Lgr4基因用于筛选促进白色脂肪棕色化的药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物和医药领域，公开了G蛋白偶联受体中，糖蛋白激素受体LGR4基因的新用途。建立Lgr4基因敲除的小鼠模型，通过表型观察，发现基因突变小鼠体重明显减轻，糖耐量改善，消耗增强，代谢水平提高，体内的白色脂肪减少，转化为棕色脂肪。结合人群数据研究，本发明将LGR4基因作为分子靶点或药物作用靶点，用于筛选或制备促进白色脂肪棕色化、提高代谢水平的药物。
【专利说明】LGR4基因用于筛选促进白色脂肪棕色化的药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和医药领域，具体为应用LGR4基因筛选药物，尤其是促进白色脂肪分化为棕色脂肪的药物。
【背景技术】
[0002]肥胖是一种脂肪过度堆积所导致的慢性非传染性疾病。世界卫生组织的统计数据表明，其发病率在世界范围内呈逐年上升趋势，肥胖也是2型糖尿病、心血管疾病及肿瘤等疾病的重要危险因素，严重危害社会公共卫生，造成巨大的社会负担。因此对肥胖干预靶点的研究具有强烈的紧迫性和极大的社会价值。
[0003]脂肪组织是调节机体能量代谢的重要器官，根据功能不同主要可以分为两种:一种是白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT), 一种是棕色脂肪组织(brown adiposetissue, BAT)。白色脂肪组的主要功能是将富余的能量以甘油三酯的形式储存起来，棕色脂肪组织的主要功能则是通过氧化脂肪酸来产热，消耗能量。棕色脂肪的产热功能主要归功于棕色脂肪细胞内所含的大量的线粒体:线粒体内膜上存在一种极为重要解偶联蛋白一UCPl, UCPl能够促进质子由线粒体内外膜间隙漏入线粒体内，从而使线粒体电子传递链产生电化学势能以热能的形式散发，进而通过BAT丰富的血管输送到身体的各个部位。多项研究表明，增强棕色脂肪组织的功能能够使小鼠体重减轻，而ob/ob和db/db遗传性肥胖小鼠的棕色脂肪组织则存在明显的功能缺陷。这些研究结果均提示棕色脂肪具有抵抗肥胖的作用。此外，研究还发现伴随棕色脂肪功能的增强，小鼠对胰岛素的敏感性随之增加，血清游离脂肪酸水平明显下降，这表明棕色脂肪活性的改善对糖尿病及其它代谢性疾病具有一定的治疗作用。
[0004]从能量平衡的角 度来看，通过激活BAT活性以增加产热、增加能量消耗量从而达到减少体内脂肪、抵抗肥胖的目的不失为一种好方法。一些研究者也在利用小分子药物或者生长因子增加BAT活性以及BAT移植方面做了一些研究。有意思的是，研究人员在一些小鼠模型中发现，在某些刺激条件下白色脂肪可以转化为类棕色脂肪。最初人们观察到，在寒冷或P肾上腺素受体激动剂刺激后，小鼠白色脂肪组织内的线粒体数目明显增多，并且出现了棕色脂肪细胞标志物UCPl的表达，提示白色脂肪组织内出现了功能性的棕色细胞。体外研究结果证实，小鼠前白色脂肪细胞3T3-L1和3T3-F442A亦可在体外被诱导出UCPl的表达，甚至人白色脂肪细胞也可被诱导出UCPl表达。随后在多种基因敲除或转基因小鼠中，研究人员也观察到白色脂肪组织棕色化的现象；与人们预期结果一致，这些小鼠均出现了体重减轻、能量消耗增加的表型，并能够对抗高脂饮食诱导的肥胖。
[0005]但是棕色脂肪及白色脂肪棕色化在医疗方面的应用相当长一段时间内不被看好，因为人们曾一度认为，人类体内在婴儿期过后就没有BAT的存在了，但是最近在The NewEngland Journal of Medicine杂志上同期的三篇文章证实,健康成年人在寒冷条件刺激下，其颈后、锁骨上等部位出现了棕色脂肪组织，并且棕色脂肪组织的活性与体脂含量呈负相关关系，与静息状态的代谢率呈明显的正相关关系。后来陆续的发现其它的方法也可以诱导成人体内出现这种棕色脂肪组织。
[0006]已有的研究发现，这些表达UCPl的棕色样脂肪和传统的棕色脂肪在UCPl表达的基因调控方式上有所不同，并且这些棕色样脂肪组织同传统的棕色脂肪组织也有不同的蛋白表达谱，这些结果提示这两种组织从基因表达调控到功能都不尽相同，可能是两种不同的组织。目前对于这部分棕色样脂肪细胞的来源还存在争议，多数研究提示，这些脂肪细胞来源于白色脂肪组织内的前体干细胞SVF，而与中胚层来源的经典棕色脂肪细胞并不相同。最近的研究结果显示，传统的肩胛骨区的棕色脂肪组织来源于一种表达myf-5的祖细胞，和肌肉是同一种来源。而这些在白色脂肪组织中出现的被诱导出来的棕色脂肪样细胞并不是来源于这种表达myf-5的祖细胞，所以这些被诱导出来的棕色脂肪样细胞被认为是一种新型的脂肪组织，并被称为米色脂肪。这些研究结果更新了人们以往对棕色脂肪的认识，把棕色脂肪细胞又细分成了两类，一种是分布于肩胛间区的经典棕色脂肪细胞，另一种是散在于白色脂肪组织中的米色(beige)脂肪细胞。
[0007]UCPl的表达是棕色脂肪的主要标志，对白色脂肪棕色化来说也是一个重要的特征。早前的研究已经发现UCPl的表达调控主要是在转录水平。所以理解UCPl的转录调控对理解白色脂肪棕色化过程有极重要的意义。UCPl基因的5’区域内发现了若干转录因子的结合位点，包括C/ΕΒΡ调控位点，cAMP反应元件,及一些核受体的结合位点，如PPAR,维甲酸受体(RAR)，和甲状腺受体(TR)。这些基因调控元件及与其结合的转录复合物组成了 UCPl转录调控的核心。目前仅发现数个重要基因参与米色脂肪的诱导分化，如PRDM16、RB1、C0X2、CRTC3、IRIS等，因此，发现并证实新的参与这一过程的基因可以为治疗肥胖及代谢综合征提供新的药物作用靶点。
【发明内容】
[0008]本发明旨在提 供LGR4基因的新用途。
[0009]本发明的技术方案为，将LGR4基因作为分子靶点或药物作用靶点，用于筛选或制备促进白色脂肪棕色化的药物方面的应用。
[0010]LGR4系G蛋白偶联受体(GPCR)家族成员，位于染色体11ρ14区段，全长约106Kb，含18个外显子，编码951个氨基酸，其中胞外548个氨基酸残基，富含亮氨酸，有5个糖基化位点，又属于糖蛋白激素受体。近年研究将糖蛋白激素受体分为三类:第一类为经典糖蛋白激素受体，包括 FSHR (LGRl),LHR (LGR2)、TSHR (LGR3);第二类包括 LGR4、LGR5 和 LGR6，目前对这类受体的功能所知甚少；第三类包括LGR7(relaxin/insulin_like family peptiderec印torl，RXFP1)和LGR8 (RXFP2)。前期研究认为糖蛋白激素受体类的主要功能参与机体发育和生殖功能，但是最近几年随着干细胞及相关领域的不断进展，对LGR4-6的认识亦日益深入全面。研究表明，LGR4可通过cAMP/PKA通路调控下游基因Atf4表达从而参与骨形成与重建；另外，LGR4敲除后下调靶基因Pitx2的表达，导致小鼠眼前段发育不良；LGR4还可通过激活Gs亚单位，增加细胞内cAMP水平，激活PKA信号通路，从而调控雌激素受体(ER)表达，进而参与附睾和曲细精管的发育。
[0011]本发明建立Lgr4基因敲除的小鼠模型，通过表型观察我们发现Lgr4基因突变小鼠体重明显减轻，糖耐量改善，代谢水平提高，并能抵抗高脂饮食诱导的肥胖和遗传性肥胖。进一步研究表明Lgr4基因突变小鼠能量消耗明显增加，并且体脂含量及白色脂肪组织重量显著减少。而且Lgr4基因突变小鼠白色脂肪细胞表现出一些典型的棕色脂肪细胞的特征，比如线粒体数目大量增加、细胞内的脂滴变得小而且多、表达棕色脂肪细胞标志物UCP1，这些结果提示白色脂肪组织出现棕色脂肪样改变；体外研究也表明LGR4功能缺失的原代白色脂肪前体细胞(SVF)向棕色脂肪分化能力大大加强。
[0012]通过筛选包括Prdml6，Rb，WntlOb等影响棕色脂肪发育的基因表达量的变化，发现Rb基因表达明显降低，并通过进一步实验证明LGR4可通过cAMP/PKA信号通路调控RB表达，从而导致了 Lgr4基因敲除之后白色脂肪向棕色脂肪(米色脂肪)分化。从体内、体外两个水平证明LGR4参与白色脂肪棕色化及能量代谢的作用、LGR4对Rb基因的表达调控机制，从而找到白色脂肪棕色化的分子机制。
[0013]同时，本发明发现了人LGR4基因与人类肥胖的相关性，并且根据LGR4基因与白色脂肪棕色化的关系，开发基因的新功能，将该基因作为分子靶点和药物研发靶点，用于筛选和制备促进白色脂肪棕色化(白色脂肪分化为米色脂肪即棕色脂肪的一种)的药物，这些药物可促进白色脂肪分化，提高代谢水平，增加能量消耗，降低体内脂肪，具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为正常饮食下LGR4基因突变小鼠(m/m)与野生型小鼠(WT)体重、体脂与实体组织含量及附睾旁白色脂肪(eWAT )、腹股沟白色脂肪(iWAT )和棕色脂肪(BAT )含量比较
[0015]图2为正常饮食下LGR4基因突变小鼠(m/m)与野生型小鼠(WT)代谢指标的比较(A为40周龄时血糖水平，B为不同禁食时间的空腹血糖水平，C为血清总胆固醇水平、D为血清总甘油三脂水平，E为葡萄糖耐量，F为胰岛素敏感性，G为血清胰岛素水平
[0016]图3为高脂饮食下LGR4基因突变小鼠(m/m)的代谢水平
[0017]图4为LGR4基因突变小鼠(m/m)的摄入能量和消耗能量代谢水平研究
[0018]图5为LGR4基因突变小鼠(m/m)的棕色脂肪代谢活性。
[0019]图6为LGR4基因突变小鼠(m/m)白色脂肪组织出现棕色脂肪组织特性
[0020]图7为LGR4基因突变小鼠(m/m)的SVF细胞体外诱导分化为米色脂肪细胞
[0021]图8为LGR4基因缺失对Rb基因表达的影响
[0022]图9为实施例3中，LGR4基因与人类肥胖的相关性
【具体实施方式】
[0023]实施例1建立LGR4基因敲除小鼠
[0024]Lgr4杂合小鼠同C57BL/6小鼠回交至少6代，获得C57BL/6背景的Lgr4杂合小鼠。这些Lgr4杂合小鼠交配得到的子代Lgr4基因纯合突变小鼠用于实验，其同窝的野生型小鼠用于对照。Lgr4杂合小鼠同ob小鼠交配得到的小鼠记为F2，F2代小鼠杂交得到的后代中Lgr4和L印tin双突变小鼠用于实验，同窝野生型用于对照。三月龄雄鼠和雌鼠按1:1和1:2比例合笼交配。三周幼鼠离乳、标记、分笼、基因型鉴定。
[0025]小鼠基因型鉴定(小鼠LGR4GenBank accession n0.NM_172671.2):
[0026](I)取2-3周龄小鼠，用剪刀取其耳缘组织一块，移入1.5ml离心管并标记，提取DNA ；[0027](2)0嫩模板口2“1
[0028]引物Α4μ1
[0029]引物Β2μ1
[0030]引物C2yl
[0031]dNTP(10mmol/l)0.2μ I 口
[0032]Taq DNA □酶 0.4 μ I
[0033]10 X PCR buffer □(含 Mg2+) 2 μ I，去离子水定容至 20 μ I。
[0034]96孔PCR反应板中加入上述混合液后离心数秒，每孔加石蜡油一滴。PCR反应在Eppendorf Mastercycle Gradient PCR热循环仪上进行。PCR扩增条件为:94度3分钟；94度30秒，60度45秒，72度I分钟，25-30个循环；72度10分钟。然后于4摄氏度保存。引物A和B扩增片段大小预计1Kb，引物A和C扩增片段大小预计750bp。所用引物序列如下:
[0035]□引物 A 上游:5' GTC ACC ACT CTT ACA CAA TGG3’
[0036]□引物 B 下游:5' CTT TGA GCA CCA GAG GAC3’
[0037]□引物 C 下游:5’ATT CCC GTA GGA GAT AGC3’PCR 产物 10 μ I 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色。用DL2 000标记鉴定。
[0038]实施例2
[0039]饲养条件:小鼠饲养于清洁级条件下，饲养密度为5只每笼，在标准小鼠笼中按以下条件分笼喂养:标准商业小鼠饲料(4.5%脂肪，4.0%纤维素，21.0%蛋白质、1.404千卡/克)，高脂喂养饲料购于Research Diet (60.0%脂肪)，根据每只小鼠摄食量隔日更换饲料，保证饲料的新鲜性。室温20-22摄氏度，自由摄食和饮水，稳定的人工光照周期(6:00到18:00光照，18:00到6:00黑暗)。小鼠每周称重，按基因型分别绘制体重曲线。
[0040]取4月龄Lgr4基因突变小鼠及野生型小鼠，每组10只，取材前一天下午于17点撤去各组动物的饲料，使动物禁食16小时，于9点使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉显效后，使其仰卧位，消毒腹部皮肤，迅速从腹部正中线处剪开腹腔、至胸腔，充分暴露心脏。用Iml的注射器，刺入左心室，进行采血，采血约0.6-0.8ml，放入EP管中，室温放置2_4小时后，在低温离心机上用4摄氏度3000转每分钟的条件离心10分钟。以100 μ I/管进行分装血清，之后置于-80摄氏度冰箱备用；采血完毕后，快速剪取肝脏、附睾脂肪、股四头肌、腓肠肌、比目鱼肌等组织，并在液氮中预冷，之后放于液氮或-80摄氏度冰箱备用。
[0041]结果:
[0042]一、结果显示，雄性及雌性Lgr4基因突变小鼠(Lgr4m/m小鼠，用m/m表示)在正常饮食条件下体重和体脂含量明显低于同窝的野生型小鼠(WT)(如图1A)，但实体组织(leanmass)含量(lean mass/body weight)反而稍高于同窝野生型对照小鼠(如图1A和B)。为明确不同部位的脂肪对体脂变化量的贡献，称量不同部位脂肪垫的重量发现，与野生型小鼠相比，Lgr4m/m小鼠的附睾旁(effAT )与腹股沟白色脂肪(iffAT )均明显下降，但是棕色脂肪含量并未发生改变，如图1C。
[0043]二、Lgr4基因突变小鼠(Lgr4m/m小鼠)在正常饮食条件下的代谢指标改善8周龄的Lgr4m/m小鼠的血糖水平低于同窝野生型对照，只是差异并没有达到统计学意义上的显著性。但是随着小鼠年龄的增加，Lgr4m/m小鼠的血糖增长速度慢于野生型对照小鼠，到40周龄时，雄性及雌性Lgr4m/m小鼠和野生型小鼠的血糖水平出现了显著性的差异(图2A)。
[0044]在长时间禁食实验中小鼠血糖水平的变化，进而发现，在长达48小时的禁食实验中，随着禁食时间延长，Lgr4m/m小鼠的空腹血糖水平下降速度较野生型小鼠也快很多(图2B)。在血清学水平，我们同时还发现Lgr4m/m小鼠的血清总胆固醇水平相对于同窝野生型对照也有下降(图2C)，但是血清总甘油三脂水平没有明显的改变(图2D)
[0045]通过腹腔葡萄糖耐量试验(Intraperitonealglucose tolerancetest，IPGTT)发现相对于同窝的野生型对照，Lgr4m/m小鼠葡萄糖耐量有明显改善(图2E)。糖耐量的改善一般伴随着胰岛素敏感性的改善，所以我们测定了两组小鼠的胰岛素敏感性(ITT)。并没有发现这两组小鼠的胰岛素敏感性有明显的差异(图2F)，和这个结果相一致的是，我们发现两组小鼠的血清胰岛素水平也无差异(图2G)。综合来看，正常饮食条件下Lgr4m/m小鼠的代谢指标出现了改善。
[0046]三、Lgr4基因突变能抵抗高脂饮食诱导的肥胖和遗传性肥胖
[0047]通过上面的实验，我们发现了在正常饮食条件下Lgr4m/m小鼠的体重减轻，体脂含量降低，并且代谢指标改善。在接下来的高脂饮食诱导小鼠肥胖模型与L印tin基因突变(ob/ob)小鼠肥胖模型中，我们发现Lgr4基因的缺失能够抵抗肥胖发生。，无论雄性还是雌性Lgr4m/m小鼠，在高脂饮食喂养16周的过程中，其体重均明显低于同窝对照组小鼠。同时，Lgr4m/m小鼠在高脂饮食下的代谢指标也有明显的改善，通过IPGTT实验，我们发现Lgr4m/m小鼠的葡萄糖耐量明显的改善(图3A)。我们还发现，不同于在正常饮食条件下Lgr4m/m小鼠的胰岛素敏感性相对野生型对照没有改善的情况，在高脂饮食条件下，Lgr4m/m小鼠的胰岛素敏感性相对野生型对照有明显的改善(图3B)。Lgr4m/m小鼠在高脂饮食下的空腹血糖水平(图3C)和胰岛素水平(图 3D)也显著降低。同脂肪减少的表型一致，我们同时发现了高脂饮食条件下Lgr4m/m小鼠的脂肪因子I印tin的水平显著下降(图3E)。通常情况下，高脂饮食会引起小鼠白色脂肪组织的炎症反应，通过检测巨噬细胞标志物CD68与F4/80的在白色脂肪组织的表达量，发现高脂饮食条件下Lgr4m/m小鼠的白色脂肪组织中这两个基因的表达量相对于对照组呈明显降低趋势(图3F和G)，这意味着Lgr4的缺失使得高脂饮食诱导的炎症反应有所减缓。上述实验结果表明，Lgr4基因突变能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖及肥胖引起的代谢危害。
[0048]通过Lgr4基因突变模型小鼠同ob小鼠模型的杂交建立了 Lgr4;Leptin (Lgr4m/m; ob/ob)双基因突变小鼠模型。通过这个双基因突变小鼠模型，我们发现Lgr4基因突变能够明显逆转Leptin缺失导致的遗传性肥胖:从外型上看,Lgr4;Leptin (LGR4m/m;ob/ob)双基因突变小鼠明显比ob小鼠瘦，从体重上看，Lgr4基因突变使ob小鼠的体重显著下降了43% (图3H)，也使得ob小鼠的脂肪含量明显的降低(图31)。这些结果再次确认了 LGR4在肥胖发生中的作用。综上所述，Lgr4基因突变能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖与基因突变引起的遗传性肥胖。
[0049]四、Lgr4m/m小鼠能量代谢率提高
[0050]小鼠的体重和脂肪含量主要取决于通过食物摄取的能量与机体消耗的能量之间的平衡关系，所以说摄食量与能量消耗量是影响体重与体脂堆积的两个主要因素。所以，如果小鼠体重降低，原因很可能是小鼠摄食量降低，或者小鼠的能量消耗量增加，或者两者兼而有之。[0051]首先测量了 Lgr4m/m小鼠的进食量，发现Lgr4m/m小鼠的体重下降并非是由于食欲下降，相反的，相对于同窝的野生型对照小鼠，Lgr4m/m小鼠的摄食量反而是增加的(图4A)。因为并不是所有被摄入的食物都会被吸收并转化为能量存储起来，通过测定小鼠粪便中甘油三脂的含量，发现两组小鼠的24h粪便甘油三酯含量无明显差异(图4B)，排除Lgr4m/m小鼠存在营养吸收障碍的可能性，这证明了 Lgr4m/m小鼠虽然体重比较低，但是相对对照组小鼠的确也摄入了更多的能量。
[0052]按体重比例给予两组小鼠相同量的食物喂养10天后比较两组体重改变情况，发现相对于对照组小鼠，Lgr4m/m小鼠出现了明显的体重下降(图4C)，说明能量摄入问题不是造成Lgr4m/m小鼠抵抗肥胖的主要因素，进一步确证了 Lgr4缺失对于体重改变的重要影响，同时也提示了 Lgr4m/m小鼠存在明显的能量消耗增加。 [0053]能量消耗的增加可能是小鼠活动度的增加或者能量代谢率的提高的结果。测量了两组小鼠的活动度，发现Lgr4m/m小鼠相对于对照组并没有出现明显的活动度增加。对小鼠进行了代谢笼实验测量小鼠能量代谢率的改变，观察其能量消耗指标。与预期一致的是，Lgr4m/m小鼠的24小时能量消耗量明显增加。为了得出更准确的结论，我们对实验结果进行协方差分析(analysis of covariance, ANCOVA),统计分析结果进一步证实Lgr4m/m小鼠确实能量消耗量明显增加。我们同时也发现Lgr4m/m小鼠的24小时氧气消耗量和二氧化碳呼出量均明显增加(图4D和E)，这与之前能量消耗的实验结果一致。相应的，Lgr4m/m小鼠体温亦高于对照组小鼠(图4F)，表明Lgr4m/m小鼠能量消耗率增加，代谢增强。
[0054]五、Lgr4m/m小鼠棕色脂肪代谢活性没有改变
[0055]棕色脂肪组织是一个功能高度特异性的组织，它的主要功能就是消耗能量物质(如甘油三脂、葡萄糖等)来大量产热。
[0056]观察到LGR4功能缺失可通过提高能量消耗率抵抗肥胖，首先考虑是否为棕色脂肪数量或者活性提高的结果，对棕色脂肪组织的代谢活性进行系统观察来分析。
[0057]与对照组相比，Lgr4m/m小鼠棕色脂肪含量其棕色脂肪的含量并没有变化，见图1C。接下来通过HE染色和电镜观察(图5A)分析了棕色脂肪的组织学形态，也没有在两组之间发现明显的变化。利用PET-CT直接测定了 Lgr4m/m小鼠肩胛区棕色脂肪活性，发现与对照组相比也无明显差异
[0058]棕色脂肪的产热功能主要依赖于其所含的丰富的线粒体，通过检测线粒体DNA量和基因组DNA量之间的比值检测了 Lgr4m/m小鼠棕色脂肪线粒体的相对数目，结果没有发现明显改变(图5B，16s rRNA/己糖激酶2水平16s rRNA/Hexo、细胞色素B-磷酸甘油酯脱氢酶cytb/GAPDH水平)。同时检测了同棕色脂肪组织产热相关的基因在正常饮食条件和高脂饮食喂养条件下的蛋白表达水平,如 UPCl，UCP2, UCP3, PGC1-a, CPT-2, NRF-1, COX-3, C0X-4等，均未发现有明显的差异。这些实验结果都表明，Lgr4m/m小鼠的高代谢率表型并不是因为其棕色脂肪组织代谢活性的升高引起的。
[0059]六、Lgr4m/m小鼠白色脂肪组织出现明显的棕色脂肪组织特性
[0060]很多研究结果都提示在传统白色脂肪部位可能会出现棕色化现象，这些棕色化的细胞同真正的棕色脂肪细胞功能相近，能够增加机体的能量代谢率，称之为米色脂肪。
[0061]检测Lgr4m/m小鼠白色脂肪的表型，从外观上来看，相对于野生型小鼠的白色脂肪组织，Lgr4m/m小鼠的白色脂肪组织体积明显的缩小，而且脂肪组织不再是传统的象牙白色，而是一种介于正常白色脂肪象牙白色同正常棕色脂肪的棕褐色之间的一种米黄色(图6A)，这种米黄色正是先前报道中在白色脂肪中发现的米色脂肪典型颜色。
[0062]进而观察这些脂肪组织的显微结构，HE染色显示，Lgr4m/m小鼠的白色脂肪细胞体积也明显缩小，脂滴变少，细胞实质增加(图6B)。在电镜下观察，发现Lgr4m/m小鼠的脂肪细胞，细胞内充实着多个大小不一的脂肪滴以及大量的线粒体，更类似于棕色脂肪细胞而不是传统的白色脂肪细胞(图6C)。Lgr4m/m小鼠的白色脂肪细胞这种形态学上向棕色脂肪细胞的转化在腹腔注射3 -肾上腺素能信号通路激动剂(IS0，异丙肾上腺素)与冷冻刺激下变化更加明显(图6D )，而这两种方法是刺激棕色脂肪代谢活性的主要方式。
[0063]与上述改变相吻合，在基因表达水平上我们通过免疫荧光发现Lgr4m/m小鼠附睾旁白色脂肪组织出现了棕色脂肪特异性蛋白解偶联蛋白UCPl的大量表达。而且，不论是从mRNA水平，还是从蛋白表达水平上Ucpl同其它产热相关基因，如？8(3-10、以(16&工7如C、Cpt2、Nrfl等，在冷冻刺激(用CR表示)或ISO连续腹腔注射下表达均明显高于正常对照小鼠(用NC表示)(图6E)。腹股沟脂肪在冷冻刺激性下也出现了类似附睾旁脂肪的向棕色脂肪样细胞的转变。此外，在高脂饮食情况下，Lgr4m/m小鼠的附睾旁白色脂肪也出现了类似的明显的基因表达改变。
[0064]甲状腺激素、肾上腺素或去甲肾上腺素等激素也能够提高机体的能量代谢率，为了排除Lgr4基因突变小鼠激素代谢出现异常的可能，检测了上述激素的变化。发现Lgr4m/m小鼠体内的上述激素并没有出现增加，因此白色脂肪组织中出现的散在的棕色脂肪样改变并非由于这些激素水平异常所致。
[0065]这些结果表明，Lgr4基因的缺失促进了白色脂肪组织棕色化改变，这些米色脂肪和棕色细胞一样可以消耗能量，从而提高了机体的基础代谢率。这也是Lgr4m/m小鼠体重减轻并且可以抵抗肥胖的原因所在。
[0066]七、Lgr4基因的缺失促进白色脂肪组织血管基质成分(SVF)向棕色脂肪方向分化
[0067]在之前的关于白色脂肪棕色化的研究中发现，白色脂肪中出现的散在米色脂肪细胞起源于白色脂肪组织血管基质成分(SVF)。为了进一步排除Lgr4m/m小鼠的高代谢表型是由于Lgr4全身突变造成机体的一个非特异的代偿性改变的可能性，分离出了 Lgr4m/m及其野生型对照小鼠的原代SVF细胞，并在体外诱导其向棕色脂肪方向分化。结果发现，野生型附睾旁白色脂肪组织来源的SVF向棕色脂肪的分化能力很弱；但同时也却发现Lgr4m/m小鼠附睾旁白色脂肪组织来源的SVF表现出了非常强的向棕色脂肪分化的潜能。油红染色显示Lgr4m/m小鼠的SVF在诱导之后相对于对照组生成大量的脂肪细胞。
[0068]为了确定这些诱导分化完成后的细胞是否为类似棕色脂肪的米色脂肪细胞，我们检测了诱导分化完成后的细胞的特征基因的表达情况，发现Lgr4m/m来源的终末分化脂肪细胞的棕色脂肪高表达基因Ucpl、Pgc-1 a和Dio2的mRNA表达水平相比对照组也明显增加(图7A)。棕色脂肪的另一个重要特征是可以在cAMP或者(6-肾上腺素受体激动剂的刺激下大量表达产热相关的基因。我们也确实发现了 Lgr4m/m来源的终末分化脂肪细胞的产热相关基因表达对cAMP的反应性也更强(图7A，用cAMP处理或不处理的野生型与Lgr4m/m型小鼠SVF细胞中mRNA相对表达量)。我们在野生型白色脂肪组织SVF中用shRNA沉默了Lgr4基因的表达之后，也发现了类似的基因表达模式(图7B)。在ISO处理后小鼠10天后再分离的白色脂肪组织SVF中，我们也观察到产热相关的基因表达水平上调的现象。这些数据说明Lgr4m/m来源的终末分化脂肪细胞在基因表达方面类似于棕色脂肪细胞。
[0069]棕色脂肪主要的功能是就通过UCPl解偶联氧化磷酸化产生的质子梯度来产热，所以我们接下来测量了终末分化脂肪细胞的耗氧能力。我们发现在基础状态下，Lgr4m/m来源的终末分化脂肪细胞的耗氧率(Oxygen Comsuption Rate, OCR)比对照组高。在加入了寡霉素后，ATP的合成被抑制，此时的耗氧率代表的是与细胞的产热功能成正比的解偶联呼吸(Uncoupled Respiration)。Lgr4m/m来源的终末分化脂肪细胞的解偶联呼吸也比对照组强，这说明Lgr4m/m来源的诱导产生的脂肪细胞在功能方面更类似于棕色脂肪细胞。这些结果表明我们诱导出来的脂肪细胞确实是类棕色脂肪的米色脂肪细胞，Lgr4基因的缺失能够原发性地促进附睾旁白色脂肪细胞SVF向棕色脂肪方向分化。
[0070]八、Lgr4基因的缺失导致Rb基因表达下降
[0071]为了进一步探明Lgr4基因的缺失促进小鼠白色脂肪组织向棕色脂肪样组织转化的分子机制，我们在接下来的实验中筛查了 Lgr4基因的缺失对参与调节白色脂肪组织棕色化的关键基因表达水平的影响(图8A)。我们发现在正常条件下，Lgr4m/m小鼠附睾旁白色脂肪组织的Rb基因在所有我们筛查的基因中表达水平的变化最为明显，下调了 50.0% (图8A)。而且无论是在mRNA水平上还是蛋白表达水平上Rb基因的表达水平下调在冷冻与ISO刺激条件下表现的更为明显(图SB)。前期的研究已经证明Rb在脂肪细胞命运决定中的作用，在Rb杂合缺失的小鼠模型中，Rb的单倍体剂量不足能够增加小鼠机体能量消耗，造成体重下降。基于这一结论，我们认为Rb表达下调发原因是Lgr4基因的缺失造成白色脂肪棕色化改变的分子靶点。Lgr4基因缺失导致Rb基因表达下降，是Lgr4m/Vj、鼠白色脂肪组织棕色化的原因之一.[0072]为了证明LGR4对Rb的直接表达调控。我们在间充质干细胞系C3H10T1/2中用shRNA下调了 Lgr4基因的表达，然后发现LGR4表达量的下降会造成Rb基因的mRNA水平明显下调(图8C，LV为野生型 ，shLgr4-l、shLgr4_2为控制论LGR4表达的细胞)。随后，我们又用荧光素酶报告基因系统检测了 LGR4对Rb基因启动子区域活性的影响。我们发现，LGR4过表达能够明显增加Rb启动子区的转录活性(图8D)。
[0073]已经有研究表明，做为一种G蛋白偶联受体，LGR4可以通过cAMP_PKA_CREB信号通路调节其下游基因的表达，同时还有研究结果表明小鼠Rb基因的启动子区域也存在一个功能性的cAMP反应元件(CRE)。因此可推测，LGR4通过结合Rb基因启动子区域的CRE反应元件来调控Rb基因的表达。当Rb基因含有CRE的启动子区域缺失或者CRE位点被突变之后，LGR4过表达对Rb启动子活性的增强效果就消失了。如果用一种cAMP信号通路的抑制剂H89来处理细胞，我也发现了 LGR4过表达对Rb启动子活性的影响减弱。不仅如此，在Lgr4基因突变小鼠的胚胎成纤维原代细胞中发现，Lgr4基因的缺失会造成Rb启动子CRE元件上结合的P-CREB明显减少。此外，我们还对野生型与ob/ob肥胖小鼠皮下脂肪组织中Lgr4和Rb基因的mRNA水平进行线性回归分析，发现Rb的表达水平随Lgr4表达的增加而增加，这种正相关性具有明显的统计学意义。
[0074]接下来我们研究了 Rb的过表达能否逆转Lgr4基因的缺失造成的表型。我们在Lgr4m/m来源的SVF细胞中用慢病毒重新过表达Rb或者Lgr4后诱导细胞向棕色脂肪方向分化，诱导完成之后检测了细胞Ucpl，Dio2, c/ebp α和Ppar y 2等在棕色脂肪中高表达的基因的表达水平。发现Rb的过表达，的确可以逆转Lgr4基因的缺失造成的这些基因的高表达，下调的程度接近于Lgr4的重新表达所引起的下调程度。我们还测定了这些终末分化的脂肪细胞的耗氧率，发现Rb的过表达可以逆转Lgr4基因的缺失造成的基础状态耗氧率和解偶联耗氧率的上升。并且Rb过表达降低耗氧率的程度和Lgr4过表达降低耗氧率的程度相当。重新过表达Rb的实验结果表明了 Rb的过表达可以逆转Lgr4突变所造成的基因表达和功能的改变。说明在这个信号通路中，Rb处于Lgr4的下游。
[0075]综上所述，我们发现LGR4可以直接调控Rb基因的表达，Lgr4基因缺失造成的白色脂肪棕色化是部分通过下调Rb基因的表达量来实现的。是Lgr4m/m小鼠白色脂肪组织棕色化的原因之一
[0076]实施例3
[0077]中国东部地区招募了 619名青少年肥胖患者(BMI大于30kg/m2;年龄在14_30岁之间)和620名性别、年龄匹配的正常健康个体(BMI在18.5kg/m2到23.0kg/m2之间)。
[0078]根据Hap Map 中国汉族人群数据库(data release27/phase II+III, Feb2009, onNational Center for Biotechnology Information B36assembly), 位于 LGR4 基因编码区及两侧非编码区的最小等位基因频率(MAF) >0.05的常见多态性位点有62个， 用 Haploview (Version4.1, http: //www.broad, mit.edu/mpg/haploview/)中的standard pairwise method in Tagger方法,我们选择了其中的21个SNP作为标签SNP(tSNPs;r2threshold=0.8, limit of detection of3.0)。SNP 基因分型使用的是 iPLEXchemistry 的 matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometer(Sequenom)系统。数据分析由不知道标本信息的实验人员使用MassARRAYTyper4.0软件进行分析。
[0079]tSNP和BMI的关联性是在PLINK1.07软件中使用线性回归模型进行分析。LGR4变异(A750T)在肥胖患者和正常对照人群中差异的显著性用卡方检验进行分析。。结果我们发现有4个SNP位点与BMI明显相关(p=0.011-0.048)。
[0080]在这些标签SNP中，有两个与BMI的相关性接近统计学意义的SNP (rs2447995和rsl531557)被Lgr4最后一个外显子(18号外显子)包含。Lgr4的这个外显子编码G蛋白偶联受体的七次跨膜区域，在进化上与其它LGR家族成员，如LHR/LGR1、FSHR/LGR2、TSHR/LGR3，保持高度同源性。因此，在这个研究中的患者及扩大的对照人群中进行了第18号外显子测序。非常有意思的是，我们发现了 Lgr4的一个低频氨基酸错义变异(A750T)在肥胖人群中明显聚集，比例为2.68%，而在正常对照组仅为1.15% (P=0.035)。
[0081]这个位点在不同种属及各个LGR家族成员中高度保守，类似的激活型点突变已在LHR,TSHR和FSHR中被发现。所以我们利用荧光素酶报告基因系统检测了 A750T突变形式的LGR4对CRE的作用，我们发现A750T突变体对CRE报告基因的激活作用明显强于野生型LGR4 (图9A)，这个结果表明在LGR4的A750T突变形式也是一个有功能的激活性变异。
[0082]此外，我们还检测了肥胖患者与正常对照人群内脏及皮下脂肪中Lgr4的表达水平，结果发现肥胖患者Lgr4的表达水平明显高于正常对照组(图9B和C)。前期针对肥胖人群的GWAs与双生子队列研究结果曾提示Lgr4基因附近的位点与肥胖发生明显相关(53，54)，而我们的结果无疑将这一联系直接定位在Lgr4基因本身。因此认为LGR4参与人类肥胖的发生过程。
[0083]根据上述结果，LGR4基因(Human LGR4GenBank Accession N0.NP_060960)参与人类肥胖发生过程，与肥胖有关联性。LGR4基因缺失突变可提高能量代谢率，抵抗肥胖，可作为一个药物靶点，用于筛选或制备促进白色脂肪棕色化的药物，筛选能够提高代谢水平，增加能量消耗，降低体重 和脂肪含量的药物。
【权利要求】
1.LGR4基因在筛选促进白色脂肪棕色化的药物方面的应用。
2.LGR4基因在制备促进白色脂肪棕色化的药物方面的应用。
3.LGR4基因在制备或筛选提高代谢水平的药物方面的应用。
4.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的LGR4基因是人或小鼠的LGR4基因。
【文档编号】A61K49/00GK103638531SQ201310301005
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】宁光, 王峰, 王计秋, 李小英, 叶蕾 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院