专利名称：检测β3肾上腺素受体突变基因的方法及用于该方法的核酸探针和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测β3肾上腺素能受体突变基因的方法，以及用于该方法的核酸探针和试剂盒。
背景技术：
β3肾上腺素能受体(B3AR)在白色脂肪细胞的脂解和棕色脂肪细胞的热生成方面起着主要的作用。据说B3AR氨基酸序列64-位色氨酸替换为精氨酸(Trp64Arg)这一突变的存在可使安静状态代谢量降低200kcal，并与腹部脂肪型肥胖和胰岛素抵抗相关联。
如果导致B3AR中Trp64Arg突变(也称为“B3AR Trp64Arg突变”)的突变存在，就会在突变位置形成限制酶识别位点。因此，可用如下方法检测突变用PCR扩增DNA以便包括突变位置的部分能被扩增，用限制酶消化扩增产物并用电泳确定DNA是否被消化(PCR-RFLP)(例如参见Japanese Journal of Clinical Pathology，vol.44，8，pp.778-782，1996)。
由于PCR扩增了几个分子的模板几十亿次，所以即使痕量的污染物也可能导致假阳性或假阴性结果。在PCR-RFLP中，PCR之后扩增产物需要收集并进行限制酶处理，故扩增产物可能污染随后的反应系统。因此，可能获得假阳性或假阴性结果。
此外，PCR结束后用限制酶处理DNA，然后进行电泳。因此检测所需的时间变得非常长。此外，因为程序复杂，很难自动化。
更进一步地，用PCR扩增包含突变的区域、然后用荧光染料标记的核酸探针进行解链曲线分析、在解链曲线分析结果的基础上进行突变分析，这样的方法是公知的(Clinical Chemistry，vol.46，5，pp.631-635，2000；日本专利申请公开号(Kokai)No.2002-119291)。
发明公开本发明的一个目的是鉴别一种有效检测B3AR Trp64Arg突变的淬灭探针，从而提供一种检测B3AR Trp64Arg突变的方法以及用于该方法的试剂盒。
有关使用探针的上述方法的文献仅仅教导了关于探针的设计，探针应当设计为当具有荧光染料末端标记的淬灭探针与靶核酸杂交时，探针-核酸杂交体的两个或更多核苷酸对应该在末端部分形成至少一个G-C对。对于B3AR Trp64Arg突变，本发明的发明人设计了满足上述条件的淬灭探针并尝试了检测。然而，不容易获得能够检测的淬灭探针。
本发明的发明人发现，基于包含B3AR Trp64Arg突变的特定区域设计淬灭探针，通过使用淬灭探针的解链曲线分析能够检测B3ARTrp64Arg突变。
本发明提供以下内容。
(1)一种核酸探针，其末端用荧光染料标记，其中荧光染料的荧光随杂交而减少，其中所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
(2)根据(1)所述的核酸探针，其中核酸探针具有SEQ ID NOS8-12的任一核苷酸序列。
(3)一种检测突变的方法，包括使用荧光染料标记的核酸探针并测定荧光染料的荧光而对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析，并在解链曲线分析结果的基础上检测突变，其中单核苷酸多态性是编码β3肾上腺素能受体的核酸的核苷酸序列的一个突变，该突变导致β3肾上腺素能受体氨基酸序列64-位色氨酸被精氨酸替换的突变，并且所述核酸探针是如(1)或(2)中所定义的核酸探针。
(4)根据(3)所述的方法，其中包含在样品中的核酸中的含有单核苷酸多态性位点的区域被扩增以获得显示单核苷酸多态性的核酸。
(5)根据(4)所述的方法，其中通过使用DNA聚合酶的方法进行扩增。
(6)根据(5)所述的方法，其中在核酸探针存在时进行扩增。
(7)用于如(3)中所定义方法的试剂盒，其包括一种末端用荧光染料标记的核酸探针，其中荧光染料的荧光随杂交而减少，所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
(8)根据(7)所述的试剂盒，其中核酸探针具有SEQ ID NOS8-12的任一核苷酸序列。
(9)根据(7)或(8)所述的试剂盒，其进一步包括引物，用于扩增包含编码β3肾上腺素能受体的核酸中核苷酸序列中的突变的区域，所述突变导致β3肾上腺素能受体氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替换的突变，所述扩增通过使用DNA聚合酶的方法进行。
附图的简单描述
图1显示不能鉴别突变的淬灭探针的位置。
图2显示能够鉴别突变的淬灭探针的位置。
图3显示实施例1的方法(使用探针5FL-wt-1-16)在基因组DNA的绝对量方面的灵敏度。
图4显示实施例1的方法(使用探针5FL-wt-1-16)的再现性。
图5显示实施例1的方法(使用探针3T-mt-2-20)在基因组DNA的绝对量方面的灵敏度。
图6显示实施例1的方法(使用3T-mt-2-20)的再现性。
实施本发明的最佳方式<1>本发明的探针和本发明的检测方法本发明的探针是一种末端用荧光染料标记的核酸探针，其中荧光染料的荧光随杂交而减少，所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ IDNO1的核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
本发明的探针可能与专利文献1描述的淬灭探针是相似的，除了它具有的核苷酸序列是从SEQ ID NO1的核苷酸序列(在B3ARTrp64Arg突变中具有野生型核苷酸的序列)的第183位核苷酸开始并具有8～30个核苷酸的长度，或者核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列(在B3AR Trp64Arg突变中具有突变型核苷酸的序列)的第196位核苷酸终止并具有7～30个核苷酸的长度。用于本发明的淬灭探针的核苷酸序列的例子包括SEQ ID NOS8～12的核苷酸序列。作为荧光染料，专利文献1中描述的那些都可以使用，其特定的例子包括FAM(商标)、TAMRA(商标)、BODIPY(商标)FL等等。荧光染料可以以常规方式结合到寡核苷酸上，例如通过专利文献1中描述的方法。
本发明的检测方法是用于检测突变的方法，其通过使用荧光染料标记的核酸探针并测定荧光染料的荧光而对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析，并在解链曲线分析结果的基础上检测突变，其特征在于单核苷酸多态性是B3AR Trp64Arg突变，并且核酸探针是本发明的探针。
本发明的检测方法可根据核酸扩增和解链曲线分析(Tm分析)的常规方法进行，不同之处是扩增的是包含编码B3AR的DNA中的B3AR Trp64Arg突变的区域，以及使用的是本发明的探针。
作为核酸扩增方法，优选使用聚合酶的方法，其例子包括PCR、ICAN、LAMP等等。当通过使用聚合酶的方法进行扩增时，优选在本发明的探针存在时进行扩增。扩增的反应条件和其他条件可由本领域技术人员根据使用的探针容易地调整。在该方法中，核酸扩增后只分析探针的Tm，因此反应结束后不必处理扩增产物。这样就没有污染扩增产物的危险。进一步地，因为检测是用扩增所需的同一设备进行的，甚至不必移动容器。因此该方法的自动化也是容易的。
作为例子，将在下面通过涉及使用PCR的方法进一步说明该方法。用于PCR的引物对可按照设计常规PCR引物对的同样方式进行设计，除了其要设计成应当能够扩增本发明的探针可杂交的区域。引物的长度和Tm通常分别是10-40聚体以及40-70℃，优选15-25聚体以及55-60℃。引物对中的引物可以长度不同。然而，引物的Tm值优选是基本相同的(差别通常在2℃之内)。Tm值是根据最邻近方法计算的值。引物对的例子包括一个引物对，其包括具有SEQ ID NO2和3的核苷酸序列的引物。
PCR优选在本发明的探针存在时进行。这使得能够在扩增反应结束后不用对扩增产物进行任何操作而分析Tm。引物的Tm值和PCR反应条件可由本领域技术人员根据使用的探针容易地调整。
PCR反应混合物的组成的代表性例子如下。
表1
进一步地，温度循环的代表性例子如下，该温度循环通常重复25～40次。
(1)变性90～98℃、1～60秒(2)退火60～70℃、10～60秒(3)延伸60～75℃、10～180秒当退火和延伸一步进行时，可以涉及例如60～70℃、10～180秒的条件。
Tm分析可以按常规方式进行，除了测定的是结合到本发明的探针上的荧光染料的荧光。荧光测定可以使用具有适合荧光染料的波长的激发光并测定发射波长的光强。Tm分析中的升温速度通常是0.1～1℃每秒。用于Tm分析的反应混合物的组成并不特别限定，只要探针和核酸能够互相杂交，所述核酸具有与探针核苷酸序列互补的序列。然而，单价阳离子的浓度通常是1.5～5mM，pH通常是7～9。因为使用DNA聚合酶的扩增方法例如PCR的反应混合物通常满足这些条件，扩增后的反应混合物本身能够用于Tm分析。
B3AR Trp64Arg突变的检测可以在常规方式Tm分析结果的基础上进行。本发明检测方法的检测不仅包括检测突变存在与否，而且还定量突变型DNA并确定野生型DNA与突变型DNA的比例。
<2>本发明的试剂盒本发明的试剂盒是用于本发明的第二种检测方法的试剂盒。该试剂盒的特征在于包括一种末端用荧光染料标记的核酸探针，其中荧光染料的荧光随杂交而减少(淬灭探针)，所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
对淬灭探针的说明见上述关于本发明的探针。
本发明的试剂盒除了淬灭探针，还可以包括本发明检测方法中核酸扩增所需的试剂，特别是用于采用DNA聚合酶进行的扩增的引物。
在本发明的试剂盒中，可以包括分开的淬灭探针、引物和其他试剂，或者其一部分可以作为混合物提供。
实施例将用下面的实施例对本发明进行更明确的说明。
实施例1在包含人B3AR基因Trp64Arg突变位点的核苷酸序列(SEQ IDNO1)的基础上设计表2所示引物，以便能够扩增包含Trp64Arg突变的区域。在表2中，位置是用SEQ ID NO1的核苷酸序列的核苷酸号表示的。
表2
然后设计表3所示的末端具有C的探针。在表3中，位置是用SEQID NO1的核苷酸序列的核苷酸号表示的。此外，核苷酸序列中的大写字母表示B3AR Trp64Arg突变位点，3’末端的(P)表示被磷酸化。探针用BODIPY(商标)FL或TAMRA(商标)按常规方式标记。
表3
PCR和Tm分析使用基因组DNA作为样品、用Smart CyclerSystem(Cephied)在如下所示条件下进行。Tm分析中的激发波长和检测波长分别是450～495nm和505～537nm(BODIPY FL)以及527～555nm和565～605nm(TAMRA)。
表4
表5反应条件50℃，2min↓95℃，2min↓95℃，1sec66℃，18sec(50个循环)↓Tm分析(1℃/sec)用每种探针进行PCR和Tm分析。结果，只有当用探针3T-mt-2-20、5FL-wt-1-20、5FL-wt-1-18、5FL-wt-1-16和5FL-wt-1-15时，才可观察到Tm分析中能够分析的荧光强度变化。探针相对于包含B3AR Trp64Arg突变的核苷酸序列的位置示于图1和2。图中所示野生型序列和突变型序列分别相当于SEQ ID NOS1和2的核苷酸序列中核苷酸号171～205。此外，图中的F表示荧光染料。基于图1和2所示位置，可以认为，探针能否用于Tm分析取决于结合荧光染料的C的位置，探针长度并非那么重要，只要其包括了多态性位点。
下面用探针5FL-wt-1-16检测在基因组DNA绝对量方面的灵敏度和再现性。
使用包含0、20、200和2000个拷贝的基因组DNA(野生型)样品重复上述方法。结果示于图3。从图3可见，其表明基因组DNA即使20个拷贝也可被检测到。
然后制备具有野生型序列的质粒(与上述质粒相同，除了核酸序列SEQ ID NO1的核苷酸285是A)。通过混合野生型质粒和突变型质粒制备十个样品(wt/mt)。对这些样品中的每一个以及只有野生型质粒的样品(wt/wt)和只有突变型质粒的样品(wt/wt)重复上述方法。结果示于图4。从图4可见，其表明该方法的再现性是极好的。
进一步地，用探针3T-mt-2-20而不是5FL-wt-1-16按类似方式检测在基因组DNA绝对量方面的灵敏度和再现性。结果示于图5和6。从图5和6可见，其表明灵敏度和再现性是极好的。
在图3～6中，纵轴代表荧光强度的基本导数的负值(-dF/dt)，横轴代表温度(℃)。
工业实用性按照本发明，提供了有效检测B3AR Trp64Arg突变的淬灭探针，以及进一步提供了用它和相应试剂盒检测B3AR Trp64Arg突变的方法。因为Tm分析是在几十秒内完成的，检测所需时间可显著减少。按照本发明优选的实施方案，其中在探针存在下核酸的扩增和Tm分析是组合的，在核酸扩增后只分析探针的Tm，因此不必在反应结束后处理扩增产物。这样，就没有污染扩增产物的危险。其次，因为检测可用扩增所需的同一设备进行，甚至不必移动容器。因此，该方法的自动化也是容易的。
序列表<110>Arkray，Inc.
<120>检测β3肾上腺素受体突变基因的方法及用于该方法的核酸探针和试剂盒<130>G867-OPC4054<150>JP 2003-114381<151>2003-04-18<160>12<210>1<211>1227<212>DNA<213>智人<220>
<221>等位基因<222>190<400>1atggctccgt ggcctcacga gaacagctct cttgccccat ggccggacct ccccaccctg60gcgcccaata ccgccaacac cagtgggctg ccaggggttc cgtgggaggc ggccctagcc120ggggccctgc tggcgctggc ggtgctggcc accgtgggag gcaacctgct ggtcatcgtg180gccatcgcct ggactccgag actccagacc atgaccaacg tgttcgtgac ttcgctggcc240gcagccgacc tggtgatggg actcctggtg gtgccgccgg cggccacctt ggcgctgact300ggccactggc cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga cgtgctgtgt360gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct ggctgtgacc420aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc tgtggtcctg480gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg gtggcgcgta540ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc cttcgcctcc600aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct tctcgtgatg660ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg gctacgcgcc agctgcgctt gctgcgcggg720gagctgggcc gctttccgcc cgaggagtct ccgccggcgc cgtcgcgctc tctggccccg780gccccggtgg ggacgtgcgc tccgcccgaa ggggtgcccg cctgcggccg gcggcccgcg840cgcctcctgc ctctccggga acaccgggcc ctgtgcacct tgggtctcat catgggcacc900ttcactctct gctggttgcc cttctttctg gccaacgtgc tgcgcgccct ggggggcccc960tctctagtcc cgggcccggc tttccttgcc ctgaactggc taggttatgc caattctgcc1020ttcaacccgc tcatctactg ccgcagcccg gactttcgca gcgccttccg ccgtcttctg1080
tgccgctgcg gccgtcgcct gcctccggag ccctgcgccg ccgcccgccc ggccctcttc1140ccctcgggcg ttcctgcggc ccggagcagc ccagcgcagc ccaggctttg ccaacggctc1200gacggggctt cttggggagt ttcttag1227<210>2<211>1227<212>DNA<213>智人<220>
<221>等位基因<222>190<400>2atggctccgt ggcctcacga gaacagctct cttgccccat ggccggacct ccccaccctg60gcgcccaata ccgccaacac cagtgggctg ccaggggttc cgtgggaggc ggccctagcc120ggggccctgc tggcgctggc ggtgctggcc accgtgggag gcaacctgct ggtcatcgtg180gccatcgccc ggactccgag actccagacc atgaccaacg tgttcgtgac ttcgctggcc240gcagccgacc tggtgatggg actcctggtg gtgccgccgg cggccacctt ggcgctgact300ggccactggc cgttgggcgc cactggctgc gagctgtgga cctcggtgga cgtgctgtgt360gtgaccgcca gcatcgaaac cctgtgcgcc ctggccgtgg accgctacct ggctgtgacc420aacccgctgc gttacggcgc actggtcacc aagcgctgcg cccggacagc tgtggtcctg480gtgtgggtcg tgtcggccgc ggtgtcgttt gcgcccatca tgagccagtg gtggcgcgta540ggggccgacg ccgaggcgca gcgctgccac tccaacccgc gctgctgtgc cttcgcctcc600aacatgccct acgtgctgct gtcctcctcc gtctccttct accttcctct tctcgtgatg660ctcttcgtct acgcgcgggt tttcgtggtg gctacgcgcc agctgcgctt gctgcgcggg720gagctgggcc gctttccgcc cgaggagtct ccgccggcgc cgtcgcgctc tctggccccg780gccccggtgg ggacgtgcgc tccgcccgaa ggggtgcccg cctgcggccg gcggcccgcg840cgcctcctgc ctctccggga acaccgggcc ctgtgcacct tgggtctcat catgggcacc900ttcactctct gctggttgcc cttctttctg gccaacgtgc tgcgcgccct ggggggcccc960tctctagtcc cgggcccggc tttccttgcc ctgaactggc taggttatgc caattctgcc1020ttcaacccgc tcatctactg ccgcagcccg gactttcgca gcgccttccg ccgtcttctg1080tgccgctgcg gccgtcgcct gcctccggag ccctgcgccg ccgcccgccc ggccctcttc1140ccctcgggcg ttcctgcggc ccggagcagc ccagcgcagc ccaggctttg ccaacggctc1200gacggggctt cttggggagt ttcttag1227<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3gccagcgaag tcacgaacac 20<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ggcgctggcg gtgc14<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>5ccatcgcccg gactcc 16<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>6ccatcgcccg gactccgag 19
<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>7gtcatcgtgg ccatcgccc 19<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>8cgtggccatc gcccggactc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>9catcgcctgg actccgagac 20<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>探针<400>10catcgcctgg actccgag18<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>11catcgcctgg actccg 16<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>12catcgcctgg actcc 1权利要求
1.一种核酸探针，其末端用荧光染料标记，其中荧光染料的荧光随杂交而减少，所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2所示核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
2.根据权利要求1所述的核酸探针，其中核酸探针具有SEQ IDNOS8-12的任一核苷酸序列。
3.一种检测突变的方法，包括使用荧光染料标记的核酸探针并测定荧光染料的荧光而对具有单核苷酸多态性位点的核酸进行解链曲线分析，并在解链曲线分析结果的基础上检测突变，其中单核苷酸多态性是编码β3肾上腺素能受体的核酸的核苷酸序列的一个突变，该突变导致β3肾上腺素能受体氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替换的突变，并且所述核酸探针是如权利要求1或2中所定义的核酸探针。
4.根据权利要求3所述的方法，其中包含在样品中的核酸中的含有单核苷酸多态性位点的区域被扩增以获得显示单核苷酸多态性的核酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过使用DNA聚合酶的方法进行扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在核酸探针存在时进行扩增。
7.用于如权利要求3中所定义方法的试剂盒，其包括一种末端用荧光染料标记的核酸探针，其中荧光染料的荧光随杂交而减少，所述核酸探针具有的核苷酸序列从SEQ ID NO1的核苷酸序列的第183位核苷酸开始、具有8～30个核苷酸的长度并且探针的5’末端用荧光染料标记，或者核酸探针具有的核苷酸序列在SEQ ID NO2的核苷酸序列的第196位核苷酸终止、具有7～30个核苷酸的长度并且探针的3’末端用荧光染料标记。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中核酸探针具有SEQ IDNOS8-12的任一核苷酸序列。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其进一步包括引物，用于扩增包含编码β3肾上腺素能受体的核酸中核苷酸序列中的突变的区域，所述突变导致β3肾上腺素能受体氨基酸序列64位色氨酸被精氨酸替换的突变，所述扩增通过使用DNA聚合酶的方法进行。
全文摘要
用PCR扩增核酸探针，所述探针中包含碱基序列突变的区域导致了β3肾上腺素受体氨基酸序列64－位的色氨酸被替换为精氨酸的突变(B3AR Trp64Arg突变)，所述探针的一端用荧光染料标记，并在杂交时显示出荧光染料的荧光减少。该探针具有的碱基序列从SEQ IDNO1所示碱基序列的183－位碱基开始、由8～30个碱基组成并在5’末端用荧光染料标记，或者其碱基序列在SEQ ID NO2所示碱基序列的196－位碱基终止、由7～30个碱基组成并在3’末端用荧光染料标记。使用该核酸探针测定荧光染料的荧光以进行解链曲线分析。基于解链曲线分析结果来检测突变。
文档编号G01N33/58GK1809638SQ200480017019
公开日2006年7月26日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月18日
发明者平井光春 申请人:爱科来株式会社