专利名称：用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所 ...的制作方法
技术领域：
符合本发明的一种方法涉及,用经不可切割接头(non-cleavabIe linker)连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物(cell-binding agent maytansinoid coniugates)靶向特定细胞群。符合本发明的另一种方法是制备所述偶联物的方法。符合本发明的一种组合物涉及新颖的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其中将美登木素生物碱经不可切割接头连接于细胞结合剂。符合本发明的另一种组合物涉及新颖的美登木素生物碱酯(maytansinoid esters)。
背景技术：
美登木素生物碱(maytansinoids)是高度细胞毒性的药物。美登素(maytansine)首先由Kupchan等人从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离出来，它比传统的癌症化疗剂如甲氨碟呤、柔红霉素和长春新碱的细胞毒性强100至1000倍(美国专利3，896，111号)。随后，发现一些微生物也产生美登木素生物碱，如美登木醇(maytansinol)和美登木醇的 C-3酯(美国专利4，151，042号)。也报道了合成的美登木醇C-3 酯及美登木醇的类似物(Kupchan 等人，21J.Med.Chem.31-37 (1978) ；Higashide 等人270Nature721-722(1977) ；Kawai 等人，32Chem.Pharm.Bull.3441-3451 (1984))。制备 C_3酯的美登木醇类似物的例子包括，在芳环上有修饰(例如，脱氯)或在C-9、C-14(例如，羟化的甲基)、C-15、C-18、C-20和C-4，5处有修饰的美登木醇。天然发生的和合成的C-3酯可以被分为两组:
(a)带有简单羧酸的C-3 酯(美国专利 4，248, 870 ;4，265,814 ;4，308，268 ;4，308，269 ；4，309，428 ;4，317，821 ;4，322，348 和 4，331，598)，和
(b)带有N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯(美国专利4，137，230和4，260，608;和Kaiwa 等人，32Chem.Pharm.Bull.3441-3451 (1984))。发现组(b)的酯比组(a)的酯更有细胞毒性。美登素是有丝分裂抑制剂。已报道，用美登素在体内处理L1210细胞，导致细胞的67%积累在有丝分裂期。据报道，未被处理的对照细胞显示了范围在3.2%至5.8%之间的有丝分裂指数(Sieber等人.43Bibl.Haematol.495-500 (1976))。用海胆卵和蛤卵进行的
实验表明，美登素通过抑制微管蛋白质(microtubule)-微管蛋白(tubulin)的聚合而
干扰微管的形成，从而抑制有丝分裂(Remillard等人，189Sciencel002-1005 (1975))。在体外，已发现P388、L1210和LY5178鼠白血病细胞悬液被美登素抑制，美登素的剂量是10_3至lO—ig/ml，其中P388细胞系最为敏感。也已显示，美登素是人鼻咽癌细胞的体外生长的活性抑制剂，并且据报道，人急性淋巴细胞白血病系C.E.M.被低至10_7yg/ml 的浓度所抑制(Wolpert-DeFillippes 等人，24Biochem.Pharmacol.1735-1738(1975))。也已显示，美登素在体内是活性的。在50倍至100倍的剂量范围内，P388淋巴细胞白血病系统中的肿瘤生长被抑制，这表明了高的治疗指数；用L1210鼠白血病系统、人Lewis肺癌系统和人B-16黑素癌系统，也可以显示出显著的抑制活性(Kupchan，33Ped.Proc.2288-2295(1974))。由于美登木素生物碱是高度细胞毒性的，预期它们在治疗许多疾病如癌症中有用。此预期尚需实现。美登素的临床试验不是令人满意的，这归因于许多副作用(Issel等人，5Cancer Treat.Rev.199-207 (1978))。对中枢神经系统和胃肠症状的不利作用(adverse effect)是一些患者拒绝进一步治疗的原因(Issel at204),并且美登素似乎和周围神经病相关，该周围神经病可能是累积的(Issel at207)。因此，应用祀向技术(targeting techniques)将药物选择性地输送至祀细胞(target cell)。对几种药物研究了可切割的和不可切割的接头，但是在大多数情形下，包括美登木素生物碱的情形下，体外细胞毒性实验揭示了，抗体-药物偶联物极少达到与游离的非连接药物相同的细胞毒性能力。因此，普遍接受的是，为了使美登木素生物碱的靶向输送有效，美登木素生物碱和细胞结合剂之间的连接必需是可切割的。
此外，在免疫毒素(immunotoxin)领域中，已显示，含有接头的偶联物，所述接头在单克隆抗体和有催化活性的蛋白毒素(toxins)之间具有二硫桥键，比含其它接头的偶联物更具细胞毒性。参见，Lambert 等人，260J.Biol.Chem.12035-12041(1985)；Lambert 等人，Immunotoxinsl75-209(A.Frankel, ed.1988),和 Ghetie 等人，48CancerRes.2610-2617(1988)。这归因于细胞内谷胱甘肽的高浓度，其有助于有效切割抗体分子和毒素之间二硫键。最近，经不可切割接头SMCC连接于抗Her2乳腺癌抗体TA.1的美登木素生物碱偶联物显示出，比经带有可切割二硫键的接头连接于TA.1的美登木素生物碱偶联物的效力低 200 倍(Chari 等人，52Cancer Res.127-133 (1992))。因此，试图找到通过含二硫的可切割接头连接的细胞毒性偶联物。Shen等人描述了甲氨蝶呤转化为巯基乙酰胺衍生物，随后通过二硫键与聚-D-赖氨酸(poly-D-lysine)连接(260J.Biol.Chem.10905-10908 (1985))。也描述了制备含三硫的毒性药物加利车霉素(calicheamicin)与抗体的偶联物(Menendez 等人，Fourth International Conference onMonoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract81 (1989))。美国专利5，208，020和5，416，064，其全部公开内容在此特意并入作为参考，公开了细胞毒性偶联物，其包括经可切割接头连接于特异性美登木素生物碱衍生物的细胞结合剂，所述接头如含有二硫基团的接头、含有酸不稳定基团的接头、含有光不稳定基团的接头、含有肽酶不稳定基团的接头、和含有酯酶不稳定基团的接头。美国专利6，333，410B I，其全部公开内容特别地在此并入作为参考，公开了制备和纯化用于和细胞结合剂连接的含硫醇的美登木素生物碱的过程，以及美国专利6，441，163B1，其全部公开内容特别地在此并入作为参考，公开了制备美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性偶联物的一步法，其中接头是含二硫的可切割接头。此外，美国专利5，208，020教导了带有不可切割接头的抗体-美登木素生物碱偶联物，其中接头包括马来酰亚胺基团(maleimido group)。然而,该参考文献中没有实验数据证明这种偶联物对治疗疾病有效。出乎意料地，现在发现，经不可切割接头连接的美登木素生物碱和细胞结合剂的细胞毒性偶联物非常有效，并且在许多情形下，比具有可切割接头的美登木素生物碱和细胞结合剂的偶联物有出乎意料的优势。
发明概述下面描述的本发明的例证性、非限制性实施方案克服了上述不利之处和上面没有描述的其它不利之处。同时，本发明不需要克服上述不利之处，下面描述的本发明的例证性、非限制性实施方案可以不克服上述的任何问题。本发明的一个方面是,将美登木素生物碱(maytansinoid)祀向(target)选择细胞群(selected cell population)的方法,包括,用细胞结合剂美登木素生物碱偶联物接触细胞群或组织，该细胞群或组织被怀疑含有来自所述选择细胞群的细胞，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割接头连接于细胞结合剂。本发明的另一方面是治疗肿瘤、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、病毒感染、寄生虫感染和其它疾病的方法，所述疾病可以通过靶向疗法来治疗，其中靶向制剂(targeting agent)是细胞结合剂,所述方法包括，向需要治疗的患者给予有效量的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其中一个或多个美登木素生物碱被连接于细胞结合剂，或所述偶联物的药学上可接受的制剂(formulation)或溶剂合物(solVate)。本发明的另一方面是细胞结合剂美登木素生物碱偶联物，其中一个或多个美登木素生物碱经不可切割接头连接于细胞结合剂。本发明的另一方面是包括上述偶联物的组合物。本发明的另一方面是制备上述偶联物的方法。本发明的另一方面是新颖的美登木素生物碱酯。本发明提供了下述项:
1.使美登木素生物碱靶向选择细胞群的方法，方法包括:用细胞结合剂美登木素生物碱偶联物接触怀疑含有所述选择细胞群的细胞群或组织，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割接头共价连接于所述细胞结合剂并且所述细胞结合剂结合选择细胞群中的细胞。
2.项I所述的方法，其中所述不可切割接头基本上抗酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割或二硫键切割。
3.项I所述的方法，其中所述不可切割接头不具有硫原子。
4.项3所述的方法，其中所述接头来源于基于二羧酸的部分。
5.项4所述的方法，其中所述接头来源于基于α，ω-二羧酸的部分，其中所述α，ω - 二羧酸的通式是HOOC-X1-Yn-Zm-COOH,其中X是具有2至20个碳原子的线性或分支的烷基、烯基或炔基，Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基，Z是具有6至10个碳原子的取代的或未取代的芳基，或取代的或未取代的杂环基团，其中杂原子选自N、O或S，并且其中l、m和η的每一个是O或1，条件是它们不同时均为O。
6.项5所述的方法， 其中所述α，ω-二羧酸是己二酸、戊二酸、庚二酸、己烯-1，6-二酸、戊烯-1，5- 二酸、环己烷-二酸或环己烯-二酸。7.项I所述的方法，其中所述不可切割接头带有硫原子。
8.项7所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于马来酰亚胺的部分。
9.项8所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于马来酰亚胺的部分，选自:N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)_环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、K -马来酰亚胺i^一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、Y -马来酰亚胺丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε -马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N- ( α -马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基_6_ ( β -马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亚胺基4-(P-马来酰亚胺苯基)-丁酸酯(SMPB)、和N-(P-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯(PMPI)。
10.项9所述的方法，其中所述不可切割接头来源于SMCC。
11.项7所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于卤代乙酰基的部分。
12.项11所述的方法，其中所述不可切割接头来源于基于卤代乙酰基的部分，选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
13.项12所述的方法，其中所述不可切割接头来源于SIAB。
14.项I所述的方法，其中所述接头位于至少一个美登木素生物碱的C-3羟基、C-14羟甲基、C-15羟基或C-20去甲基中的任一处。
15.项I所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-丙氨酸的酯。
16.项I所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱是美登木醇的含N-甲基-半胱氨酸的酯。
17.项I所述的方法，其中所述至少一个美登木素生物碱被表示为式(II’-L)、(II’-D)或(II，-D, L):
权利要求
1.带有活性琥珀酰亚胺基酯或硫代琥珀酰亚胺基酯的美登木素生物碱硫醚。
2.权利要求1的美登木素生物碱硫醚，其中所述美登木素生物碱硫醚是通过将含有硫醇的美登木素生物碱与交联剂反应获得的。
3.权利要求2的美登木素生物碱硫醚，其中所述含有硫醇的美登木素生物碱是N2’-脱乙酰-N2，-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DMl)或N2，-脱乙酰-N2，-(4-甲基_4_巯基_1_氧戍基)-美登素(DM4)。
4.权利要求3的美登木素生物碱硫醚，其中所述交联剂选自N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、K -马来酰亚胺i^一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N- ( α -马来酰亚胺乙酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6- ( β -马来酰亚胺丙酰胺基)已酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。
5.权利要求4的美登木素生物碱硫醚，其中所述交联剂是N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)。
6.权利要求1的化合物，其中所述化合物如下式所示:
7.权利要求1的化合物，其中所述化合物如下式所示:
全文摘要
本发明提供了用经不可切割接头连接的细胞结合剂美登木素生物碱偶联物靶向特定细胞群的方法、所述偶联物和制备所述偶联物的方法。本发明公开了一种方法，用于将美登木素生物碱靶向选择细胞群，方法包括用细胞结合剂美登木素生物碱偶联物接触怀疑含有所述选择细胞群的细胞群或组织，其中一个或多个美登木素生物碱通过不可切割的接头共价连接于所述细胞结合剂，并且所述细胞结合剂结合选择细胞群中的细胞。
文档编号A61P35/00GK103223174SQ201310118580
公开日2013年7月31日 申请日期2004年10月12日 优先权日2003年10月10日
发明者R·斯蒂夫斯, R·卢茨, R·查里, H·谢, Y·科夫通 申请人:伊缪诺金公司