多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物的制作方法
【专利摘要】描述了具有13种不同的多糖－蛋白质缀合物和任选地基于铝的佐剂的免疫原性组合物。每种缀合物含有缀合到载体蛋白的从肺炎链球菌(Streptococcus?pneumoniae)的不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)制备的荚膜多糖。配制为疫苗的免疫原性组合物总体上增加对婴儿和幼儿中肺炎球菌疾病的覆盖，并且提供了对血清型6A和19A的覆盖，其中所述血清型6A和19A不依赖于血清组交叉保护的限制。还描述了制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物的方法，该方法包括在二价阳离子的存在下用高碘酸氧化所述多糖。
【专利说明】多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
[0001 ] 本申请是中国专利申请200780051661.5的分案申请，原申请的申请日是2007年12月10日，发明名称是“多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物”。
发明领域
[0002]本发明总体上涉及医药领域，并具体地涉及微生物学、免疫学、疫苗和通过免疫预防细菌病原体感染。
[0003]发明背景
[0004]肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是世界上婴儿和幼儿中脑膜炎、肺炎和严重侵入性疾病的主要病因。多年前就批准了多价肺炎球菌多糖疫苗并且已经证明其在老年人和高危病人中预防肺炎球菌疾病是有价值的。然而，婴儿和幼儿对多数肺炎球菌多糖应答很弱。7价肺炎球菌缀合物疫苗(7vPnC，Prevnar?)是第一种表明对婴儿和幼儿中
侵入性疾病和中耳炎具有高度免疫原性和有效的疫苗。该疫苗现在在世界上许多国家被批准。Prevnar含有来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的荚膜多糖，每种多糖缀合到称作CRM197的载体蛋白。Prevnar在美国、欧洲和世界的其他地区分别覆盖约80-90%、60_80%和40-80%侵入性肺炎球菌疾病(IPD) [I, 2]。Prevnar的引入后数年中收集的监视数据已经清楚地表明如所预期的，在美国婴儿中侵入性肺炎球菌疾病减少(图1) [3，4]。
[0005]在Prevnar引入前美国婴儿中进行的IH)监视表明由于血清群6和19的疾病的大部分是由于6A(约1/3)和19A (约1/4)血清型[5，6]导致的。在Prevnar批准后，在美国进行的肺炎球菌侵入性疾病监视表明大部分的疾病仍然归因于血清型6A和19A (图1)[3]。此外，这两种血清型造成比血清型1、3、5和7F总和还要多的侵入性疾病病例(100，000个2岁以下儿童中8.2对3.3例)。此外，血清型6A和19A与高比率的抗生素抗性有关(图2) [7，8，9]。尽管随着更多儿童被免疫，可能血清组交叉保护将导致血清型6A和19A疾病的下降，但是有证据表明该下降将很有限，并且由于这些血清型引起的疾病的很大负担将保持(见下文)。
[0006]考虑到由于血清型1、3、5、6A、7F和19A的侵入性肺炎球菌疾病的相对负担和重要性，向Prevnar制剂中加入这些血清型将在美国和欧洲增加侵入性疾病的覆盖率到>90%，在亚洲和拉丁美洲高达70%-80%。该疫苗将显著扩大Prevnar的覆盖度，并且提供对6A和19A的覆盖，其不依赖于血清组交叉保护的限制。
[0007]发明概述
[0008]因此，本发明总体上提供了包含13种不同的多糖一蛋白质缀合物的多价免疫原性组合物，其中每种缀合物含有缀合到载体蛋白的来自不同血清型的肺炎链球菌的荚膜多糖，以及生理学上可接受的载体。任选地，在该制剂中包含佐剂，如基于铝的佐剂。更具体地，本发明提供了 13价肺 炎球菌缀合物(13vPnC)组合物，其包含7vPnC疫苗中的7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F^P 23F)加上 6 种附加的血清型(1、3、5、6A、7F 和 19A)。
[0009]本发明还提供了多价免疫原性组合物，其中荚膜多糖来自肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 和 23F 并且载体蛋白是 CRM1970[0010]本发明还提供了多价免疫原性组合物，其中荚膜多糖来自肺炎链球菌的血清型1、
3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，载体蛋白是CRM197,并且佐剂是基于铝的佐剂，诸如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。在本发明的一个具体实施方案中，佐剂是磷酸铝。
[0011]本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含多糖一蛋白质缀合物以及生理学上可接受的载体，其中每种缀合物包含缀合到载体蛋白的来自肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且所述荚膜多糖制备自血清型3和至少一种额外的血清型。
[0012]在该多价免疫原性组合物的一个实施方案中，额外的血清型选自血清型1、4、5、6八、68、7?、抑、14、18(:、194、19?和23?。在另一实施方案中，载体蛋白是CRM197。在再一个实施方案中，组合物包含佐剂，诸如选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个具体实施方案中，佐剂是磷酸铝。
[0013]本发明还提供了多价免疫原性组合物，其包含多糖一蛋白质缀合物和生理学上可接受的载体，其中每种缀合物包含缀合到载体蛋白的来自肺炎链球菌的不同血清型的荚膜多糖，并且该荚膜多糖制备自血清型4、68、抑、14、18(:、19?、23?和至少一种额外的血清型。
[0014]在该多价免疫原性组合物的一个实施方案中，额外的血清型选自血清型1、3、5、6A、7F和19A。在另一实施方案中，载体蛋白是CRM197。在再一个实施方案中，组合物包含佐剂，诸如选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一个具体实施方案中，佐剂是憐Ife招。
[0015]本发明还提供了诱导对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括对人施用免疫有效量的前述任一种免疫原性组合物。
[0016]本发明还提供了施用的任一种免疫原性组合物是单个的0.5mL剂量，其经配制成含有:除了 4yg6B外，2yg每种糖；约29^ CRM197载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和作为赋形剂的氯化钠和琥珀酸钠缓冲剂。
[0017]还提供了制备包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3(Pn3)多糖的免疫原性缀合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括(i)使纯化的Pn3多糖与温和的酸反应，得到水解的Pn3多糖；(ii)在二价阳离子的存在下使水解的Pn3多糖与氧化剂反应，得到活化的Pn3多糖；(iii)使活化的Pn3多糖与载体蛋白混合；(iv)使混合且活化的Pn3多糖和载体蛋白与还原剂反应，得到Pn3多糖:载体蛋白缀合物；和(V)封闭Pn3多糖:载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌Pn3多糖的免疫原性缀合物。
[0018]在一个其它实施方案中，该方法包括:(i)使纯化的Pn3多糖与乙酸反应，得到水解的Pn3多糖；(ii)在MgCl2的存在下使水解的Pn3多糖与高碘酸反应，得到活化的Pn3多糖；(iii)纯化活化的Pn3多糖；(iv)使活化的Pn3多糖与载体蛋白混合；(V)共同冻干混合且活化的Pn3多糖和载体蛋白；(vi)使共同冻干且活化的Pn3多糖和载体蛋白与氰基硼氢化钠反应，得到Pn3多糖:载体蛋白缀合物；和(vii)用硼氢化钠封闭Pn3多糖:载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌Pn3多糖的免疫原性缀合物。
[0019]还提供了制备活化的肺炎链球菌Pn3多糖的方法。该方法包括:(i)使纯化的Pn3多糖与温和的酸反应，得到水解的Pn3多糖；和(ii)在二价阳离子的存在下使水解的Pn3多糖与氧化剂反应，得到活化的Pn3多糖。[0020]附图简述
[0021]图1描绘了在美国年龄〈2岁的儿童从基线(1998/1999)到2001年按照血清型的IPD比率的改变。
[0022]图2描绘了在〈5岁的儿童中具有青霉素(PCN)抗性的肺炎球菌分离株的分布
(1998)。
[0023]图3描绘了来自D118_P16Prevnar试验的第三次剂量后OPA的倒数累积分布曲线(reverse cumulative distribution ;RCDC)。
[0024]发明详述
[0025]Prevnar 血清型 4、6B、9V、14、18C、19F、23F 的包括
[0026]来自1995-1998年间IPD监视的数据估计Prevnar中的7种血清型造成〈2岁年龄的儿童中约82%的IPD [5]。在加利福尼亚北部功效试验地点，Prevnar血清型占婴儿和幼儿中所有IK)病例的90% [10]。自从在2000年引入Prevnar疫苗，由于该疫苗血清型引起的疾病的下降，总的IPD率显著降低[3，4]。因此，在此时没有理由从下一代肺炎球菌缀合物疫苗除去任一种Prevnar血清型，而是加入血清型以得到更宽的覆盖范围。
[0027]血清型1、3、5和7F的包括
[0028]在美国，5岁以下儿童中血清型I弓丨起的IPD率〈2%，对于血清型3和7F的每一种大概相同[1，6]。 血清型I和5占具有侵入性肺炎球菌疾病的高危美国人口中IPD的较高发病率。具体地，血清型I引起阿拉斯加〈2岁的本地儿童中3.5%的IPDJP 2 — 4岁儿童中18%的IPD[11]。血清型I和血清型5在世界的其他地方和发达国家的土著人口中显著致病[12，13，14]。
[0029]与其他肺炎球菌血清型相比，血清型I也与更严重的疾病有关[15]。该观察是基于美国和欧洲之间病例鉴定率的差异，和医疗实践中相关的差异。总体上，iro的发病率在欧洲低于美国。然而，在欧洲由血清型I引起的IPD的百分比不成比例地高于美国(分别为6-7%对1-2%)。在欧洲，血液培养物主要从住院儿童得到。在美国，在门诊病人从发热>39°C并且具有升高的白细胞数的儿童得到血液培养物是常规的医疗实践。考虑到医疗实践的差异，推测在美国血清型I引起的疾病的较低百分比可能被引起较轻的疾病的其他血清型的较高比率稀释，而欧洲的较高百分比反映了更严重的疾病。此外，具有并发肺炎的儿童的血清流行病学研究表明血清型I被不成比例地表示[16，17，18]。这提示血清型I的包括可以降低严重肺炎球菌疾病的量，以及促进侵入性肺炎球菌疾病的总的减少。
[0030]加入血清型3和7F将在世界上的多数地区对IPD的覆盖率增加约3%_7%，在亚洲增加约9%。从而，11价疫苗将覆盖亚洲中的约50%和所有其他地区中IPD的约80%[1，2]。这些血清型对于中耳炎覆盖率也是重要的[19]。在引起中耳炎的肺炎球菌血清型的多国家研究中，Hausdorff等人发现血清型3是第8位最普遍的总体中耳液分离物[20]。血清型3占与中耳炎相关的肺炎球菌血清型的高达8.7%。因而，在中耳炎以及IPD中血清型3和7F的重要性保证它们包括在肺炎球菌缀合物疫苗中。
[0031]然而，产生显示出就血清型3多糖而言的显著免疫原性的多价肺炎球菌缀合物疫苗的尝试没有成功。例如，在11价肺炎球菌蛋白D缀合物疫苗(Il-Pn-PD)的免疫原性和安全性研究中，在接受三剂该疫苗接着接受相同疫苗或者肺炎球菌多糖疫苗的加强剂量的婴儿中没有观察到血清型3的引发效果(Nurkka等人(2004)Ped.1nf.Dis.J.,23:1008-1014)。在另一研究中，来自已经接受11_Ρn_Η)剂量的婴儿的调理吞噬测定(OPA)没有显示出在与其他测试的血清型相当的水平上对血清型3的抗体应答(Gatchalian等人，17th Annual Meeting of the Eur.Soc.Paed.1nf.Dis.(ESPID), PosterN0.4, PlA Poster Sessionl, Istanbul Turkey, 2001 年 3 月 27 日)。在再一个研究中，评估了 11-Ρn-ro在预防急性中耳炎中的功效，疫苗没有提供对血清型3引起的发作的保护(Prymula等人(2006) Lancet, 367:740-748)。因此，包含来自血清型3的荚膜多糖和能够引起对血清型3多糖的免疫原性应答的肺炎球菌缀合物疫苗提供了在本领域现状上的显著进步。
[0032]血清型6A和19A的包括
[0033]a.血清型6A和19A的流行病学
[0034]文献中的监视数据提示血清型6A和19A与血清型1、3、5、和7F组合相比，造成美国〈2岁的儿童中更多的侵入性肺炎球菌疾病(图1) [1，5]。此外，这些血清型通常与抗生素抗性有关(图2)并且在中耳炎中起重要作用[6，19，20]。当前的Prevnar疫苗保护6A和19A引起的疾病的能力还不清楚。下面讨论在13vPnC疫苗中包括6A和19A组分的原理。
[0035]b.6B和19F多糖诱导的对6A和19A的应答
[0036]所批准的未缀合的肺炎球菌多糖疫苗(用于至少2岁的人中)已经含有6A或6B荚膜多糖，但是不含有两者[21]。在配制23价肺炎球菌多糖疫苗时产生的免疫原性数据表明6B单价疫苗诱导针对6A和6B荚膜的抗体。使用游离多糖和使用肺炎球菌缀合物疫苗在多种群体中评估IgG和调理吞噬测定(OPA)应答的几个试验的数据表明针对6A的IgG应答通过6B抗原诱导，但是该应答通常较低，并且使用6A生物的OPA活性与使用6B生物的不同[22，23，24，25]。此外，以高6B抗体应答的受试者可以对6A有很小活性或无活性。
[0037]与6A和6B荚膜多糖的化学组成(其中存在高度相似性)相反，19A和19F荚膜由于在19A多糖中存在两条额外侧链而相当不同。不令人惊奇的是，在用19F多糖疫苗免疫的人类志愿者中测量的免疫应答表明在80%的受试者中诱导了对19F的应答，但是仅20%的受试者具有对19A的应答[26]。用19F多糖免疫后对血清型19A的低水平的交叉反应性IgG和OPA应答也已经在使用缀合物疫苗的试验中记载[24，26]。
[0038]已经从在美国婴儿中进行的7vPnC桥接试验(D118-P16)产生了关于对6A和19A的交叉反应性OPA应答的内部数据(图3)。这些研究与其他人的发现一致，并且表明用6B多糖免疫后诱导对6A多糖的交叉反应性功能抗体，尽管在较低水平，和用19F免疫后对19A的极低的功能抗体。
[0039]动物模型中6B和19F免疫对6A和19A的影响
[0040]已经用动物模型评估用多糖免疫的交叉保护的潜力。在Giebink等人开发的中耳炎模型中，用四价多糖外膜蛋白(OMP)缀合物疫苗(含有6B、14、19F、23F糖)或安慰剂免疫灰鼠[27]。在该试验中，显示对6A有一定的交叉保护；然而，这没有达到统计学显著性并且保护水平低于用6B对中耳炎的保护水平。在该相同模型中，存在对19F中耳炎的100%保护，但是对19A中 耳炎仅有17%的保护。
[0041 ] Saeland等人在肺感染模型中，在用6A生物进行鼻内攻击之前，使用来自用8价肺炎球菌破伤风缀合物疫苗(含有6B和19F)免疫的婴儿血清被动免疫小鼠[28]。在59个血清样品中，53%的样品保护小鼠抵抗具有6B的菌血症，37%的样品保护抵抗6A。在相同模型中用来自4剂11价肺炎球菌缀合物疫苗(含有缀合到破伤风类毒素的19F)免疫的婴儿的血清被动免疫的小鼠被给予19A生物的鼻内攻击[29]。在100只被动免疫然后攻击的小鼠中，60只小鼠在肺组织中没有检测到19A生物，而在给予盐水安慰剂的所有小鼠中鉴定到生物。然而，在该模型中，被动免疫不能保护用19F生物的攻击；因此，该模型对于血清群19的相关性是可疑的。通常，这些模型提供证据证明6B免疫对6A生物的一定的生物学影响，尽管对异源血清型的影响没有用同源血清型观察到的大。从这些模型还没有很好地了解19F免疫对19A生物的影响。
[0042]在功效/有效性试验中6B和19F多糖缀合物免疫对6A和19A疾病的影响
[0043]表1中指出了在7vPnC和9vPnC(7vPnC加血清型I和5)功效试验中由于6B、6A、19F和19A血清型导致的疾病病例数[30，10，31]。侵入性疾病病例的数目太小而不能对血清型6A和19A得出任何结论。然而，Finnish中耳炎试验产生了大量肺炎球菌分离菌
[32]ο在根据方案分析(per protocol analysis)中，7vPnC对由于血清型6B引起的中耳炎为84%(95%C162%, 93%)有效，对由于血清型6A引起的中耳炎为57%(95%C124%, 76%)有效(表1)。相反，对由于19F或者19A引起的中耳炎没有显示使用7vPnC的血清型特异的功效。
[0044]表1.在使用7vPnC和9vPnC疫苗的功效试验中，由于血清型6B、6A、19F和19A引
起的肺炎球菌疾病的病例
[0045]
【权利要求】
1.用于制备多价免疫原性组合物的方法，所述多价免疫原性组合物包含13种不同的多糖一蛋白质缀合物和生理学上可接受的载体，其中每种缀合物含有缀合到载体蛋白的不同的荚膜多糖，并且其中从肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖，其中所述血清型3多糖一蛋白质缀合物根据包括步骤 (a)使纯化的血清型3多糖与选自乙酸、柠檬酸或碳酸的温和的酸反应，得到水解的血清型3多糖； (b)在二价阳离子的存在下使水解的血清型3多糖与氧化剂反应，得到活化的血清型3多糖，其中所述的氧化剂是高碘酸且二价阳离子是Mg2+或Ca2 + ； (c)使活化的血清型3多糖与载体蛋白混合； (d)使混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白与还原剂反应，得到血清型3多糖:载体蛋白缀合物；和 (e)封闭血清型3多糖:载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物； 其中所述载体蛋白选自:白喉类毒素；破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A ;外膜复合体c (OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、来自A组或者B组链球菌的C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D ；卵白蛋白；匙孔血蓝蛋白(KLH);牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)， 的方法制备，并且其中在纯化 各糖缀合物后，将它们混合以配制所述免疫原性组合物。
2.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中还包括在与载体蛋白混合的步骤(c)前纯化活化的血清型3多糖。
3.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，还包括在与还原剂反应的步骤(d)前，共同冻干所述混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白。
4.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中步骤(a)中所述的温和的酸是乙酸。
5.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中所述的载体蛋白是CRM197。
6.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中步骤(d)所述的还原剂是氰基硼氢化钠。
7.权利要求1的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中步骤(e)中封闭未反应的醛包括使血清型3多糖:载体蛋白缀合物与硼氢化钠反应。
8.用于制备多价免疫原性组合物的方法，所述多价免疫原性组合物包含13种不同的多糖一蛋白质缀合物和生理学上可接受的载体，其中每种缀合物含有缀合到载体蛋白的不同的荚膜多糖，并且其中从肺炎链球菌的血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备荚膜多糖，其中所述血清型3多糖一蛋白质缀合物根据包括步骤 (a)使纯化的血清型3多糖与乙酸反应，得到水解的血清型3多糖； (b)在MgCl2的存在下使水解的血清型3多糖与高碘酸反应，得到活化的血清型3多糖； (c)纯化活化的血清型3多糖；(d)使活化的血清型3多糖与载体蛋白混合； (e)共同冻干混合且活化的血清型3多糖和载体蛋白； (f)使共同冻干且活化的血清型3多糖和载体蛋白与氰基硼氢化钠反应，得到血清型3多糖:载体蛋白缀合物；和 (g)用硼氢化钠封闭血清型3多糖:载体蛋白缀合物中未反应的醛，得到包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌血清型3多糖的免疫原性缀合物； 其中所述载体蛋白选自:白喉类毒素；破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A ;外膜复合体c (OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A (PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、来自A组或者B组链球菌的C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D ；卵白蛋白；匙孔血蓝蛋白(KLH);牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素的纯化的蛋白质衍生物(PPD)， 的方法制备，并且其中在纯化各糖缀合物后，将它们混合以配制所述免疫原性组合物。
9.权利要求8的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中所述的载体蛋白是CRM197。
10.根据权利要求1一 9任一项所述的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中所述多价免疫原性组合物还包含佐剂。
11.根据权利要求10的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中所述佐剂是基于铝的佐剂。
12.根据权利要求11的用于制备多价免疫原性组合物的方法，其中所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
【文档编号】A61K39/09GK103599529SQ201310511943
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2007年12月10日 优先权日:2006年12月22日
【发明者】W·P·豪斯多夫, G·R·西贝尔, P·R·帕拉迪索, A·K·普拉萨德 申请人:惠氏公司