趋化素样因子衍生多肽在抑制炎性病变中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种趋化素样因子衍生多肽在抑制炎性病变中的应用，尤其是在制备抗炎药物中的应用，所述多肽包含：1）如SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列的多肽；或2）在1）所述多肽中经过缺失、插入或者置换一个或多个氨基酸且与1）所述多肽具有相同的生物学功能的由1）衍生的多肽。该趋化素样因子衍生多肽尤其可以用于制备干预或治疗炎性肺损伤性疾病。
【专利说明】趋化素样因子衍生多肽在抑制炎性病变中的应用
【技术领域】
[0001]本发明提供了一种趋化素样因子衍生多肽在抑制炎性病变中的应用，尤其是在制备抗炎药物中的应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002]肺纤维化或间质性肺炎是呼吸系统常见而棘手的疾病，它代表了一类弥漫性肺实质疾病群，其病理特征是肺泡壁(包括呼吸性细支气管)的弥漫性炎症和间质纤维化(包括急、慢性病变)。特发性肺纤维化是这一类弥漫性肺实质疾病中的常见类型，约占所有肺间质性肺炎、肺纤维化的60%左右。针对特发性肺纤维化发病机制的免疫炎症学说，目前的治疗主要使用免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺及硫唑嘌呤等，但这些药物副作用大，疗效不明显。因此研发新的抗肺纤维化药物一直是医药界努力的方向。
[0003]已经有研究证实，趋化因子作为一类具有趋化作用的细胞因子，在机体的免疫调节、炎症反应、干细胞增殖分化等过程中发挥重要作用。自1999年开始，北京大学人类基因研究中心陆续公开了一种新的人类细胞因子及相关研究进展，即，趋化素样因子I(Chemokine-like factorl, CKLFl )，其核酸序列在 Gen-bank? 注册登记号为 AF096895【1】，CKLFl含有CC家族趋化因子的特征性结构，具有趋化作用和促进细胞增殖的能力【1】，其功能性受体是CCR4m。CKLFl的相关研究成果已在中国、美国、欧洲等国家获得多项发明专利权。在对CKLFl基本特征及功能研究的基础上，对它在疾病中作用的研究不断延伸。例如，研究表明，内源性CKLFl 在哮喘患者的外周血单个核细胞及气道粘膜中高表达【3】;将CKLFl基因导入小鼠体内，可诱发小鼠支气管肺的炎性损伤及重塑病变【4_5】。此外，在类风湿性关
节炎、特发性肌炎、多器官系统性硬化症等自身免疫性疾患的病变中都有CKLFl的高表达
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[0004]也就是说，目前的研究结果可以表明CKLFl不仅参与了哮喘疾病与SARS的发生与发展，也参与了多种疾病的炎症反应。因此干预CKLFl或其它趋化因子介导的炎性损伤，寻找新的相关治疗靶点无疑具有重要的临床意义。
[0005]中国专利CN200410098627.1，发明名称为“具有多种功能的多肽”，公开了在CKLFl基础上所得到的新的多肽，尤其是利用果蝇表达系统获得分泌表达的CKLFl重组蛋白，进而得到两种CKLFl分泌多肽序列，称为CKLFlC末端多肽，其中之一命名为C19，是CKLFl多肽的C末端19个氨基酸序列。根据该中国专利的公开，包括C19在内的所述CKLFlC末端多肽对IFN-Y刺激的U937细胞(CCR1、CCR3、CCR5高表达)具有趋化作用，这种趋化作用可被CCR3、CCR5中和抗体抑制，提示C19多肽可与CCR3与CCR5等多种趋化因子受体相互作用，进而提出了 C19多肽在制备预防和/或治疗人免疫缺陷病毒感染、过敏性疾病、抑制排斥、脑部疾病或自身免疫疾病的药物中的应用。
[0006]对上述趋化素因子及其衍生物的研究还在继续，例如，前述中国专利CN200410098627.1中公开的另一种CKLFlC末端多肽是被命名为C27的肽(C末端27个氨基酸序列)。本发明是在这些研究基础上进一步论证了上述来自CKLFl的衍生多肽在抗炎方面，尤其是治疗炎性肺损伤方面的功效。
【发明内容】
[0007]本发明提供了上述来自CKLFl的衍生多肽在抑制炎性病变中的应用，尤其是在制备针对炎性肺损伤及相关疾病的抗炎药物中的新用途，进而为该多肽在干预或治疗与炎性肺损伤有关的肺部疾病的医药研究奠定基础。
[0008]在对CKLFl的多年研究基础上，发明人完成的一些体外实验表明，C19多肽应该具有抑制炎性反应的功能。在此基础上进行了该C19多肽在干预或治疗肺纤维化病变或间质性肺炎方面的探索。
[0009]本发明提供了一种趋化素样因子衍生多肽在制备抗炎药物中的应用，所述趋化素样因子衍生多肽包含:
[0010]I)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽；或
[0011]2)在I)所述多肽中经过缺失、插入或者置换一个或多个氨基酸且与I)所述多肽具有相同的生物学功能的由I)衍生的多肽；
[0012]其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为:
[0013]Ala Leu He Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys LysPro
[0014]上述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽是来自CKLFl多肽的末端19个氨基酸序列的衍生多肽，命名为C19。有关该C19多肽和相关的衍生多肽，以及这些多肽的合成方法，在前面提到的中国专利CN200410098627.1中均有详细描述，因此，将该专利的相关内容合并于本发明中。
[0015]在本发明的一个实施方案中，将该C19多肽应用于博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，实验表明，C19多肽明显干预了小鼠的肺纤维化病变进程，也明显降低了博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的死亡率和肺纤维化病变。
[0016]本发明的优选方案中，可将所述趋化素样因子衍生多肽应用于制备抗炎药物，例如针对炎性细胞浸润及炎性细胞因子或炎性介质导致的肺炎性病变的药物。所述抗炎药物优选包括干预或治疗炎性肺损性疾病的药物，包括例如干预或治疗包括多种肺纤维化病变如特发性肺纤维化(IPF)等或间质性肺炎的炎性肺损性疾病的药物，以及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重急性呼吸综合征(SARS)、呼吸机相关性肺炎(VAP)、脓毒症(S印sis)、全身性炎性反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)、多系统器官功能衰竭(multiple systemic organ failure, MSOF)或多脏器衰竭(mul-tiple organfailure, M0F)、病毒性肺炎、小儿重症肺炎等。
[0017]根据本发明的优选方案，所述趋化素样因子衍生多肽为:
[0018]I)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽；或
[0019]2)与I)所述多肽具有至少90%同源性的多肽，该多肽的生物学功能与I)所述多肽的生物学功能相同；
[0020]其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为:
[0021]Ala Leu He Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys LysPro0[0022]根据本发明的实施方案，提出了符合上述定义的多肽用于制备抗炎药物的应用，优选用于制备包括干预或治疗炎性肺损性疾病的药物，研究结果还显示，比较低的给药剂量已经明显表现抗炎作用，所以，所述多肽的使用剂量可以为30-500 μ g/kg体重，本发明的具体实验中，采用了 50-250 μ g/kg体重的剂量。
[0023]本发明的研究提示，C19多肽有可能是CKLFl截短形式的拮抗肽，该C19作为截短体有可能转换为趋化因子受体拮抗剂。因此，本发明的提出是对目前广为关注的趋化素因子CKLFl研究的一个新发展，为干预和治疗炎性损伤寻找新的治疗靶点，尤其是对抗纤维化新药的研制提供了全新的研究方向，具有重要的临床意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为实施例中各组小鼠的体重随时间变化趋势的曲线示意图。
[0025]图2为实施例中各组小鼠的BALF细胞计数分析图。
[0026]图3为实施例中各组小鼠肺组织HYP含量分析图。
[0027]图4显示了实施例中各组实验小鼠的肺组织H&E染色图(X200)。
【具体实施方式】
·[0028]以下通过具体实施方案对本发明进行详细说明，目的在于使阅读者能更清楚和准确理解本发明的实质和有益效果，不能理解为对本发明可实施范围的任何限定。
实施例
[0029]实验中所用材料:
[0030]1、实验动物:
[0031]健康雌性SPF级C57BL/6小鼠，体重16_20g，平均18g，4_6周龄，购自广东省医学实验动物中心。所述健康雌性SPF级C57BL/6小鼠可自由取食，并有充足的新鲜饮用水，其饲养环境符合SPF实验动物级环境设施标准，并且全部动物实验获得广州医学院第一附属医院动物伦理委员会批准。
[0032]2、主要试剂:
[0033]C19多肽:由北京大学人类疾病基因研究中心提供，或通过专利文献CN200410098627.1描述的方法合成得到；
[0034]盐酸博莱霉素:盐酸博莱霉素(粉剂)15mg/支，购自日本化药株式会社，药品生产批号:Y91450，执行标准:进口药品注册证号Η20090885 ；
[0035]羟脯氨酸(Hyp)测试盒(碱水解法):购自南京建成生物工程研究所，生产批号:20111210。
[0036]4%多聚甲醛缓冲液(500ml)，生产企业:晶欣生物科技公司。
[0037]CKLF1-C19多肽对博来霉素诱导小鼠肺纤维化病变的干预作用
[0038]1、实验方法
[0039]1.1药物配制方法
[0040]I)用生理盐水将盐酸博莱霉素配制成终浓度为lmg/ml的博莱霉素溶液。
[0041]2)将50只C57BL/6小鼠随机分为5组组:对照组(NS组)、模型组、C19高剂量组、C19中剂量组和C19低剂量组(也称C19药物组)，每组10只。
[0042]3)用无菌的生理盐水将C19多肽配制成不同浓度的溶液:5ug/ml、50ug/ml和500ug/ml，分别用于对低、中、高三个剂量药物组动物的用药。
[0043]1.2处理过程
[0044]I)模型组和三个剂量药物组小鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠，全身麻醉后固定于手术台上，颈部正中剪毛，切开皮肤，钝性分离颈部组织，充分暴露气管(尽量减少对气管周围组织的损伤)，用Iml的注射器从气管靠上部分平行刺入气管内，并迅速注射0.1ml注射博来霉素液体后(按5mg / (kg体重)给药)，将小鼠头部朝上，迅即用重力震荡作用使博来霉素药液分散至各个肺叶；
[0045]对照组经气管注射同等体积的生理盐水；
[0046]之后缝合创口，消毒皮肤，完成造模。
[0047]2)造模完成的当天直至造模第21天，按照设定的三个剂量分别对三个药物组的实验小鼠连续给予腹腔注射C19溶液，对各药物组小鼠的给药量参见下表:
[0048]
【权利要求】
1.一种趋化素样因子衍生多肽在制备抗炎药物中的应用，所述趋化素样因子衍生多肽包含: 1)如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的多肽；或 2)在I)所述多肽中经过缺失、插入或者置换一个或多个氨基酸且与I)所述多肽具有相同的生物学功能的由I)衍生的多肽； 其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为:
Ala Leu He Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抗炎药物包括干预或治疗炎性肺损伤性疾病的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述炎性肺损伤性疾病为炎性细胞浸润及炎性细胞因子或炎性介质导致的肺炎性病变。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其中炎性肺损伤性疾病包括多种肺纤维化病变或间质性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、严重急性呼吸综合征、呼吸机相关性肺炎、脓毒症、全身性炎性反应综合征、多系统器官功能衰竭或多脏器衰竭、病毒性肺炎和小儿重症肺炎。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述肺纤维化病变包括特发性肺纤维化。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其中，所述趋化素样因子衍生多肽为: 1)如SEQID NO:1所示的氨基酸序列的多肽；或 2)与I)所述多肽具有至少90%同源性的多肽，该多肽的生物学功能与I)所述多肽的生物学功能相同；` 其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为:
Ala Leu He Tyr Arg Lys Leu Leu Phe Asn Pro Ser Gly Pro Tyr Gln Lys Lys Pro。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其中，所述抗炎药物的给药剂量为30-500 μ g/kg 体重。
8.根据权利要求6所述的应用，其中，所述抗炎药物的给药剂量为30-500μ g/kg体重。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，所述抗炎药物包括干预炎性肺损伤性疾病的药物，给药剂量为50-250 μ g/kg体重。
【文档编号】A61P29/00GK103861082SQ201310539462
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2012年12月10日
【发明者】谭亚夏, 孙红, 钟南山, 陈涛, 刘蓉, 王应, 张颖妹, 关淑君 申请人:广州呼吸疾病研究所, 广州医学院第一附属医院, 北京大学