一种基于肿瘤多模式协同治疗的新型多功能纳米诊疗剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于肿瘤多模式协同治疗的新型多功能纳米诊疗剂及其制备方法，所述多功能纳米诊疗剂包括具有空腔和介孔孔道的二氧化硅外壳，位于所述二氧化硅外壳的空腔中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、负载在所述二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物、以及负载在所述二氧化硅外壳的介孔孔道中的光敏剂。
【专利说明】一种基于肿瘤多模式协同治疗的新型多功能纳米诊疗剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于协同治疗的新型多功能纳米诊疗剂及其制备和应用，属于纳米生物医学领域。具体说，这种纳米诊疗剂是一种尺寸在80nm以下的核/壳空腔介孔氧化硅结构。其内核钆掺杂上转换荧光颗粒可以实现针对恶性肿瘤的磁共振/上转换发光双模式成像诊断；空腔和介孔孔道可以分别担载具有放疗增敏功效的光敏剂(例如血卟啉)和有放疗增敏功效抗癌药物(例如多西紫杉醇)，从而实现光动力治疗/化疗/放疗三模式协同高效治疗，将有望达到最佳的治疗效果。
【背景技术】
[0002]目前，临床上普遍采用一种治疗手段治疗癌症，其效果不明显。众所周知，单一治疗手段均有其自身的缺点，因而均很难彻底根除恶性肿瘤。例如，放疗很难根除乏氧肿瘤； 而化疗则会对正常组织造成巨大的毒副作用，甚至会使肿瘤产生耐药性；因此，为了达到最佳的治疗效果，有必要将多种治疗手段联合起来使用。此外，如果能采用“协同治疗”的思想，即巧妙地将几种治疗手段协同高效使用，克服单一治疗模式的弊端，其作用将超过这几种治疗模式的简单相加之和。例如，如果使用一些具有放疗增敏功效的化疗药物(顺钼、多西紫杉醇等)，将会显著增强放疗对乏氧肿瘤的杀伤效果，实现化疗/放疗双模式协同治疗。 介孔氧化硅材料可以同时装载这些具有放疗增敏功效的化疗药物、光敏剂、热敏剂等，从而在单一材料体系中实现多模式协同治疗。
[0003]高效的治疗离不开精确的诊断。只有先利 用精确的诊断技术定位肿瘤，才可以及早实施高效治疗。癌症的早期诊断大多采用影像技术(如:发光、PET、CT扫描、磁共振(MRI) 成像等)寻找可疑的病灶区，然而目前临床采用的多是单一成像模式，这无疑存在很多缺陷，导致诊断效果较差，诊断出的癌症患者多数属于中晚期，错过了有效治疗的时期。CT和 MRI成像具有很高的空间分辨率，但灵敏度较低；而PET和发光成像与之相反，具有很高的灵敏度，但空间分辨率较低。因此，亟待开发一种多模式成像探针，整合不同成像模式之间的优势，实现针对癌症早期的高效诊断，以便患者及早高效治疗。近年来发展的上转换荧光纳米颗粒，由于具有生物毒性低、穿透深度大、自发荧光少、信噪比高等优点，被广泛认为是具有良好应用前景的新型上转换荧光探针。此外，掺杂钆离子又可以同时引入T1-MRI加权成像，因此，钆掺杂上转换荧光纳米颗粒可以作为一种新型的磁共振/上转换发光双模式成像探针，同时具有较高的空间分辨率和灵敏度，有助于精准定位肿瘤的位置。
【发明内容】
[0004]面对现有技术存在的问题，基于当前严峻的癌症形势以及未来纳米生物医学发展的趋势，本发明我们设计了一种尺寸在80nm以下、基于钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的空腔介孔氧化硅结构，旨在提供一种能够实现针对恶性肿瘤的高效诊断以及原位治疗的新型多功能纳米诊疗剂，以克服目前癌症诊治领域出现的成像与治疗模式单一、诊治效果差、放疗对乏氧肿瘤的不敏感性等缺点，实现针对恶性肿瘤早期的磁共振/上转换荧光双模式高效诊断以及原位光动力治疗/化疗/放疗协同治疗。
[0005]在此，本发明首先提供一种具有光动力治疗/化疗/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，包括具有空腔和介孔孔道的二氧化硅外壳，位于所述二氧化硅外壳的空腔中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、负载在所述二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物、以及负载在所述二氧化硅外壳的介孔孔道中的光敏剂。
[0006]本发明提供具有光动力治疗/化疗/放疗的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂具有如下优点:(I)钆掺杂上转换发光纳米颗粒Gd-UCNPs (NaYF4:Yb/Er/Tm@NaGdF4)作为内核，既可以用于磁共振成像，又可以用于NIR-vis、NIR-NIR上转换发光成像，从而具有较高的成像灵敏度和空间分辨率，有助于提高癌症的确诊率。(2)介孔孔道可以通过共价键结合的形式，嫁接具有放疗增敏功效的光敏剂，例如血卟啉，血卟啉可以吸收内核Gd-UCNPs 发出的可见光，产生单线态氧，用于光动力治疗，从而实现光动力治疗/放疗双模式协同治疗。(3)空腔结构可以装载具有放疗增敏功效的抗癌药物，例如多西紫杉醇，从而实现化疗 /放疗双模式协同治疗。(4)该诊疗剂可以实现针对恶性肿瘤的磁共振/上转换发光双模式高效诊断以及光动力治疗/化疗/放疗三模式协同治疗，有望达到最佳的治疗效果。
[0007]较佳地，所述光敏剂通过共价键结合的形式嫁接在所述二氧化硅外壳的介孔孔道中。
[0008]较佳地，所述光敏剂在所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒产生的上转换荧光的激发下能够产生用于光动力治疗的单线态氧。
[0009]较佳地,所述具有放疗增敏功效的化疗药物的负载量可为4?6wt%，所述具有放疗增敏功效的化疗药物可为顺钼、紫杉醇和/或多西紫杉醇。
[0010]较佳地，所 述光敏剂的负载量可为7?9wt%，所述光敏剂可为血卟啉、亚甲基蓝。
[0011]较佳地，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4: Yb/Er/Tm@NaGdF4， 其中内核NaYF4:Yb/Er/Tm的直径为23.7?26.5nm，外壳NaGdF4的厚度为0.5?0.8nm。
[0012]较佳地，所述二氧化娃外壳的外径为74?78nm,内径为44?48nm,比表面积为 310 ?330m2/g。
[0013]本发明还提供一种制备上述磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的方法，包括:
((I)采用高温热解工艺，制备单层结构的上转换荧光纳米颗粒；
(2)采用晶核辅助外延生长工艺在所述上转换荧光纳米颗粒上外延生长含有钆的外壳从而得到具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒；
(3 )利用反微乳液方法在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第一实心氧化硅层；
(4)以表面活性剂CTAC作为造孔剂，继续在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第二介孔氧化硅层；
(5)以聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，通过高温热水腐蚀法选择性蚀刻所述第一实心氧化硅层，在所述第二介孔氧化硅层和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间形成空腔；
(6)利用氨基羧基结合反应对所述光敏剂进行氨基硅烷化修饰，然后利用硅羟基键结合反应使所述光敏剂通过共价键结合的形式嫁接到第二介孔二氧化硅层的介孔孔道中；以及
(7)通过原位搅拌法使具有放疗增敏功效的化疗药物负载到所述空腔中。
[0014]较佳地，在步骤(3)中，采用C0-520作为表面活性剂，采用注射泵匀速引入硅源 TEOS。
[0015]较佳地，在步骤(5)中，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000以上，所述高温热水腐蚀法的温度为95?100°C，反应时间为2.5?3小时。
[0016]本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，在纳米生物医学领域具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1A和图1B分别为本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成流程图和示意图；
图2为本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成过程中每一步反应产物的TEM照片；
图3示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂体外 T1-MRI成像性能表征及其弛豫率；
图4示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂与Hela 细胞水平共培养IOh后的共聚焦成像照片；
图5示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内部后的T1-NRI成像；
图6示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内部后的上转换荧光成像；
图7A和图7B分别示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的示意图及其在细胞水平上的治疗效果的评价；
图8示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上的治疗效果的评价，a:荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后半个月内肿瘤体 积的变化曲线山:荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后第15天的肿瘤体积；
图9示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂通过尾静脉注射入小鼠体内后3天、15天、30天的全血指标，(a)肝功能指标包括:丙氨酸转氨酶 (ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、以及血清碱性磷酸酶(ALP) ； (b)肾功能指标包括:尿素氮 (BUN)以及(c)肌氨酸酐(CREA);血液指标包括:(d)红细胞(RBC)、(e)白细胞(WBC)、(f) 淋巴细胞(LYM)、(g)红细胞平均体积(MCV)，、(h)红细胞平均血红蛋白量(MCH)、(i)红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、(j)血红蛋白(HGB)、(k)平均红细胞体积分布宽度(RDW-SD) 以及血细胞压积(HCT)；
图10示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂通过尾静脉注射小鼠体内后3天、15天、30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。
【具体实施方式】[0018]以下，结合附图和下述实施方式进一步说明本发明。应理解，附图【具体实施方式】仅用于说明本发明而非限制本发明。
[0019]本发明提供一种上转换基空腔介孔氧化硅多功能纳米诊疗剂，S卩、具有光动力治疗/化疗/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂。内核是具有核/壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNPs，该颗粒自身具有核壳结构，其内核可以在980nm 近红外光激发下不仅可以发出可见光(红光、绿光和蓝光)，还可以发出紫外光和SOOnm近红外光，用于发光成像；此外，外壳钆离子的引入可以实现MRI的加权成像。钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成可以为NaYF4:Yb/Er/Tm@NaGdF4,但应理解,不限于此,例如内核可以为其他NaYF4基的上转换荧光颗粒。在钆掺杂上转换荧光纳米颗粒中，内核(例如NaYF4 = Yb/ Er/Tm)的直径可为23.7?26.5nm,夕卜壳(例如NaGdF4)的厚度可为0.5?0.8nm。通过优化最外层NaGdF4的厚度，可提高上转换荧光颗粒的纵向弛豫率，以接近甚至超过临床Gd剂的纵向弛豫率值。参见图3，其示出多功能纳米诊疗剂的(a)体外T1-MRI成像性能表征及其 (b)弛豫率，该诊疗剂的T1-MRI信号随着其水溶液浓度的增大而逐渐增强；弛豫率A值可达到5.6211)1-8'参见图4，其示出多功能纳米诊疗剂与Hela细胞水平共培养IOh后的共聚焦成像照片，该诊疗剂与Hela细胞共培养IOh后，大量被细胞吞噬，且存在于细胞质中。 参见图5，其示出多功能纳米诊疗剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内部后的T1-NRI成像，从图中可以看出，将一定浓度的诊疗剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内，肿瘤区域的T1-MRI信号比周围区域有明显增强。参见图6，其示出多功能纳米诊疗剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内部后的上转换荧光成像，从图中可以看出，将一定浓度的诊疗剂注入荷瘤小鼠的41\肿瘤内，施加 980nm近红外光照射，肿瘤区域出现了明显的磁共振信号和上转换发光信号，有利于精确定位肿瘤的位置。
[0020]外壳可选用空心介孔二氧化硅，上述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒可动地位于空心介孔二氧化硅中，而在两者之间形成空腔。二氧化硅外壳的外径可为74?78nm，内径可为 44?48nm，比表面积可为310?330m2/g。在空心介孔二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的空腔内可以负载具有放疗增敏功效的疏水性化疗药物，在发挥化疗功效的同时原位协同增强放疗对乏氧肿瘤的杀伤作用，从而实现高效的化疗/放疗双模式协同治疗。具有放疗增敏功效的装载量可为4?6wt%。具有放疗增敏功效的化疗药物包括但不限于顺钼、紫杉醇和/或多西紫杉醇。在空心介孔二氧化硅外壳介孔孔道中可以负载疏水性光敏剂，疏水性光敏剂可以通过共价键结合的方式嫁接于介孔孔道中，具有较高的担载量和稳定性。所述光敏剂的负载量可为7?9wt%，所述光敏剂可为血卟啉、亚甲基蓝。在 980nm近红外光照射下，其内核Gd-UCNPs发出的上转换荧光可以激发血卟啉产生大量的单线态氧，用于光动力治疗。此外，血卟啉本身也可以作为一种放疗增敏剂来提高放疗的效果，从而实现高效的光动力治疗/放疗双模式协同治疗。将具有放疗增敏功效的光敏剂血卟啉HP和抗癌药物多西紫杉醇D0C，同时分别担载于介孔孔道和空腔中，在980nm近红外光和高能X射线的照射下，可以实现光动力治疗/化疗/放疗三模式协同治疗，有望达到最佳的治疗效果。而且将钆掺杂上转换荧光纳米颗粒复合至空腔介孔氧化硅结构中，可以实现诊断功能与治疗功能的复合。
[0021]这样，本发明一方面具有双重成像功能，可实现高效成像而用于肿瘤的高效诊断， 另一方面分别通过空腔结构和介孔结构分别负载具有放疗增敏功效的化疗药物和光敏剂，则可在诊断过程中实现原位光动力治疗/化疗/放疗三模式治疗方式，并且由于放疗药物兼具放疗增敏功效，同时可原位协同增放疗对乏氧肿瘤的杀伤力。参见图7A和图7B，其分别示出血卟啉和多西紫杉醇共担载的多功能诊疗剂的(a)示意图及(b)其在细胞水平上的治疗效果的评价，从图中可以看出，同时施加980nm近红外光和高能X射线照射后，细胞的存活率降到了最低值，并且这种三模式协同治疗的效果明显优于任何单一模式或者双模式的治疗效果。该诊疗剂注射入肿瘤之后，再辅以高能X射线照射，肿瘤生长得到了明显的抑制，10天之内不会长大，且效果优于单一模式的化疗。而该诊疗剂注射入肿瘤之后，辅以高能X射线照射和980nm近红外光照射，肿瘤逐渐变小至最终完全消失，达到了最终彻底根除恶性肿瘤的目的。参见图8，示出血卟啉和多西紫杉醇共担载的多功能诊疗剂在活体水平上的治疗效果的评价:(a)荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后半个月内肿瘤体积的变化曲线；(b) 荷瘤裸鼠经过不同模式治疗后第15天的肿瘤体积。将诊疗剂注入荷瘤裸鼠的肿瘤内部之后，再辅助放疗，可以发现，肿瘤的生长得到了明显的抑制。但是如果同时施加980nm近红外光和高能X射线照射，肿瘤明显变小直至完全消失，体现了这种三模式协同治疗的优越性，有望达到最佳的治疗效果。该诊疗剂注通过尾静脉注射入小白鼠体内，30d取血进行全血指标的检测，发现各项指标均正常，且各主要器官均没有明显损伤，显示了该纳米诊疗剂具有良好的生物相容性。参见图9，其示出多功能纳米诊疗剂通过尾静脉注射入小鼠体内后3天、15天、30天的全血指标。(a)肝功能指标包括:丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、以及血清碱性磷酸酶(ALP) ; (b)肾功能指标包括尿素氮(BUN)以及(c)肌氨酸酐(CREA);血液指标包括:(d)红细胞(RBC)、(e)白细胞(WBC)、(f)淋巴细胞(LYM)、 (g)红细胞平均体积(MCV)、(h)红细胞平均血红蛋白量(MCH)、(i)红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、(j)血红蛋白(HGB)、(k)平均红细胞体积分布宽度(RDW-SD)以及血细胞压积 (HCT)。可以发现，该纳米诊疗剂注入小鼠体内后，小鼠的生化指标均正常，和对照组几乎一样，说明合成的纳米诊疗剂具有良好的生物相容性。又参见图10，其示出多功能纳米诊疗剂通过尾静脉注射小鼠体内后3天、15天、30天后的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的生理组织切片。可以发现，该纳米诊疗剂注入小鼠体内后，并没有对小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、 肾)造成明显损伤，说明我们所合成的纳米诊疗剂对正常组织没有造成明显的的毒副作用。
[0022]制备工艺
参见图1A，其示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成流程图。又参见图1B，其示出具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成示意图，其中1.外延生长NaGdF4层；2.晶核辅助生长法；3.实心氧化硅层的包裹；4.反微乳液法；5.介孔氧化硅层的包裹；6.CTAC作为造孔剂；7.高温热水刻蚀；
8.PVP作为保护剂；9.将具有放疗增敏功效的血卟啉嫁接于介孔孔道中，用于光动力治疗/ 放疗双模式协同治疗；10.将具有放疗增敏功效的多西紫杉醇装载于空腔中，用于化疗/放疗双模式协同治疗。
[0023]在步骤一中，通过 高温热解法和晶核辅助外延生长法合成自身具有核壳结构的内核(钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(Gd-UCNPs))。首先，采用高温热解法，制备单层上转换荧光纳米颗粒，例如NaYF4:Yb/Er/Tm:按照各种稀土离子掺杂的比例，准确称取所用稀土离子的氯化物作为前驱体，然后在氩气作为保护气的气氛下，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，甲醇除去后高温回流0.5?2小时，随后升温至280?290°C，进行高温热解反应1.5小时，冷却至室温之后离心收集样品 (上转换荧光纳米颗粒(UCNP))收集的UCNPs的直径为23.7?26.5nm。接着，采用晶核辅助外延生长法，制备核/壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNPs (例如(NaYF4 = Yb/ Er/TmiNaGdF4)):按照钆离子的掺杂量准确称取钆离子的氯化物作为前驱体，在氩气作为保护气的气氛下，将钆离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，注入NaYF4:Yb/Er/Tm的环己烷溶液，加热除去环己烷后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，甲醇除去后高温回流0.5?2小时，随后升温至260?270°C，进行高温热解反应1.5小时(此处高温热解反应温度比上一步要低20°C左右)，冷却至室温之后离心收集样品(钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(Gd-UCNPs))，分散在环己烷溶液中，收集的Gd-UCNPs的直径为24.8?28.lnm，外层 Gd的厚度为0.5?0.8nm。应理解，钆掺杂上转换荧光纳米颗粒具体投料比和更为详细的工艺参数可以参见现有技术，例如CN102391874A。
[0024]在步骤二，通过反微乳液法上述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹一层实心二氧化硅层得到Gd-UCNPs@Si02。首先采用反微乳液法，实现第一实心氧化硅层的包裹:以 C0-520作为表面活性剂，少量的氨水作为催化剂，使用注射泵匀速的将稀释后的硅源TEOS 加入到内核(Gd-UCNPs)的环己烷溶液体系中，搅拌反应36小时后，滴加甲醇破坏范围乳液体系，随后离心收集样品，最后分散在去离子水中。在此步反应中，搅拌不要太快，搅拌子不要露出液面。
[0025]在步骤三，以表面活性剂CTAC (十六烷基三甲基氯化铵)为造孔剂，实现介孔氧化硅层的包裹，即制备Gd-UCNPs@Si02@mSi02:以表面活性剂CTAC作为造孔剂，少量TEA (三乙醇胺)作为催化剂，往Gd-UCNPs@Si02的水溶液中，逐滴加入硅源TE0S，整个过程在80度水浴中进行。反应Ih后，离心收集样品，最后分散在去离子水中。
[0026]通过控制硅源的用量来实现第一和第二氧化硅层厚度的调控，第一氧化硅层厚度可为9?llnm，第二氧化硅层厚度可为12?16nm。第二氧化硅层的比表面积可为310? 330m2/g，介孔孔道的孔径大约为3nm。
[0027]在步骤四，通过高温热水腐蚀工艺选择性地蚀刻内层二氧化硅而引入空腔结构 (UCMSNs):以高分子量的PVP (例如Mw=40000)作为保护剂将样品Gd-UCNPs@Si02@mSi02 加入到95?100°C热水中回流反应2.5?3小时后，冷却至室温，离心收集样品，最后分散在去离子水中。应理解PVP的分子量不限于40000，大于该分子量也是适用的。可以通过控制高温热水腐蚀反应的时间来实现空腔大小的调控。对于这种尺寸在SOnm以下的纳米颗粒，不能用酸或碱进行刻蚀，只能用较温和的高温热水刻蚀。并且必须以高分子量的 PVP(Mw=40000)作为保护剂，才能选择性刻蚀掉中间的实心氧化硅层。
[0028]在步骤五，担载 光敏剂(例如血卟啉)UCMSNs-HP:首先利用氨基羧基结合反应，对增敏剂，例如血卟啉进行氨基硅烷修饰；然后利用硅羟基键结合的原理，将血卟啉通过共价键结合的形式嫁接于介孔孔道中，有利于提高血卟啉的担载量和稳定性。
[0029]在步骤六，担载抗癌药物(例如多西紫杉醇)UCMSNs-HP-DOC:采用原位搅拌的方法和浓度梯度差扩散原理，将多西紫杉醇载入空腔中，有利于提高载药量。
[0030]参见图2A?2D，其依次示出本发明的具有协同治疗作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成过程中每一步反应产物的TEM照片，(a)Gd-UCNPs; (b)Gd-UCNPsi SiO2; (c)Gd-UCNPsiSi02imSi02； (d) UCMSNs。从图中可以看出，每步合成的产物均呈现规则均一的球形，且具有非常好的分散性和稳定性，便于后续的生物学效应研究。本发明将钆掺杂上转换荧光纳米颗粒有效地复合至空腔介孔氧化硅结构中，且充分利用介孔孔道和空腔结构，实现光敏剂血卟啉和抗癌药物多西紫杉醇的共担载。并且将整体尺寸控制在80nm以下，保证了良好的分散性和稳定性。这种新型的多功能纳米诊疗剂，既可以实现磁共振/上转换发光双模式高效诊断，其空腔介孔氧化硅结构，又可以同时装载具有放疗增敏功效的光敏剂血卟啉和抗癌药物多西紫杉醇，实现光动力治疗/化疗/放疗三模式协同治疗，有望为癌症的高效诊断与原位治疗提供更好、更有效的方案。
[0031]本发明进一步示出以下实施例以更好地说明本发明。应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的数值也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0032]实施例1 实施实例I
钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNPs的制备
а.首先，高温热分解法制备上转换荧光纳米颗粒NaYF4:Yb/Er/Tm
1.稀土氯化物的准备。分别称取1.58mmol (479.3088mg) YCl3-H2O,
0.36mmol (139.4964mg) YbCl3_6H20，0.04mmol (15.2684mg) ErCl3-6H20,0.02mmol (5.5087mg) TmCl30这些粉末放置于同一个样品瓶中，然后用4mL去离子水溶解，转入IOOmL三口烧瓶中；
2.向三口瓶中加入15mL油酸，30mL十八烯，室温下搅拌Ih;然后开始通5min氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程；先升温到80度，保持Ih或者更长时间(将自由水除尽)；随后升到120度，保持Ih ;然后升到156度左右，保持lh，获得黄色澄清液；停止加热，让体系自然降温至室温；
3.NaOH (上海凌锋)_200mg，NH4F(Sigma) -296.3mg，用IOmL甲醇溶解，超声加速分散； 然后小心加入体系中；室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成；期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
4.2h后，体系开始进入除甲醇环节。同样是缓慢进行；先通5min氩气，然后升温到50 度，Ih ；80?100度，Ih ;直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完；也可以升到 120度，保持Ih ;确保甲醇基本去除干净；
5.甲醇除完之后；将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在280度左右，并保持1.5h;自然降至室温；
б.清洗过程:首先，向体系中加入20mL无水乙醇,搅拌30min;然后分装到两个50mL 离心管中，用11000r/min，离心IOmin ;收集到略带黄色的产物(第一次)；随后，各加入5? IOmL环己烷，小心摇晃，并超声，可以发现产物迅速溶解，得到浑浊溶液，然后加入15mL无水乙醇，超声约5min，离心收集(第二次);重复清洗3?5次；最后产物用20mL环己烷分散， 获得IOOmM内核。
[0033]b.其次，晶核辅助外延生长工艺制备核/壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNPs (NaYF4: Yb/Er/Tm觀aGdF4)
1.首先，称取0.337mmol(88.83mg)GdCl3_xH20,用 4mL 去离子水分散；称取 0.8425mmol (33.7mg)NaOH和 1.348mmol(49.93mg)NH4F，用 IOmL 甲醇溶解；外层使用的前躯体是:0.5mL 上述GdCl3-XH2O水溶液；
2.向三口瓶中加入15mL油酸，30mL十八烯，将预先计算好的前躯体水溶液加入三口瓶中；室温下搅拌Ih ;然后通5min氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程；先升温到80度，保持Ih ;随后升到100?120度，保持1.5h ;然后升到156度左右，保持30min。 最后可以获得黄色澄清液；
3.加入lmmolNaYF4: Yb/Er/Tm内核,室温下搅拌约30min，然后在80?100度下，除去环己烧，继续搅拌30min ；
4.加入1.25mL NaOH+NH4F甲醇溶液；室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成。期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
5.2h后，体系开始进入除甲醇环节。同样是缓慢进行；先通5min氩气，然后升温到50 度，Ih ;80?100度，Ih ;也可以升到120度，保持lh，直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完。可以进行热解反应；
6.甲醇除完之后。将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在260度左右，并保持1.5h。自然降至室温；
7.清洗:首先向体系中加入20mL无水乙醇,搅拌30min。然后分装到两个50mL离心管中，用11000r/min,离心IOmin ;收集到略带黄色的产物(第一次);随后,各加入5?IOmL的环己烷，小心摇晃，并超声，可以发现产物迅速溶解，得到浑浊溶液，然后加入15mL无水乙醇，超声约5min,离心收集(第二次)；重复清洗3?5次；最后产物用20mL环己烧分散,获得50mM内核。
[0034]实施例2
Gd-UCNPs外表面实心氧化硅包裹Gd_ UCNPs@Si02
采用反微乳液法，实现实心氧化硅的包裹:lmL NP-5加入20mL环己烷中，磁力搅拌 40min ；2mL50mM Gd-UCNPs的环己烷溶液加入到NP-5/环己烷体系中，无色透明，密封搅拌 3h。0.14mL30%氨水逐滴加入混合液，密封搅拌2h。0.2mL TEOS溶于0.8ml环己烷，以ImL/ h的速率引入体系中；36h后，加入甲醇破坏反微乳液体系，搅拌30min后，离心收集，整个过程用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后分散在5mL去离子水中。
[0035]实施例3
Gd-UCNPsiSiO2 外表面介孔氧化硅的包裹 Gd-UCNPs@Si02@mSi022g CTAC 和 0.02g TEA 溶于20mL去离子水中，室温下搅拌1.5h ;随后加入IOmL Gd-UCNPsiSiO2的去离子水溶液， 继续搅拌1.5h ;然后将整个反应体系转移到80度水浴中，逐滴加入300 u L TEOS,反应Ih 后立即取出来；之后先用乙醇反复清洗3遍，再将其溶于质量分数为1被％的他(:1的甲醇溶液中，室温下搅拌3h，整个过程持续3遍，直至CTAC完全除去为止；最后，将产物Gd-UCNPsO SiO2OmSiO2分散至IOmL去离子水中。
[0036]实施例4
空腔结构的引入UCMSNs:将IOmL Gd-UCNPsiSi02imSi02的去离子水溶液，加入到IOmL PVP (25mg/mL)的去离子水溶液中，搅拌0.5h后，升温至95度，反应3h后，用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，最后将产物UCMSNs分散在IOmL去离子水中。
[0037]实施例5
光敏剂血卟啉和抗癌药物多西紫杉醇的共担载UCMSNs-HP-DOC
a.通过共价键嫁接血卟啉:将16mgHP和5.6mg DCC溶解于IOmL DMF中，搅拌5分钟后，加入50 ii L APTES，继续反应24h ;然后逐滴加入5mL UCMSNs的去离子水溶液，继续反应 12h后，用DMF和乙醇分别清洗两遍，最后，将产物UCMSNs-HP分散在5mL乙醇中；
b.通过原位搅拌法装载多西紫杉醇:将上述5mLUCMSNs-HP的乙醇溶液，加入到5mL多西紫杉醇的乙醇(浓度为5mg/mL)中，避光搅拌24h后，离心收集最后的产物 UCMSNs-HP-DOC,干燥后备用。
[0038]实施例6
多功能纳米诊疗剂的磁共振/上转换发光双模式成像性能:体外表征:配置不同浓度的UCMSNs的水溶液，分别测试其MRI信号强度，通过拟合曲线计算出其相应的弛豫率F1 ;将一定浓度(400ii g/mL)的UCMSNs与Hela细胞共培养IOh后，然后用DAPI染色，进行共聚焦成像实验。体内表征:将诊疗剂注入至荷瘤小鼠的41\肿瘤内部，30min后，测量肿瘤区域的磁共振信号和上转换发光信号。
[0039]实施例7
多功能纳米诊疗剂的光动力治疗/化疗/放疗三模式协同治疗性能:体外表征:将诊疗剂与Hela细胞共培养后，分别施加6Gy的X射线的照射和(或)Iff的近红外光照射，观察各种治疗模式下细胞的存活率。体内表征:将诊疗剂注入荷瘤小鼠的肿瘤内部，30min后， 进行8Gy的X射线照射和0.7W的近红外光照射，每隔一天测量肿瘤的体积，称量小鼠的体重。
[0040]实施例8
多功能纳米诊疗剂的生物安全性评价:体外表征:将诊疗剂与Hela细胞共培养24h 后，用CCK8试剂测试细胞的存活率。体内表征:将诊疗剂通过尾静脉注入小鼠体内，3天、 15天、30天后，取血进行生化指标测试，解剖出主要的器官(心、肝、脾、肺、肾)进行生理组织切片测试。
[0041]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种具有光动力治疗/化疗/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影齐U，其特征在于，包括具有空腔和介孔孔道的二氧化硅外壳，位于所述二氧化硅外壳的空腔中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒、负载在所述二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物、以及负载在所述二氧化硅外壳的介孔孔道中的光敏剂。
2.根据权利要求1所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述光敏剂通过共价键结合的形式嫁接在所述二氧化硅外壳的介孔孔道中。
3.根据权利要求1或2所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述光敏剂在所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒产生的上转换荧光的激发下能够产生用于光动力治疗的单线态氧。
4.根据权利要求1?3中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述具有放疗增敏功效的化疗药物的负载量为4?6 wt%，所述具有放疗增敏功效的化疗药物为顺钼、紫杉醇和/或多西紫杉醇。
5.根据权利要求1?4中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述光敏剂的负载量为7?9 wt%，所述光敏剂为血卟啉、和/或亚甲基蓝。
6.根据权利要求1?5中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4: Yb/Er/Tm@NaGdF4，其中内核 NaYF4:Yb/Er/Tm 的直径为 23.7 ?26.5 nm，外壳 NaGdF4 的厚度为 0.5 ?0.8 n m。
7.根据权利要求1?6中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述二氧化娃外壳的外径为74?78 nm,内径为44?48 nm,比表面积为310? 330 m2/g。
8.一种制备权利要求1?7中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的方法，其特征在于，包括:(1)采用高温热解工艺，制备单层结构的上转换荧光纳米颗粒；(2)采用晶核辅助外延生长工艺在所述上转换荧光纳米颗粒上外延生长含有钆的外壳从而得到具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒；(3 )利用反微乳液方法在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第一实心氧化硅层；(4)以表面活性剂CTAC作为造孔剂，继续在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第二介孔氧化硅层；(5)以聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，通过高温热水腐蚀法选择性蚀刻所述第一实心氧化硅层，在所述第二介孔氧化硅层和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间形成空腔；(6)利用氨基羧基结合反应对所述光敏剂进行氨基硅烷化修饰，然后利用硅羟基键结合反应使所述光敏剂通过共价键结合的形式嫁接到第二介孔二氧化硅层的介孔孔道中；以及(7)通过原位搅拌法使具有放疗增敏功效的化疗药物负载到所述空腔中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，采用C0-520作为表面活性齐U，采用注射泵匀速引入硅源TEOS。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000以上，所述.高温热水腐蚀法的温度为95?100 °C，反应时间为2.5?3 小时。
【文档编号】A61K49/06GK103432597SQ201310345143
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月8日 优先权日:2013年8月8日
【发明者】范文培, 步文博, 施剑林 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所