，包括顺钼、阿霉素、博莱霉素、阿糖胞苷、氮芥、甲氨喋呤和长春新碱。与毒素相关的细胞凋亡诱导因素包括乙醇和右旋淀粉状肽。细胞凋亡当在正常情况下不再生的细胞如神经元中病理性发生时，可特别具有破坏性后果。因为当这些细胞死亡时不能够被取代，其丧失可导致受影响的器官虚弱并且有时导致其致命性的机能障碍。这种机能障碍在多种与细胞凋亡增加有关的神经变性性疾病中得到证明，所述神经变性性疾病包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、色素性视网膜炎及小脑变性。在一方面，本发明提供了用于预防或抑制真核细胞细胞凋亡的组合物和方法。不考虑本发明的肽介导应激反应的机制，且不希望受限于任何理论或作用机理，假定所述肽能够结合P53，由此防止p53与损伤的DNA结合。p53的潜在治疗抑制剂是一种在p53信号传导途径的任何阶段起作用并导致p53介导的反应功能失活(即，阻断P53依赖性成长停滞、细胞凋亡，或两者均有)的化合物。先前的研究人员未考虑到治疗性P53抑制剂，因为他们认为治疗性p53抑制是导致癌性肿瘤发病和增殖的不利因素。因此，本发明涉及P53活性的治疗抑制和可逆性抑制，并涉及能够进行这种抑制的肽。然而，在实施与在细胞凋亡或炎症相关疾病中起作用的p53或任何其他蛋白质的抑制有关的治疗之如 ，应该提到几个目标，例如:a)提供在体内作为治疗性药物用于实践性给药充分有效的抑制剂；b)提供一种具有充分低毒性用于治疗且在足够抑制p53活性的浓度不会引起不希望的副作用的抑制剂；c)表现可逆的抑制作用。例如，长期P53失活可显著增加癌症风险；d)在临时的p53失活期间，细胞应从施加的应激恢复，并且p53活化的信号应被消除或减轻，否则当P53活化的信号有活性时，p53活性的恢复可导致细胞损伤；e)p53抑制治疗与癌症发展频率的显著增加无关。在癌症治疗过程中，本发明的肽可单独使用，或，例如，与化疗或放疗一起使用，以保护正常细胞免受由于癌症治疗或疾病或创伤施予的应激而引起的P53程序性死亡。另夕卜，在化疗过程中，肿瘤和正常细胞均被破坏。肿瘤细胞较正常细胞优先被杀死，这是成功化疗的基础。例如，通过给予治疗性P53抑制剂，正常细胞受到保护，并且化学治疗剂的剂量因此可被增加以更有效治疗癌症。应该理解，因为在p53缺陷细胞系及p53活性测定中，这些肽中的有些表现有抗细胞凋亡活性，本发明的肽不一定通过调节P53活性起作用。
检测细胞凋亡的方法细胞凋亡是细胞的一种主动、基因介导的自毁过程，且与特征性形态学和生物化学变化相关。细胞核和细胞质浓缩和濒死细胞碎裂成膜结合的细胞凋亡小体是细胞凋亡的典型特征。凋亡细胞死亡的其他特点是在特异性核酸酶活化之后染色体DNA降解为寡核苷酸片段。“抑制细胞凋亡”或“抑制细胞凋亡活性”是指与未处理的对照(即未暴露于本发明的肽的细胞)相比经历细胞凋亡的细胞数量的任何减少。优选减少至少25%，更优选减少至少50%,最优选减少至少一倍。流式细胞计量术提供了检测细胞凋亡的多种可能性。已建立和实施不同方法，其中某些在细胞表面染色，某些在细胞内染色。第一种方法其中之一除了观察到凋亡细胞萎缩和具有较高的细胞内粒度，使用DNA特异的荧光色素染色(如碘化丙锭[PI]、溴化乙锭[EtBr])。一旦致死性攻击被诱导，DNA就开始改变其图谱。细胞凋亡的DNA不仅包括断裂的DNA(在琼脂糖凝胶中观察到较短的条带，被称为DNA梯型)，且还部分被消化成单核苷酸，以致荧光色素，如PI或EtBr着染较少的 DNA(Nicoletti 等，1991)。这通常通过 FACScan (来自 Becton Dickinson,USA)的特异性荧光色素检测通道的左移( 被称为亚-Gl峰)而观察到。另一种方法是末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)介导的DNA链断裂(TUNEL)的末端标记。TUNEL方法检测经历细胞凋亡的细胞中的DNA链断裂。TdT是一种催化脱氧核糖核酸三磷酸添加至双链或单链DNA的3' -OH末端的酶。不同于正常细胞，凋亡细胞细胞核在TdT存在下掺入外源性核苷酸(dUTP)-DIG。带有轭合的荧光色素的抗DIG抗体片段使得能够观察到凋亡细胞。凋亡细胞增加产生较高数量的DNA片段，并因此具有较明亮的荧光。这个方法的优点是具有非常高的特异性(Gavrieli等，1992)。这个方法的缺点是，费用昂贵，且因为时间密集，仅可用于小组样品。因此，它不适用于大的筛选程序。在细胞凋亡早期，细胞膜极性的丧失和增加量的磷脂酰丝氨酸(PS)于细胞膜外的呈递导致产生一种新方法。膜联蛋白V是一种对于PS具有高亲和力的钙依赖性磷脂结合蛋白。在细胞凋亡的早期和间期，维持了细胞膜完整性。早期和间期的凋亡细胞显示膜联蛋白-FITC的结合增加，并对于PI染色主要为阴性。因为PS呈递于表面及由于膜的分解细胞内核酸的PI染色，细胞凋亡晚期和坏死的细胞成为双阳性。这种方法也是费用昂贵和劳动密集。检测体内和体外细胞凋亡的其他方法在美国专利N0.6，726，895和6，723，567中揭露。炎症应激反应和TNF-α和IL-6介导的炎症哺乳动物的应激反应不仅包括应激细胞的反应，而且包括已知为炎症的免疫系统的复杂活动(Nathan等,2002),其包括大量用于组织维护和愈合的免疫活动(Cohen,2000)。肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-6(IL_6)是重要生物实体，被统称为炎症前细胞因子。这些分子与几种其他相关分子一起介导与感染原的免疫识别相关的炎症反应。所述炎症反应在限制和控制病原性感染中起到重要作用。炎症前细胞因子的水平提高还与许多自身免疫性疾病有关，如中毒性休克综合征、类风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病和炎性肠病(Dinarello等，1984)。在这些疾病中，炎症的慢性加重加剧或导致许多可观察到的病理生理。在这些疾病中，一种用于潜在药物干涉的重要和可接受的治疗方法为减少炎症前细胞因子如TNF (其分泌的无细胞形式也被称为TNF-α )和IL-6。目前，在临床试验中使用许多抗细胞因子治疗。已证明，在许多自身免疫性疾病中，使用针对TNF-α的单克隆抗体具有功效(Heath，1997)。这些治疗包括类风湿性关节炎、克隆氏病(Crohn' s disease)和溃瘍性结肠炎(Rankin, 1997,和Stack等，1997)的治疗。认为所述单克隆抗体通过与可溶的TNF- α和膜结合TNF结合起作用。创伤性脑损伤触发级联事件，导致延迟性水肿、坏死及功能受损。损伤后有害介体在脑中积累，最近，认为细胞因子在脑损伤的病理生理起作用。先前有报道，在闭合性颅脑损伤之后大鼠脑中TNF-α和IL-6活性的空间性和短暂诱导。TNF-α的抑制剂，HU-211，显示改善实验模型的闭合性颅脑损伤的结果(Shohami等，1997)。已知动脉粥样硬化具有炎性组分起作用，并认为细胞因子例如IL-1和TNF可促进该疾病。炎症前细胞因子IL-6与急性期反应有关。IL-6是多种肿瘤疾病包括多发性骨髓瘤和相关的浆细胞不调症的生长因子(Treon等，1998年)。IL-6还显示是中枢神经系统炎症的重要的炎症介体。发现IL-6在一些神经疾病中水平提高，所述神经疾病包括爱滋病痴呆综合症、阿耳茨海默氏病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、CNS损伤及病毒性和细菌性脑膜炎(Gruol等，1 997)。IL-6还在骨质疏松症中起重要作用。在鼠模型中，IL-6显示可影响骨吸收并诱导破骨细胞活性(Ershler等，1997)。WOO1/01986揭露了具有抑制TNF-α能力的特殊化合物。W098/52558揭露了在治疗细胞因子介导的疾病中有用的异芳基脲化合物。W099/23091揭露了作为抗炎剂有用的另一种脲化合物。W099/32463涉及芳基脲及其在治疗细胞因子疾病和蛋白水解酶介导的疾病的用途。本发明表明，对先天性活化剂如脂多糖(LPS)和CpG寡核苷酸(见实施例7)的反应中，应激素肽可用于干涉和阻断巨噬细胞的TNF-α和IL-6分泌。因此，这些肽能改变免疫细胞的炎症前信号传导通道。如下文对于应激素-1所述，本发明的肽在下调对应激的炎症免疫反应中起作用。本发明还证明了应激素肽对自身免疫性疾病的抗炎特性，所述自身免疫性疾病如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、人多发性硬化症动物模型(见实施例8)。药物组合物及其治疗用途在另一方面，本发明涉及含有治疗有效量的本发明的肽和药学上可接受的载体的组合物。如本发明使用的“药物组合物”是指本发明所述一种或多种药剂或其生理学上可接受的盐类或溶剂与其他化学组分如生理学上可接受的载体和赋形剂的一种制剂。药物组合物的目的是便于将化合物给予生物体。含有肽或多肽作为活性成分的药物组合物制剂为本领域熟知。典型地，所述组合物可制备成液体溶液或悬浮液，然而，也可制备成固体形式，所述固体形式可于注射前悬浮或溶解。所述制剂也可被乳化。活性药物成分可与药学上可接受的及与所述活性成分相容的无机和/或有机载体混合。载体为含有或多或少惰性物质的药学上可接受的赋形剂(运输体)，所述载体当被添加至药物组合物时，可提供合适的一致性或形成所述组合物。合适的载体例如水、盐、右旋糖、丙三醇、乙醇等及其组合形式。另外，如果需要，所述组合物可含有提高所述活性成分效果的较小量的辅助物质例如增湿剂或乳化剂和PH缓冲剂。本发明所述肽的毒性和治疗功效可通过于细胞培养物或实验动物的标准药物操作方法测定，如通过测定主题化合物的IC50(提供50%抑制的浓度)和LD5tl(引起实验动物50%死亡的致死剂量)。从这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于形成用于人类的剂量范围。所述剂量根据所使用的剂型和给药途径而不同。准确的制剂、给药途径及剂量可由医师根据患者的病情而选择(见，例如，Fingl等，1975)。用于本发明的组合物给药的活性剂的量为可有效实现特定活性剂用于目标适应症的目的的量。所述组合物中活性剂的量通常为药学、生物学、治疗学或化学上有效的量。然而，所述量少于所述组合物以剂量单位形式使用时的量，因为剂量单位形式在单组合物中可含有大量化合物或活性剂，或可分别含有药学、生物学、治疗学或化学上有效的量。总有效量可然后以含有总体上有效量的活性剂的累积单位给药。本发明的肽的治疗有效量是当施用于患者时能够发挥抗细胞凋亡活性和/或抗炎症活性的量。检测本发明的肽的抗细胞凋亡活性的测定方法包括，但不限于使用特异性荧光色素如碘化丙锭及溴化乙锭进行DNA染色，膜联蛋白V测定、TUNEL测定等等；这些测定方法的某些非限制性例子在下述实施例中提供。检测本发明的肽的抗炎症活性的测定方法也为本领域熟知；这些方法的非限制性例子在下述实施例中提供。尽管根据给药途径、患者的年龄、体重、性别或病情，本发明的肽的合适剂量可不同，并且最终应由医师确定，适于成人的剂量通常为约0.2-2000mg/kg体重，优选约2-200mg/kgo本发明的药物组合物含有本发明的一种或多种化合物，及一种或多种赋形剂或稀释剂。在一个实施方案中，为一种或多种所述化合物，或这些化合物的溶剂化物或盐。

本发明使用的术语“药学上可接受的盐”是指对活生物体基本无毒性的盐。典型的药学上可接受的盐包括那些由本发明的化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸反应而制备的盐。所述盐类也称为酸加成盐。含有所述化合物和活性剂的组合物可用于将所述活性剂递送至所选生物系统及与不使用递送剂(delivery agent)情况下活性剂的给药相比可增加或改进所述活性剂的生物利用度。可通过在一定时间段递送较多活性剂或在特定时间段(如产生较快或延迟递送)或一定时间段(如持续)递送活性剂而改进递送。根据本发明使用的药物组合物因此可以传统方法配制，所述传统方法使用一种或多种含有赋形剂和辅料的生理学上可接受的载体，所述载体可促进所述活性化合物加工至可药用的制剂中。合适的制剂取决于所选的给药途径。所述药物组合物可通过任何传统和合适的途径局部或全身给药，包括，但不限于口服、腹膜内、胃肠外、静脉内、肌肉内、皮下，经皮肤、鞘内、局部、直肠、口腔、吸入或鼻内。对于注射，本发明的化合物可使用水溶液配制，优选使用生理相容缓冲液如汉克氏溶液(Hank' s solution)、林格氏溶液(Ringer' s solution)或生理盐水缓冲液配制。对于跨膜给药，可穿过屏障的合适渗透剂可用于所述制剂。所述渗透剂例如DMSO或聚乙二醇为本领域公知。
可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推合式胶囊及由明胶和增塑剂如丙三醇或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推合式胶囊可在与充填剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选稳定剂的混合物中包含活性剂。在软胶囊中，所述活性化合物可溶于或悬浮于合适溶液中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，还可添加稳定剂。所有用于口服给药的制剂应使用适于所选给药途径的剂量。可选地，本发明的化合物可掺入口服液体制剂如含水或含油悬浮液、溶液、乳状液、糖浆或酏剂。另外，含有这些化合物的制剂可作为干制品提供，在使用前与水或其他合适载体混合。这些液体制剂可含有类似悬浮剂的传统添加剂，如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝胶及被氢化的食用脂；乳化剂，例如卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、或阿拉伯胶；非水载体(可包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油酯类、丙二醇及乙醇；以及防腐剂，例如甲基或丙基对羟苯甲酸酯和山梨酸。对于吸入给药，根据本发明所使用的肽使用合适的喷射剂以从加压的包装或喷雾器的喷雾剂形式提供，所述喷射剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。至于加压喷雾剂，剂量单位可通过提供阀以递送计量量而确定。用于吸入器或吹入器的如明胶的胶囊和药筒可被配制成含有所述肽和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。本发明的药物组合物还可用于局部及内部损害的应用。如本发明所使用，术语“局部”是指“属于特定的表面”，如皮肤和粘膜，用于所述表面的某些区域的局部药剂只会影响应用的区域。所述肽/肽类似物的制剂可作为凝胶、软膏、乳膏、乳剂、包括透皮贴的持续释放制剂，且可含有脂质体和适于药物局部给药的任何其他药学上可接受的载体。所述药物组合物还可含有合适的固体胶相载体或赋形剂。所述载体或赋形剂的例子包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。在另一方面， 本发明提供了一种用于调节生物体细胞中细胞和免疫应激相关反应的方法，其包括将细胞暴露于有效量的本发明的肽。在其他方面，本发明涉及治疗或预防炎性疾病和/或变性性疾病和病症的方法，包括施用于患有所述疾病的患者治疗有效量的本发明的肽。本发明的又一方面提供一种减轻或消除因创伤或疾病导致的正常细胞死亡的方法，其包括施用于生物体治疗有效量的本发明的肽以抑制应激相关的蛋白质活性。在某些实施方案中，所述肽是含有有效量的所述肽和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物形式。应激相关的反应与下述疾病和病症有关,包括,例如,病理性疾病例如神经变性性疾病(如中风、帕金森氏病及阿耳茨海默氏病)、心肌梗塞、暴露于辐射或化疗剂、炎症、损伤(如烧伤和中枢神经系统损伤)、细胞老化、体温过高、癫痫发作、缺氧(如局部缺血和中风)，以及在移植前见于移植组织和器官中。这些病症还包括自身免疫性疾病，其特征为针对至少一种机体正常成分的个体的免疫状态。这些现象特别见于下述病理状态，包括，但不限于与系统性红斑狼疮病(SLE)、古-斯二氏综合征(或斯耶格伦氏综合征)及类风湿性关节炎相关的感染，及下述病理状态，如肉状瘤病和骨量减少、脊椎关节炎、硬皮病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化、甲状腺机能亢进、阿狄森氏病(Addison' s disease)、自身免疫性溶血性贫血、克隆氏病、Goddpasture氏综合征、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto' s thyroiditis)、原发性紫癜(purpura)出血、胰岛素依赖性糖尿病、肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、有害贫血症、链球菌感染后肾小球肾炎、银屑病和自发性不育症，以及在移植物排斥和移植物抗宿主病中可见的立即或延迟的现象。在一具体实施方案中，本发明的肽可用于治疗多发性硬化症，如本发明实施例8中所述。移植物排斥是一种个体针对有意植入患者的外源成分(体液例如血液、脑脊髓液等，细胞、组织、器官、抗体等)的免疫状态。如本发明所使用，术语“变性性疾患”、“变性性疾病”、“变性性病症”是指具有下述特征的任何疾患、疾病或病症:即不适当的细胞增殖或不适当的细胞死亡或在某些情况下两者均有，或异常或失调的细胞凋亡。这些病症还包括下述病症:即其中过度的细胞凋亡尽管在单细胞水平适当或受调，其与器官机能障碍或衰竭有关。在一个实施方案中，所述肽可用于预防患有肿瘤性疾病并经受用于治疗癌症的化疗和/或放疗的患者的非恶性组织或细胞的细胞死亡。如本发明所使用，术语“炎性疾病”和“炎性病症”是指过度或失调的炎症反应导致过度的炎症症状、宿主组织损伤或组织功能丧失的任何疾病或病症。在一个实施方案中，所述炎性疾病或炎性病症是自身免疫性疾病。在一具体实施方案中，自身免疫性疾病是多发性硬化症。在另一个实施方案中，炎性疾病或炎性病症具有与本发明所述的选自IL-6和TNF-α的至少一种炎症前细胞因子有关的病因。下述实施例被认为仅作为说明性而实质上非限制性。对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本 发明范围的情况下，可对本发明进行许多修改、变换及变化。
实施例实施例1:自噬菌体展示文库的肽筛选单克隆抗PAb-421抗体Id1-1和Id1-2如资料所述而产生和表征(Herkel等，2004)。简言之，使用PAb-421免疫BALB/c小鼠三次，并将产生最高的抗PAb-421滴度的小鼠的脾脏细胞与NSO骨髓瘤细胞融合。通过ELISA筛选生长细胞的上清液用于与PAb-421和DNA的结合。通过有限稀释分离和克隆杂交瘤Id1-1和Id1-2。根据制造厂家的说明书筛选来自New England Biolabs, Frankfurt, Germany的Ph.D.-7或Ph.D.-12文库。简言之，通过Id1-1或Id1-2单克隆抗体进行三轮筛选，并通过曬菌体DNA测序鉴定共有肽序列。然后通过Sigma-Genosis (Pampisford, UK)合成候选肽，并进一步使用功能分析进行研究，如下文所述。实施例2:候选肽对P53介导的生长停滞的作用的检测对于所选的候选肽通过检测其抑制L12细胞系对体温过高的反应的能力检测其干涉P53介导的细胞应激反应的能力(Wolf，1984)，所述L12细胞系缺乏内源性p53活性并已使用P53基因或对照载体转染。在这些细胞中，在对于体温过高的反应中，p53活性诱导生长停滞和细胞存活而非细胞凋亡(Nitta，1997)。
通过使用活体染料台盼蓝(Sigma)对细胞进行染色并使用光学显微镜计数每视野的死亡/存活细胞比例。结果:在42°C培育2个小时诱导所有缺乏p53的细胞死亡，相比之下，具有活性P53的细胞瞬时生长停滞及约80%的细胞存活。对四种肽，应激素-1到应激素_4(为应激反应特异性肽抑制剂)进行了鉴定，在100μ g/ml的浓度抑制体温过高之后的p53介导的成长停滞，并诱导几乎所有具有活性P53的细胞死亡，此为缺乏p53活性的L12细胞的反应(表I);肽序列不于表2。表1:有或无活性p53的L12细胞体温过高诱导的细胞死亡的发生率，及应激素肽对P53依赖性应激反应的抑制
权利要求
1.一种分离的肽，所述分离的肽为SEQ ID NO:1所列的分离的肽，其中所述肽含有可与针对抗P53抗体的抗独特型抗体发生免疫反应的抗原表位，其中所述抗p53抗体可与p53的C末端的至少部分调节结构域发生免疫反应，并且其中所述肽表现有抗细胞凋亡活性。
2.根据权利要求1所述的分离的肽，所述分离的肽为SEQID NO:1所列的分离的肽。
3.—种药物组合物，其含有作为活性成分的根据权利要求1或2所述的肽。
4.根据权利要求1或2所述的肽在制备用于治疗需要的受治疗者的细胞凋亡相关的变性性疾病或病症的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述受治疗者患有肿瘤性疾病并正经受用于治疗癌症的化疗和/或放疗。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述疾病或病症选自:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、创伤后的继发性 变性、中风、中枢神经系统中毒、青光眼、黄斑变性、心肌梗塞、辐射病、体温过高、缺氧、暴发性中毒肝、中风、中枢神经系统损伤、癫痫发作、缺氧、古-斯二氏综合征(或斯耶格伦氏综合征)、类风湿性关节炎、肉状瘤病、骨量减少、脊椎关节炎、硬皮病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、甲状腺机能允进、阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、Goddpasture氏综合征、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、原发性紫癜出血、肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、肾衰竭及不育症。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述肽在体内调节细胞内的细胞内蛋白质活性。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述肽离体调节细胞内的细胞内蛋白质活性。
9.根据权利要求4所述的用途，其中通过选自口服、局部、经皮肤及胃肠外的途径将所述肽施用于需要的受治疗者。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述疾病为肌萎缩性脊髓侧索硬化。
全文摘要
本发明涉及介导应激反应的肽抑制剂，更特别地涉及真核细胞中能够抑制细胞应激反应和免疫应激反应的肽。本发明提供了利用单克隆抗DNA抗体识别的肽治疗人变性性疾病和炎症的组合物和方法，所述肽具有抗细胞凋亡和抗炎症活性。本发明还提供了抗体分子及其用于分离所述肽的用途。
文档编号A61P25/16GK103214555SQ20131007935
公开日2013年7月24日 申请日期2005年8月23日 优先权日2004年8月23日
发明者约翰尼斯·赫克尔, 艾润·R·科恩, 瓦达·罗特, 安斯哥·W·洛思, 纳塔·艾瑞兹, 艾维赛伊·米姆兰, 纳阿曼·凯姆 申请人:维兹曼科学研究所耶达研究与发展有限公司