专利名称：果蝇基因lk6的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种果蝇基因lk6的新用途。
背景技术：
a -synuclein基因的聚集从而产生细胞毒性，导致多巴胺能神经元的选择性凋亡，而此类a-synuclein的聚集物正是黑质中的路易小体(LB)的主要成分。已有的研究显示a-synuclein表达产物的磷酸化在这个聚集过程中具有很重要的作用，尤其是第129位丝氨酸的磷酸化，这暗示，a -synuclein基因129位丝氨酸的磷酸化在H)发病过程具有一定的潜在的作用。如今的研究表明，酪蛋白激酶(CKl和CK2)、G蛋白偶联受体激酶家族(GRK2，GRK3, GRK5和GRK6)等都具有磷酸化a-synuclein基因丝氨酸第129位的能力。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种lk6基因在制备调节a-synuclein基因丝氨酸129位磷酸化药物中的应用。本发明的 目的之二在于提供一种lk6基因在制备调节大脑多巴胺能神经元衰退药物中的应用。本发明主要包括:构建过表达lk6基因的UAS- a -Synuclein-elav-GAL4果蝇品系；DNA电泳检测a -synuclein基因和GAL4基因；果蝇行为学检测lk6基因对a -synuclein基因129位丝氨酸磷酸化的影响；免疫荧光的手段检测果蝇脑部lk6基因对a -synuclein蛋白129位丝氨酸的磷酸化程度的影响。果蚬蛋白激酶lk6可以通过ERK信号通路调节a-synuclein 129位丝氨酸的磷酸化，本发明们首先构建了能够在果蝇中枢神经系统中同时表达lk6基因和a -synuclein基因的elav-GAL4_UAS_ a -synuclein果蚬品系。然后通过DNA电泳手段鉴定a -synuclein基因和GAL4基因，再利用果蝇寿命检测和组织免疫荧光的手段检测果蝇脑部高级神经纤维网中a-synuclein基因蛋白产物在lk6基因的作用下的磷酸化情况。为全面研究H)的发病病因在模式生物果蝇中提供了进一步的依据和作用机制。
图1为DNA电泳鉴定3只随机取的elaV-GAL4_UAS- a -synuclein果蝇品系的GAL4基因720bp (泳道1、2、3鉴定果蝇品系，泳道4为[,elav-GAL4/+; +/+品系果蝇，泳道5为Marker,泳道6为清水模板对照)和a -synuclein基因423bp (泳道I为清水对照，泳道3、4、5为鉴定果蚬品系，泳道2为w; +/+;UAS-a-synuclein/ +品系果蚬,泳道5为Marker,泳道6为清水模板对照)。图2为过表达lk6基因后的果蝇寿命的行为学检测。果蝇数量约为100只，每隔3天检测一次，其中对照组蓝线果蝇品系基因型为w; elav-GAL4/+;+/+, H)果蝇品系红线基因型为w; elav-GAL4/+;UAS- a -synuclein/+,过表达lk6基因果蚬品系绿线基因型为w;elav-GAL4/+;UAS- a -synuclein/ UAS_lk6。图3为过表达lk6基因导致果蝇脑部高级神经纤维网中a-synuclein基因129位磷酸化蛋白产物的增多。图4为过表达lk6基因使得果蝇背内侧神经集群中的多巴胺能神经元减少。
具体实施例方式实施例一:检测lk6基因在果蝇神经系统中对a -synuclein基因129位丝氨酸磷酸化的效果
1.能够在果蝇中枢神经系统中同时表达lk6基因和a -synuclein基因的elav-GAL4-UAS- a -synuclein 果蚬品系的构建。用 w; elav-GAL4/Cyo; +/+ 品系与 w;Bl/Cyo;Tm2/Tm6B 品系杂交得到 w; elav_GAL4/Cyo;+/TM2 品系。再用 w; +/+；UAS- a -synuclein / UAS-a-synuclein 品系与 w; Bl/Cyo; Tm2/Tm6B 品系杂交得到 w; +/BI; UAS- a -synuclein /TM6B 品系。然后用 w; elav_GAL4/Cyo;+/TM2 品系与 w; +/ BI;UAS- a -synuclein /ΤΜ6Β 品系杂交获得 w; elav_GAL4/Bl; UAS- a -synuclein /TM2 品系。最后将 w; elav_GAL4/Bl; UAS- a -synuclein/TM2 品系自交获得 w; elav_GAL4/Bl;UAS- a -synuc·lein/ UAS- a -synuclein 品系。2.将构建好的 elav-GAL4_UAS-a-synuclein 果蚬品系再与 w; +/+；UAS-lk6/ UAS-lk6品系杂交获得在神经系统中过表达载lk6基因的w; elav-GAL4/+;UAS- ct —synuclein / UAS-lk6果妮品系。将此品系果妮与对照组果妮品系w;elav_GAL4/+; +/+和 F1D 模型果妮品系 w; elav_GAL4/+; UAS- a -synuclein/+进行培养做寿命检测，以及20天年龄段果蝇脑切片做组织免疫荧光染色分析。具体步骤为:
a).每隔3天记录果蝇的存活率，比较w; elav_GAL4/+;+/+、w;elav-GAL4/+；UAS- a -synuclein/+、w; elav_GAL4/+；UAS- a -synuclein/ UAS_lk6三组果蝇的寿命情况。实验结果显示，过表达lk6基因后，果蝇在16天，存活率降至50%以下。结果见图1。b).比较 w; elav_GAL4/+;+/+对照组果蚬品系、w;
elav-GAL4/+;UAS-a -synuclein/+PD模型果蚬品系已经过表达lk6基因w;elav-GAL4/+;UAS-a -synuclein/ UAS_lk6果蚬品系在果蚬20天年龄时,脑部高级神经纤维网中a -synuclein蛋白丝氨酸129位的磷酸化情况及其分布情况。实验结果表明过表达lk6基因w; elav_GAL4/+; UAS-a-synuclein/ UAS_lk6果蚬品系脑部高级神经纤维网中a -synuclein蛋白磷酸化效果增强，并显示出由背内侧神经集群向背中侧神经集群及背外侧神经集群延伸的趋势。结果见图2。c).比较 w; elav_GAL4/+;+/+对照组果蚬品系、w;
elav-GAL4/+;UAS-a -synuclein/+PD模型果蚬品系已经过表达lk6基因w;elav_GAL4/+; UAS-a-synuclein/ UAS_lk6果蚬品系在果蚬20天年龄时，背内侧神经集群中多巴胺能神经元衰退的情况。实验结果显示，过表达lk6基因w;elav-GAL4/+;UAS-a -synuclein/ UAS_lk6果蚬品系背内侧神经集群中多巴胺能神经元的衰退要比对照组果蝇多。结果见图3。
权利要求
1.一种lk6基因在制备调节a -synuclein基因丝氨酸129位磷酸化药物中的应用。
2.—种lk6基因在制备调节大脑多巴胺能神经元衰退药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种果蝇基因lk6的新用途，本发明通过DNA电泳手段鉴定出能够过表达lk6基因的elav-GAL4-UAS-α-synuclein果蝇品系。通过组织免疫荧光的手段检测到，在过表达lk6基因后的果蝇脑部高级神经纤维网中，α-synuclein蛋白丝氨酸129位磷酸化程度增强，磷酸化蛋白分布延伸，并且加剧果蝇脑部背内侧神经集群多巴胺能神经元衰退。这为全面研究PD的发病病因提供了进一步的依据和作用机制。
文档编号A61K48/00GK103251959SQ20131019941
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者文铁桥, 张仕卿 申请人:上海大学