一种炎热清颗粒的制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种炎热清颗粒的制备方法，由由玄参154.36g、龙胆102.60g、石膏308.73g、柴胡102.60g、栀子102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，采用微粉化、超临界萃取和微波萃取制备而成，使得黄芩苷含量有很大提高，本发明还提供了炎热清颗粒在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。
【专利说明】一种炎热清颗粒的制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药制剂【技术领域】，具体涉及一种炎热清颗粒的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]炎热清颗粒记载于国家食品药品监督管理局标准YBZ06462009，由玄参154.36g、龙胆 102.60g、石膏 308.73g、柴胡 102.60g、桅子 102.60g、知母 102.60g、黄芩 210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，能解表清里，清热解毒。用于呼吸道炎、支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎，也可用于泌尿系感染、胆道感染。
[0003]现有技术中，尚未有炎热清颗粒在提取制备方面采用微粉化、超临界和微波技术的报道，而采用打粉和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种炎热清颗粒的制备方法。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种炎热清颗粒在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。
[0006]技术方案:本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007]一种炎热清颗粒的制 备方法，由玄参154.36g、龙胆102.60g、石膏308.73g、柴胡102.60g、桅子102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成:取柴胡、黄芩微粉化过200目筛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30_50°C，CO2流量l-3ml / g生药.π?η，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，备用；取玄参、龙胆、石膏、桅子、知母，粉碎，加入2L的70 %乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50 %乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入薄荷脑和淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，制成1000克颗粒，每袋颗粒剂重2g。
[0008]上述炎热清颗粒的制备方法，所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
[0009]上述炎热清颗粒的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。
[0010]上述炎热清颗粒的制备方法，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40°C，CO2流量2ml / g生药.min,萃取时间160min。
[0011]上述炎热清颗粒在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。
[0012]现有技术中，炎热清颗粒每袋3g，每次I袋，一日3次，采用本发明制备成的炎热清颗粒每袋2g，一日服用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
[0013] 试验一、不同方法制备的炎热清颗粒中黄芩苷含量的比较
[0014]1、仪器及试药本发明炎热清颗粒:按实施例3方法制备，使用1086.39g原料药，经提取制成lOOOg，每袋重2g。原炎热清颗粒，按部颁标准方法制备，使用1086.39g原料药，经提取制成lOOOg，每袋重3g。Agilentl200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所)。
[0015]2、方法
[0016]色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)为流动相；检测波长为316nm。理论板数按黄芩苷峰计算，应不低于3000。
[0017]对照品溶液的制备:精密称取在60°C减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
[0018]供试品溶液的制备:取本发明炎热清颗粒和原炎热清颗粒，研细，混匀，取lg，精密称定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超声处理10分钟，离心，取上清液，即得。
[0019]测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0020]3、结果
[0021]结果表明，本发明炎热清颗粒中黄芩苷的含量为63.3mg /袋；而原炎热清颗粒中黄芩苷的含量为32mg /袋，在服用量减少的情况下，黄芩苷含量有很大提高。
[0022]上述研究表明，采用本发明制备的炎热清颗粒，有效成分含量高于部颁标准法制备的炎热清颗粒。
【具体实施方式】
[0023]以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0024]实施例1
[0025]取玄参154.36g、龙胆 102.60g、石膏 308.73g、柴胡 102.60g、桅子 102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成:取柴胡、黄芩微粉化过200目筛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30°C，C02流量Iml / g生药.π?η，萃取时间150min，得超临界萃取物，备用；取玄参、龙胆、石膏、桅子、知母，粉碎，加入2L的70 %乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入薄荷脑和淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,制成1000克颗粒,每袋颗粒剂重2g。
[0026]经检测，成品中黄芩苷的含量为59.4mg /袋。
[0027]实施例2
[0028]取玄参154.36g、龙胆 102.60g、石膏 308.73g、柴胡 102.60g、桅子 102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成:取柴胡、黄芩微粉化过200目筛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40°C，C02流量2ml / g生药.π?η，萃取时间160min，得超临界萃取物，备用；取玄参、龙胆、石膏、桅子、知母，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入薄荷脑和淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,制成1000克颗粒,每袋颗粒剂重2g。
[0029]经检测，成品中黄芩苷的含量为67.6mg /袋。
[0030]实施例3
[0031]取玄参154.36g、龙胆 102.60g、石膏 308.73g、柴胡 102.60g、桅子 102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成:取取柴胡、黄芩微粉化过200目筛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50°C，CCV流量3ml / g生药.π?η，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取玄参、龙胆、石膏、桅子、知母，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入薄荷脑和淀粉，70%乙醇制颗粒,干燥,制成1000克颗粒,每袋颗粒剂重2g。
[0032]经检测，成品中黄芩苷的含量为63.3mg /袋。
[0033]实施例4:炎热清颗粒抑制HL-60细胞增殖的实验研究资料
[0034]I实验材料
`[0035]1.1实验用细胞株
[0036]人早幼粒白血病细胞HL-60细胞，本公司实验室细胞库，DMEM+10% FBS常规培养。
[0037]1.2实验药物
[0038]研究药物:本发明炎热清颗粒:按实施例3方法制备。
[0039]药液储液:称取IOOmg炎热清颗粒，溶于5ml无水乙醇中，0.2 μ m滤器过滤，500 μ Idoff管分装，-20°c存储，同时0.2 μ m滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0040]1.3实验试剂
[0041]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03 (上海久亿化学试剂有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin(AMRESC0 公司批号:2010 / 04) ；EDTA(AMRESC0 公司批号:2009 / 10) !Penicillin G Sodium Salt (AMRESCO 公司批号:2010242) !StreptomycinSulfate (AMRESCO公司批号:2010382);无水乙醇(南京化学试剂有限公司批号:080310182) ;MTT(Biosharp 批号:0793) ;PBS(实验室自配)；
[0042]1.4实验器材
[0043]莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DM1L);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190) ;C02培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Spring公司型号:S / N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANK)公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:ΚΑ-1000) ;0.2μπι滤器(MILLIPORE型号:SLGP033RB) ；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司);细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。
[0044]2实验方法
[0045]l)HL-60 细胞用 DMEM+10% FBS 于 37°C、5% C02 进行常规培养(IOcm 培养皿)，当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25 %胰蛋白酶-0.04% EDTA, 37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3X 104个/ ml。
[0046]2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180 μ I,培养板放入细胞培养箱中(37°C，5% C02)常规培养。
[0047]3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入炎热清颗粒溶液，继续培养24h。
[0048]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg / ml，即 0.5% MTT)，继续培养 4h。
[0049]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0050]6)同时设置本底(不加细胞，只加培养液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6个复孔。
[0051]7)结果以药物对细胞的抑制率表示:
[0052]细胞增值抑制率(％ )=(对照孔OD值-给药孔OD值)/对照孔OD值X 100 %。实验重复3次。
[0053]3统计处理
[0054]采用Microsoft Excel2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean+ S.D.表不。
[0055]4实验结果
[0056]MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg / ml时，对HL-60细胞增殖抑制有差异(p〈0.05)，剂量在IOmg / ml时该差异具有显著性(P〈0.01)，当剂量达到15-20mg / ml时有极显著性差异(Ρ〈0.001)。
[0057]表1炎热清颗粒对HL-60细胞增殖抑制影响研究(X土 SD)
[0058]
【权利要求】
1.一种炎热清颗粒的制备方法，由玄参154.36g、龙胆102.60g、石膏308.73g、柴胡102.60g、桅子102.60g、知母102.60g、黄芩210.90g、薄荷脑2g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成:取柴胡、黄芩微粉化过200目筛，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50°C, CO2流量l-3ml / g生药.min，萃取时间150_180min，得超临界萃取物，备用；取玄参、龙胆、石膏、桅子、知母，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到DlOl大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入薄荷脑和淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，制成1000克颗粒，每袋颗粒剂重2g。
2.根据权利要求1所述一种炎热清颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
3.根据权利要求1所述一种炎热清颗粒的制备方法，其特征在于所述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
4.根据权利要求1所述一种炎热清颗粒的制备方法，其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40°C, CO2流量2ml / g生药.min,萃取时间160min。
5.根据权利要求1所 述一种炎热清颗粒在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。
【文档编号】A61P35/02GK103479854SQ201310407802
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】陈家进, 尹庆锋, 苏娟 申请人:南京同仁堂药业有限责任公司