专利名称：三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用。
背景技术：
大量研究均表明三氧化二砷具有抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的功能并且具有显著的临床疗效。研究发现三氧化二砷可以抑制诱导宫颈癌细胞凋亡、并通过与cytokeratin 18结合以及下调hTERT mRNA的表达而发挥其作用。同样的,三氧化二砷可抑制人淋巴细胞系T2的增殖，研究发现它可能通过调控SHP-1启动子以及CpG岛的功能，来干扰正常细胞或肿瘤细胞的增殖。另外三氧化二砷还可抑制肝癌细胞以及早幼粒白血病细胞的增殖，其中研究最深入的是其在抑制早幼粒白血病细胞增殖、凋亡和死亡的研究。而且有很多报道发现了该化合物在治疗白血病的临床疗效，例如张德芳等采用全反式维甲酸(ATRA)与三氧化二砷(As2O3)和化疗药物联合方案治疗初诊急性早幼粒细胞白血病，总有效率达到96.9%，且无严重不良反应发生。另外，根据哈尔滨医学院的临床实践，瑞金医院血液科针对早幼粒白血病采用三氧化二砷治疗，并进行了一系列的研究，在国际上首先证实了三氧化二砷的应用可以特异诱导APL细胞调亡，使得复发难治白血病得了突破，CR率可达到80%-90%，部分患者得以长期生存。从而开启了三氧化二砷用于白血病以及其它肿瘤的基础和临床研究。虽然如此，但三氧化二砷作为一种剧毒化合物，对泌尿系统具有严重的毒性作用，因此有关三氧化二砷与肾癌的相关研究较少。目前已经清楚的是，0.5μΜ-2μΜ的三氧化二砷可用于治疗早幼粒白血病，且通过静脉注射注入人体后对机体的其它器官和系统的损伤较小。因此我们选择研究不同剂量三氧化二砷作用不同时间对肾癌细胞的影响，以探讨在最低有效浓度下三氧化二砷治疗肾癌的潜在临床价值。结果表明0.5 μ M三氧化二砷刺激24h可显著抑制人肾癌细胞786- 0的增殖。为了进一步探讨0.5 μ M三氧化二砷抑制人肾癌细胞786-0增殖的作用机理，我们选择研究该药物对PI3K-Akt细胞增殖信号转导途径的影响。PI3K-Akt信号转导途径是调控肿瘤细胞增殖的主要信号途径，由于抑制基因PTEN的低表达从而诱导了 PI3K的表达，进而促进了 Akt分子的表达和磷酸化，从而开启了细胞内蛋白合成和DNA合成途径，以促进肿瘤细胞大量增殖。同样人肾癌细胞786-0的增殖也受PI3K-Akt信号途径调控。研究中我们首次报道了 0.5 μ M三氧化二砷对人肾癌细胞786-0细胞内PI3K-Akt信号途径的影响，结果得出0.5 μ M三氧化二砷抑制人肾癌细胞786-0细胞增殖的同时，也抑制ΡΙ3Κ的mRNA和蛋白的表达，进而阻碍了 Akt的表达。因此可以得出，PI3K-Akt信号途径参与了三氧化二砷抑制人肾癌细胞增殖的过程，且更明确地表明了三氧化二砷在治疗肾癌中的潜在临床价值。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供三氧化二砷的新用途，即在制备抗癌药物中的新应用。
本发明的技术方案为:三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用，具体的是在制备治疗肾透明细胞腺癌药物中的应用。本发明所述的治疗肾癌药物的剂型为注射剂。所述的注射剂中三氧化二砷的摩尔浓度为0.5-2.0 μ M，优选为0.5 μ Μ。本发明研究结果表明三氧化二砷通过抑制PI3K_Akt转导途径来抑制人肾癌细胞786-0增值，具有治疗人肾癌的潜在临床价值。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。三氧化二砷对人肾癌细胞786-0增值及其PI3K-Akt转导途径的影响。I材料与方法 1.1细胞培养
肾透明细胞癌细胞系786-0从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买，目录号TCHu186ο将购买的细胞接种于RPM1-1640培养基(10%胎牛血清和50 μ g/mL青链霉素)，5%C02,培养箱湿度为90%，37°C培养3天。每培养3天传代一次，取对数生长期的细胞进行实验。1.2实验分组和设计
将对数生长期的细胞分别接种于96孔板中，并在5%C02条件下培养。当96孔底部的60%面积贴满细胞后，吸去培养基并换新的RPM1-1640培养基。5%C02，37°C继续培养24h。最后将96孔细胞分成对照组和实验组，每组45个孔。加入药物(0.5μ M或1.0 μ M三氧化二砷)和生理盐水之后分别于0h、12h、和24h取出15个孔细胞，使用BrdU实验检测每孔细胞DNA合成量，使用荧光定量PCR检测PI3K和Akt相对mRNA表达量，使用Western Blot检测细胞内PI3K和Akt的相对表达量。fcdU掺入实验
在收集待测孔细胞进行检测前4h时向每个孔中加入一定量BrdU母液至BrdU终浓度为100mM，5%C02，37°C培养。培养结束后，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400 X g或1700rpm离心5分钟，去上清，加入10 mL 70% EtOH重悬。用洗涤缓冲液(PBS + 0.5% IFS)洗涤。离心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5% IFS，室温孵育20分钟。加入Iml洗涤缓冲液洗涤细胞。离心去上清，以0.1M的四硼酸钠(Na2B4O7)重悬细胞，室温孵育2分钟。用Iml洗涤缓冲液洗涤细胞2次。用50 μ L洗涤缓冲液重悬细胞，加入ant1-BrdU抗体，4°C孵育20分钟。加入1.5ml洗涤缓冲液洗一次。用50 μ L洗涤缓冲液重悬细胞，加入用于FITC结合Fe段的抗体，4°C孵育20分钟。加入1.5ml洗涤缓冲液洗涤一次。在450nm的波长处读取吸光值，用于定量每个孔内DNA合成量。1.3荧光定量PCR
取出不同时间(0h，12h和24h)对照组和观察组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400Xg或1700rpm离心5分钟,去上清,收集的细胞。使用TRIzol Reagent试剂盒抽提细胞的总 mRNA，并用 DEPC 水定量至 5 μ g/ μ L。使用 PrimeScript One Step RT-PCR Kit将总mRNA拟转录成cDNA ，并定量。特异性引物为: GAPDH-F: 5’-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3，，GAPDH-R:5，-GCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3，，
P13K-F:5 ’ -TTTCTCATGGCTGTCCTTCAG-3，，
P13K-R:5，-CAGGAGAATCTAACGGATGC-3，，
Akt-F:5’ -CATCACATCTGGTTTCCTTGG-3’，
Akt-R:5’ -AACTGGAAATGTAATTTTGGG-3，，均为上海生工。以 GAPDH 为内参，使用 SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒和使用伯乐的IQ5 PCR系统扩增cDNA中的组织因子基因片段和GAPDH基因片段，反应条件设置为:95°C变性5 min，94°C变性30s，57°C退火I min，72°C延伸30s，30个循环，72°C延伸10 min。计算每个样品TF和GAPDH的Λ Ct，并采用Λ Ct法计算每个样品中TF的mRNA转录倍数。1.4免疫印迹
取出不同时间(0h，12h和24h)对照组和观察组3个孔的细胞，胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400Xg或1700rpm离心5分钟，去上清，用缓冲溶液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4,150 mMNaCl,1% Nonidet P-40,0.5% deoxycholic acid,0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS],5 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA],2 mM phenylmethylsulfonyI fluoride[PMSF],20 mg/mL aprotinin,20 mg/mL leupeptin,10 mg/mL pepstanin A and 150 mMbenzamidine)重悬细胞至至5X 101°个。破碎后12000rpm离心20min后取上清进行电泳。使用5%浓缩胶和15%分离胶进行电泳分离，并使用电转将蛋白转至PVDF膜上。10%牛奶封闭PVDF膜lh，37度孵育一抗I小时，然后PBST清洗3次，每次5min，然后用37度孵育二抗稀释液，并用PBST清洗3次，每次5min。最后用ECL+plus Western blotting systemkit (Amersham, USA)配置显光液，然后使用 3490 photo gel imaging systems (Epson,Japan)拍照并记录,并用Image Pro PLUS软件分析每个蛋白与GAPDH的相对量。1.5统计学分
采用SPSS19.0软件进行统计学分析。所有连续资料均采用t检验，结果以平均值土标准差(I 土 s )表示。所有离散资
料均采用卡方检验，统计结果以X2表示。P〈0.05，表示两组间比较具有显著性差异。2 结果
2.1三氧化二砷对人肾癌细胞786-0增殖的影响
使用BrdU掺入实验来检测786-0在三氧化二砷(观察组)和PBS (对照组)刺激下DNA合成量，用以评价三氧化二砷对人肾癌细胞786-0增殖的影响。由表I可知，0.5 μ M和I μ M三氧化二砷刺激24h后，观察组DNA合成量显著低于Oh时的DNA合成量(p〈0.05)，由表2可知,0.5μΜ三氧化二砷刺激24h后且均显著低于Oh和12h的对照组DNA合成量(p均〈0.05)。结果表明0.5 μ M三氧化二砷刺激24h有效地抑制人肾癌细胞786-0增殖。表I不同浓度As2O3对人肾癌细胞786-0增殖的影响(0D450，i ±s)
权利要求
1.三氧化二砷在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所述的三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的三氧化二砷在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所述的三氧化二砷在制备治疗肾透明细胞腺癌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的三氧化二砷在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所述的治疗肾透明细胞腺癌药物的剂型为注射剂。
4.根据权利要求3所述的三氧化二砷在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所述的注射剂中三氧化二砷的摩尔浓度为0.5-2.0 μ M。
5.根据权利要求3或4所述的三氧化二砷在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所述的注射剂中三氧化二 砷的摩尔浓度为0.5 μ Μ。
全文摘要
本发明公开了三氧化二砷在制备治疗肾癌药物中的应用。本发明的技术方案要点为三氧化二砷通过抑制PI3K-Akt转导途径来抑制人肾癌细胞786-O增值，因此三氧化二砷可以用于制备治疗肾癌的药物尤其是用于制备治疗肾透明细胞腺癌药物中的应用。
文档编号A61K33/36GK103211837SQ201310154548
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者张艳, 朱峰, 徐春阳, 李爽, 韩广业, 郭珂一, 尉娜, 姜洪波, 仲丽丽, 解娜, 杨纯生, 李静, 冯素萍, 刘旭, 代贝贝, 周永霞, 徐佳, 李卓俞, 刘志娟 申请人:新乡医学院