一种颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及骨关节治疗药物【技术领域】，是一种莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，该莲威阿娜奇颗粒按下述制备方法得到：将雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾和鸡血藤进行醇提、浓缩后得到稠膏、对生白术进行提取挥发油、对阿纳齐根、桑椹、鹿衔草、透骨草和醇提药渣以及生白术提取挥发油后的药渣进行水提、浓缩、醇沉后得到粗多糖，对挥发油进行包合得到包合物，将稠膏和粗多糖混合加入辅料后制粒、整粒后，加入包合物得到莲威阿娜奇颗粒，本发明的莲威阿娜奇颗粒具有低毒性，针对骨关节软骨细胞破坏及炎症有较好的效果，并且具有一定的镇痛效果，能够用于治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症疾病。
【专利说明】一种颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨关节治疗药物【技术领域】，是一种莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用。
【背景技术】
[0002]中医对于关节炎病因病机的阐述最早见于《内经》，《素问痹论》指出“风、寒、湿三气杂至，合而为痹，其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为著痹也”，“所谓痹者，各以其时重感于风寒湿者也”。除此之外，《素问痹论》还认为“所谓饮食居处，为其病本”，痹病的产生又与饮食和生活环境有关。而在《素问评热病论》中曰:“风雨寒热，不得虚，不能独伤人”，“不与风寒湿气合，故不为痹”。可见古人对于关节炎的发病，既看到了其外部因素，同时也意识到了它的内因，概括的说，风、寒、湿、热邪是关节炎发生发展的外部条件，而诸虚内存，正气不足才是其发病的内在原因。中医对于关节炎治疗的理论认为“风寒湿邪，痹阻经脉，致使经脉不通，不通则痛”，所以中药治疗即当以祛风散寒、解痉通络、活血化淤为目的，同时亦须温肾助阳、扶正固本，以达强筋壮骨、根除关节炎症之功效。莲威阿那奇方剂，临床应用十多年来，疗效显著，但也有诸多不便，汤剂口感差、煎煮、服用不太方便，而且剂量还特别大。为了顺应患者用药需要，对本处方药材中活性成分的药理及其理化性质进行调研，制定了较为科学的制备工艺，将莲威阿那奇汤剂研制成为安全有保证，质量更稳定的复方无糖混悬型颗粒制剂，既能发挥了颗粒剂服用方便、比其它固体制剂，崩解快，释药快的特点，又能减少对胃肠道的刺激，还提高了药物稳定性、患者服用药物的依从性和适用性。
[0003]莲威阿娜奇颗粒(简称LW)由雪莲、肉苁蓉、桑椹、阿纳其根、骨碎补、鹿衔草、仙灵脾、土鳖虫、威灵仙、透骨草、鸡血藤、生白术等12味中药民族药组成。方中雪莲微苦，性温，温肾助阳，祛风胜湿，通经活血，止风寒湿痹；肉苁蓉具有补肾阳，益精血之功效；桑椹具有补肝益肾、滋阴补血、生津润 燥作用，三者合为君药。阿纳其根干热，味辛辣而麻舌，祛寒强筋，热身壮阳，祛风止痛；骨碎补具有疗伤止痛、补肾强骨功效；鹿衔草具有祛风湿、强筋骨、止血等功效；仙灵脾具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效；土鳖虫具有破血逐瘀，续筋接骨功效；上述五味药辅助君药，以加强疗效，合为臣药。威灵仙具有祛风湿，通经络功效；透骨草具有祛风湿通络功效；鸡血藤具有活血补血、舒筋通络、调经止痛之功效，三者合为佐药。白术健脾益气，燥湿利水。诸药合用，共奏补肾通络、活血化瘀、祛风止痛之效。
[0004]单味药现代药理研究:雪莲是菊科凤毛菊属雪莲亚属的草本植物。主要分布在新疆、西藏、四川、青海等省(区)，其中最著名的是生于新疆天山、阿尔泰山、昆仑山雪线附近的岩缝、石壁、冰碛碌石滩中的天山雪莲。本品系维吾尔族习用药材，为天山雪莲Saus sur eainvolucrata(Kar.et Kir.) Sch.-Bip.的干燥地上部分。具有散寒除湿、活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能，民间用于治疗风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。天山雪莲含有芦丁、槲皮素、高车前素、柯伊利素、木犀草素等黄酮类，紫丁香苷及绿原酸等苯丙素类，大苞雪莲碱等生物碱类、大苞雪莲内酯等内酯类、多糖类等化学成分。其中，黄酮类、生物碱和内酯类等为脂溶性有效成分；多糖和苷类等为水溶性有效成分。故其提取工艺应为醇、水双提，以达到充分利用资源，发挥药品最佳药效的。目的现代药理研究表明天山雪莲中黄酮类和苯丙素类成分具有明显的抗炎镇痛和抗风湿作用。翟科峰等人将天山雪莲70%乙醇粗提物上大孔吸附树脂柱，用乙醇进行梯度洗脱，得到的30%乙醇洗脱液(绿原酸部位)，50%乙醇洗脱液(紫丁香苷和芦丁部位)具有明确抗炎，镇痛的药效活性。刘发等人研究表明:雪莲水液能使大鼠AA模型急性炎症和继发性炎症明显减轻，减轻角叉莱胶致大鼠足跖肿，抑制大鼠棉肉芽肿的形成，减少乙酸致小鼠的扭体次数，抑制小鼠腹腔毛细血管的渗出，还能使小鼠耳廓细动脉、细静脉扩张，毛细血管开放量增加。肉灰蓉为列当科植物肉灰蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉灰蓉Cistanche tubulosa (Schrenk) R.Wight的干燥带鳞叶的肉质莖。肉灰蓉的主要基源植物为管花肉苁蓉，其次为荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉。甘、咸、温。归肾、大肠经。具有补肾阳，益精血，润肠通便作用。常用于肾阳不足，精血亏虚，阳痿不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠爆便秘。肉苁蓉活性成分有苯乙醇苷类、多种活性多糖、环烯醚萜类、木脂素类及生物碱等。松果菊苷和麦角留苷(又名毛蕊花糖苷)是肉苁蓉中苯乙醇总苷的主要成分。现代药理研究表明肉苁蓉除了补肾壮阳作用外还具有镇痛、消炎、免疫、神经保护、通便、抗衰老和抗氧化等作用。桑椹为桑科植物桑Morus alba L.的干燥果穗。甘、酸、寒。归心、肝、肾经。具有滋阴补血，生津润燥作用。常用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，心悸失眠，津伤口渴，内热消渴，肠燥便秘。桑椹的主要活性物质包括花色苷、白藜芦醇、芦丁、多糖等，此外，桑椹中还含有人体所必须的18种氨基酸和丰富的维生素。桑椹具有调节免疫、保护神经细胞、抗氧化、保护心脑血管系统、抗癌等多种药理活性作用。阿纳其根为菊科植物罗马除虫菊Anacycluspyrethrum (L.)DC.的干燥根。维药名为阿卡勒卡勒哈。分布于北非或南部欧洲，我国新疆亦有分布。三级干热，味辛辣而麻舌。具有祛寒强筋，开通阻滞清除脑中余物，热身壮阳，通利经水，固精，祛风止痛，燥湿化痰，滋补神经等功能。民间用于治疗湿寒性或黏液质性疾病，如瘫痪，面瘫，肌肉松弛，麻痹，颤动，癔病，舌重，性欲减退，精液不固，经闭不畅，头痛牙痛，多痰咳嗽，神经衰弱等症。有研究表明除虫菊根含有墙草碱(pellitorine)、菊糖。预试还含挥发油、黄酮、鞋质及氨基酸。骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根茎。味苦、温，归肝、肾经。具有疗伤止痛、补肾强骨功效。主治肾虚腰痛，耳鸣耳聋，牙齿松动，跌扑闪挫，筋骨折伤等症状。骨碎补中含有二氢黄酮、黄烷-3-醇及其衍生物、三萜类等多种化学成分，另外，骨碎补中还含有甲基丁香酚、β_2谷留醇、原儿茶酸、新北美圣草苷、骨碎双氢黄酮苷、环木菠萝留醇醋酸脂、环水龙骨留醇醋酸脂、环鸦片甾醇醋酸脂、9，10-环羊毛留-25-烯醇-3 β -醋酸脂、豆留醇、菜油留醇等多种化学物质，主要活性物质为柚皮苷，有研究表明柚皮苷可能是骨碎补促进骨折愈合的主要有效成分之一。现代药理研究表明骨碎补具有补肝肾、强筋骨、防治药物中毒性耳聋、降血脂以及强心和镇静作用。鹿衔草为鹿蹄草科植物鹿蹄草Pyrola calIiantha H.Andres或普通鹿蹄草Pyrola decorate H.Andres的干燥全草。甘、苦、温。归肝、肾经。除了兼有祛风湿、强筋骨，还有止血等功效。临床治疗肾虚腰痛、风湿痹痛和腰膝酸软无力等病状。活性成分为黄酮类、醌类、酚类和环烯醚萜苷类。环烯醚萜苷类化合物的代表成分水晶兰苷，是抗炎镇痛药理作用的主要活性成分。临床药理学还发现，鹿衔草具有抗菌作用，抗炎镇痛等活性。仙灵脾又名淫羊藿，为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿 Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescensMaxim.、或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。辛、甘,温。归肝、肾经。具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效。用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛等症状。主要含有黄酮类、多糖、生物碱、木脂素、绿原酸、萜类化合物及微量元素等多种活性物质。具有壮阳、抑制骨质疏松、抗氧化、抗抑郁、防治肥胖症、调节免疫、抗肿瘤、防治心血管疾病、调节激素分泌、抗肝毒素等多种生物活性。淫羊藿苷为其总黄酮类中的主要成分。土鳘虫又名地鳘，为鳘爐科昆虫地鳘Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鳘Steleophagaphancyi (Boleny)的雌虫干燥体。咸,寒；有小毒。归肝经。具有破血逐瘀，续筋接骨功效。用于治疗跌打损伤，筋伤骨折，血瘀经闭等症状。主要活性成分包括多种活性蛋白质(酶)、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素、生物碱和脂溶性维生素等。其所含有的丝氨酸蛋白酶，对人体血纤溶酶原的激活作用与尿激酶相似。现代研究表明土鳖虫具有溶解血栓、抗凝血、抗肿瘤、促进骨折愈合、调节血脂、抗突变、耐缺氧等药理作用。威灵仙为毛茛科植物威灵仙 Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲 Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshurica Rupr.的干燥根和根莖。辛、咸、温。归膀胱经。具有祛风湿，通经络功效。用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利症状。主要含有挥发性成分，三萜皂苷、生物碱、黄酮、香豆素、木脂素等成分。其中威灵仙总皂苷具有显著的抗炎镇痛作用，所含皂苷均为五环三萜类齐墩果烷型，其皂苷元为齐墩果酸和常春藤皂苷元，所结合糖主要为鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和核糖。现代药理研究表明:威灵仙具有解热镇痛、抗炎、抑制肿瘤扩散等作用，此外还有抗菌灭菌、免疫抑制等作用。另有周效思等人研究发现威灵仙水提取液具有改善局部微循环的作用，为临床上治疗风湿痹痛提供了药理学依据。透骨草基源十分混乱，同名异物现象非常严重，据统计，各地药材为透骨草的原植物有19科44种之多，使用地区较为广泛的有16科22种。迄今未载入《中国药典》、《部颁标准》。在诸多的品种中， 珍珠透骨草、凤仙透骨草、羊角透骨草、东北透骨草、小透骨草和透骨草等使用最为广泛。祛风湿通络是各种透骨草之共性，临床多与其他祛风湿药配伍使用。有研究报道凤仙透骨草含有黄酮类、萘醌类、香豆素类、留醇类、多肽类化合物及蛋白质等成分。另有研究表明:羊角透骨草所含单萜生物碱之一角蒿酯碱(Incarvillateine)被发现具有很强的镇痛活性。在福尔马林试验中，角蒿酯碱的镇痛活性高于吗啡，且作用机理不同于吗啡，主要是通过U、K和adenosine受体发挥作用。现代药理研究表明透骨草水提取液具有明显的抗炎镇痛作用，此外还具有抗菌、抗过敏等作用。鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobussuberectus Dunn的干燥藤茎，其性温，味苦、甘，归肝、肾经。有活血补血、舒筋通络、调经止痛的功效，用于风湿痹痛，血虚萎黄、麻木瘫痪、月经不调等症。含有到黄酮、三萜和甾醇等多种成分，但具体活性成分不明确。现代药理研究表明:鸡血藤有抑制血小板聚集、降低血压、抗心律失常等作用。生白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎。苦、甘，温。归脾、胃经。具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎功效。用于治疗脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安症状。主要含有挥发油、内酯类、多糖类。挥发油在白术根茎中约含1.4%，其主要成分为苍术酮、苍术醇等。近代药理学研究表明白术具有免疫调节、利尿、抗肿瘤、抗菌消炎、降糖、抗衰老等作用，对神经系统、消化道、子宫平滑肌也有一定作用，还能调节免疫功能。[0005]目前已发表的3篇论文题目分别是:“莲威阿娜奇处方水提浸膏中总糖含量测定”(发表在《中国实验方剂学杂志》，2012第5期)与“以芦丁为对照品对莲威阿娜奇处方醇提工艺研究”(发表在《时珍国医国药》，2012第10期)以及“莲威阿娜奇颗粒剂的工艺研究”(发表在《新疆医科大学杂志》2012年4月)。
[0006]关于莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症的镇痛、抗炎作用与急性毒性方面的药物试验，国内外均未见报道资料。[0007]世界卫生组织将骨关节疾病列为继心脑血管疾病、癌症、糖尿病〃三大杀手〃外对人体危害最广泛的疾病。据世卫组织统计，全世界骨关节疾病的患病率为:50岁以上的人群中患病率超过50%，55岁以上的人群中患病率为80%，60岁以上的中老年人，几乎都患有不同程度的骨关节疾病。目前全世界共有3.55亿骨关节疾病患者。目前，在我国60岁以上的人群中，约有55%的人患有骨关节炎，在70岁以上的人群中，约有80%的人患有骨关节炎。最新的统计数据显示，我国约有1.2亿人正经受着骨关节炎的折磨。此外，我国还有
2.6亿的体重超标者和肥胖症患者成为骨关节炎的后备军。
[0008]目前西医对于骨关节炎的治疗没有太多良策。尚无依据证明应用化学药:非甾体抗炎药(NSAID)对骨关节炎有长期疗效。醋氨酹(ac-etaminophen)最大剂量为lg，每日4次，能有效镇痛，且比NSAID更安全。在疼痛反复发作或炎症体征明显时，可使用阿司匹林或其他NSAID，能有效地缓解症状(参见第50节)。C0X-2抑制剂能控制炎症反应，减轻疼痛，副作用较小，处于最后的研究阶段。当支持患病关节的肌肉受牵拉而引起疼痛时，肌肉松弛剂通常可提供暂时的疗效(一般均给予小剂量)。由于药物副作用，一般不给病人口服肾上腺皮质激素。关节内注射激素对关节有炎症表现的病人有效，而且应间断注射。药物治疗在最佳的治疗计划中占次要地位，其比重约占整个计划的15%。如所有保守治疗均无效，必须考虑外科治疗，如椎板切除术，切骨术，全关节置换术等。在脊柱，膝，第一掌指骨关节炎，不同的支持器可使其减少负重，但必须继以特殊训练。其他辅助治疗有经皮神经刺激和局部摩擦(如用辣椒素)。而用于保护软骨或软骨移植的实验性治疗仍在进一步试验中。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决关于莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症的镇痛、抗炎作用与急性毒性方面的药物试验国内外均未见报道的问题。
[0010]本发明的技术方案是通过以下措施来实现的:一种莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用。
[0011]下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进:
上述莲威阿娜奇颗粒按下述制备方法得到:
第一步，按重量份计分别称取骨碎补8份至12份、土鳖虫1份至5份、雪莲7份至11份、肉苁蓉13份至17份、威灵仙13份至17份、仙灵脾8份至12份、鸡血藤8份至12份、阿纳齐根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿衔草13份至17份、透骨草8份至12份和生白术13份至17份；第二步，将所需量的雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾和鸡血藤混合在一起作为醇提药材，向醇提药材中加入质量是醇提药材质量12倍的体积浓度为70%的乙醇水溶液在溶液沸腾状态下进行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提药渣，将醇提液在压力为-0.098MPa、温度为50°C至60°C条件下减压浓缩成常温下相对密度为1.30至1.35的稠膏；
第三步，对所需量的生白术进行提取挥发油并分别得到挥发油、白术药液和干药渣，然后向挥发油中加入质量是挥发油质量8倍的β_环糊精，在20°C条件下搅拌Ih得到包合物；
第四步，将所需量的阿纳齐根、桑椹、鹿衔草、透骨草和醇提药渣以及干药渣混合在一起作为水提药材，向水提药材中加入质量是水提药材质量12倍的纯水在水沸腾状态下进行水提，提取3次，每次2小时，水提后得到水煎液，将水煎液在压力为-0.098MPa、温度为70°C至80°C条件下减压浓缩成每Iml药液中含有0.2g生药的水提药液，将水提药液和白术药液混合在一起后冷却至室温，接着向其中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液至混合液的体积含醇量达到80%，室温下放置I小时后，密封于4°C冰箱，冷藏24小时，然后进行抽滤，抽滤后得到的滤渣即为粗多糖；
第五步，将稠膏和粗多糖混合在一起后在压力为-0.08MPa、温度为60°C条件下干燥6小时得到浸膏粉，将所需量的骨碎补和土鳖虫打成150目至200目的细粉，分别称取质量是浸膏粉质量10%的微晶纤维素细粉和质量是浸膏粉质量0.5%的羧甲基纤维素钠，将细粉、微晶纤维素细粉、羧甲基纤维素钠和浸膏粉混合均匀，然后向其中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液得到手握成团、轻按即散的软材，接着过16目筛网制粒，过筛颗粒在温度为60°C条件下进行干燥得到干颗粒，将干颗粒和包合物混匀后得到莲威阿那奇颗粒剂。
[0012]上述第二步中，将雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾、鸡血藤粉碎至能过I号筛后，再进行醇提。
[0013]上述第三步中，用挥发油提取器或挥发油提取罐提取所需量的生白术中的挥发油。
[0014]上述先将挥发油用等体积的无水乙醇稀释均匀得到挥发油稀释液，然后将所需量的环糊精溶于水并加热溶解成环糊精水溶液、冷却后得到环糊精饱和溶液，接着在20°C条件下将挥发油稀释液与β -环糊精饱和溶液混合在一起搅拌lh，冷藏至少24小时后，用30°C至60°C的石油醚将滤渣洗涤三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小时得到包合物。
[0015]上述第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一起再进行水提。
[0016]本发明的莲威阿娜奇颗粒具有低毒性，针对骨关节软骨细胞破坏及炎症有较好的效果，并且具有一定的镇痛效果，能够用于治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]附图1为本发明中的莲威阿娜奇颗粒的制备工艺流程图。
[0018]附图2为本发明中的莲威阿娜奇颗粒的颗粒吸湿平衡曲线。【具体实施方式】
[0019]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
[0020]下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述:
实施例1，该莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用。
[0021]可根据实际需要，对上述莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用作进一步优化或/和改进:
实施例2，如图1所示，实施例1中的莲威阿娜奇颗粒按下述制备方法得到:
第一步，按重量份计分别称取骨碎补8份至12份、土鳖虫1份至5份、雪莲7份至11份、肉苁蓉13份至17份、威灵仙13份至17份、仙灵脾8份至12份、鸡血藤8份至12份、阿纳齐根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿衔草13份至17份、透骨草8份至12份和生白术13份至17份；
第二步，将所需量的雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾和鸡血藤混合在一起作为醇提药材，向醇提药材中加入质量是醇提药材质量12倍的体积浓度为70%的乙醇水溶液在溶液沸腾状态下进行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提药渣，将醇提液在压力为-0.098MPa、温度为50°C至60°C条件下减压浓缩成常温下相对密度为1.30至1.35的稠膏；
第三步，对所需量的 生白术进行提取挥发油并分别得到挥发油、白术药液和干药渣，然后向挥发油中加入质量是挥发油质量8倍的P -环糊精，在20°C条件下搅拌Ih得到包合物；
第四步，将所需量的阿纳齐根、桑椹、鹿衔草、透骨草和醇提药渣以及干药渣混合在一起作为水提药材，向水提药材中加入质量是水提药材质量12倍的纯水在水沸腾状态下进行水提，提取3次，每次2小时，水提后得到水煎液，将水煎液在压力为-0.098MPa、温度为70°C至80°C条件下减压浓缩成每Iml药液中含有0.2g生药的水提药液，将水提药液和白术药液混合在一起后冷却至室温，接着向其中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液至混合液的体积含醇量达到80%，室温下放置I小时后，密封于4°C冰箱，冷藏24小时，然后进行抽滤，抽滤后得到的滤渣即为粗多糖；
第五步，将稠膏和粗多糖混合在一起后在压力为-0.08MPa、温度为60°C条件下干燥6小时得到浸膏粉，将所需量的骨碎补和土鳖虫打成150目至200目的细粉，分别称取质量是浸膏粉质量10%的微晶纤维素细粉和质量是浸膏粉质量0.5%的羧甲基纤维素钠，将细粉、微晶纤维素细粉、羧甲基纤维素钠和浸膏粉混合均匀，然后向其中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液得到手握成团、轻按即散的软材，接着过16目筛网制粒，过筛颗粒在温度为60°C条件下进行干燥得到干颗粒，将干颗粒和包合物混匀后得到莲威阿那奇颗粒剂。
[0022]实施例3，作为实施2的优选，第二步中，将雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾、鸡血藤粉碎至能过I号筛后，再进行醇提。
[0023]实施例4，作为实施例2和实施例3的优选，第三步中，用挥发油提取器或挥发油提取罐提取所需量的生白术中的挥发油。
[0024]实施例5，作为实施例2、实施例3和实施例4的优选，先将挥发油用等体积的无水乙醇稀释均匀得到挥发油稀释液，然后将所需量的(6-环糊精溶于水并加热溶解成(6-环糊精水溶液、冷却后得到β-环糊精饱和溶液，接着在20°C条件下将挥发油稀释液与β-环糊精饱和溶液混合在一起搅拌lh，冷藏至少24小时后，用30°C至60°C的石油醚将滤渣洗涤三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小时得到包合物。
[0025]实施例6，作为实施例2、实施例3、实施例4和实施例5的优选，第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一起再进行水提。
[0026]一、对根据本发明中的莲威阿娜奇颗粒质量进行检查:
1.水分检测
依照中国药典中水分测定法(2010年版一部附录IX.H)测定莲威阿娜奇颗粒水分，结果见表1。结果表明，颗粒水分不超过6.0%。本发明中的莲威阿娜奇颗粒剂符合规定。
[0027]吸湿性测定
取莲威阿娜奇颗粒2.00g，置于已称重的扁形称量瓶中，精密称定重量，放入盛有氯化钠的过饱和溶液(干燥器内的相对湿度为75%左右)的干燥器中，将扁形称量瓶盖揭开，分别在6h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120h后测定吸湿百分率(％)，吸湿百分率平均值结果见表2。
[0028]溶化性检查
取莲威阿娜奇颗粒10.0Op ,加60°C至80°C的热水200ml，搅拌5分钟，立即观察，颗粒能呈混悬状，杯底没有沉降物出现，仔细观察无焦屑物存在。通过观察，本发明中的莲威阿娜奇颗粒符合药典规定。
[0029]粒度测定
依据2010版药典粒度测定法(附录X I B第二法，双筛分法)测定:不能通过一号筛(10目)与能通过五号筛(80目)的颗粒重量占总颗粒重量的比例，不得超过15%。结果见表3。由表中数据可以看出，本发明中的莲威阿娜奇颗粒剂符合药典规定。
[0030]休止角测定
固定漏斗法测定休止角，将漏斗3只串联后，固定于铁架台上，将最低处的漏斗口下缘降至离坐标纸的高度为1.0cm，取莲威阿娜奇颗粒紧贴漏斗内壁倒入最上面的漏斗，使颗粒圆锥体尖端恰好接触到漏斗口，量取直径(2R)，算出休止角a。休止角的测定结果见表4。结果表明:莲威阿娜奇颗粒休止角小于35°，颗粒流动性较好，符合要求。
[0031]临界相对湿度(CRH)的测定
颗粒分装时，容易受环境的影响，尤其是相对湿度的影响，故必须对颗粒进行平衡吸湿性试验。
[0032]测定方法:取莲威阿那奇颗粒成品1.00g，分置于干燥至不再增重的扁形称量瓶中，将其放入盛有不同相对湿度溶液的干燥器中，揭开瓶盖，25°C放置72小时，当颗粒吸湿至恒重后，及时加盖移出后，再次精密称重，计算吸湿百分率(%)。
[0033]设纵坐标为吸湿率，横坐标为相对湿度，绘制吸湿曲线。将吸湿曲线直线部分的交点垂直与横轴交点所对应的横坐标即为临界相对湿度(CRH)，见图2 (颗粒吸湿平衡曲线)。临界相对湿度(CRH)的测定结果平均值，见表5。由图2中曲线作切线，切线相交处向横轴做垂线，即得临界相对湿度约为70.5%，结果提示，在制粒剂贮存时，环境湿度应控制在70.5%以下，以减少水分对药物性质及稳定性的影响。[0034]二、莲威阿娜奇颗粒针对治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症方面药理作用的分析:
1、急性毒性试验的最大耐受量(MTD)试验:给予实验小鼠莲威阿那奇颗粒所能灌胃的
最高液体浓度和小鼠一次最大灌胃的耐受容积的剂量，观察给药后7天小鼠生存状态，也就是急性毒性试验的最大耐受量试验。
[0035]动物分组:昆明种小鼠40只，体重18 g至22g，雌雄各半。检疫3天无异常后分成雌雄2组，每组20只。试验时雌性小鼠平均体重为:19.7g±0.3g;雄性小鼠平均体重为:20.5g±0.6g。
[0036]给药:禁食12h后，莲威阿那奇颗粒剂混悬液每只小鼠一次灌胃1.0ml,间隔4h重复给药1.0ml，共计2.0ml ;其中，莲威阿那奇颗粒剂混悬液的浓度为0.5g/ml。
[0037]记录:每日观察记录小鼠有无毒性反应和死亡、精神状态、体重变化、食物量及饮用水量的改变，至第7日结束。
[0038]试验结果:灌胃莲威阿那奇颗粒混悬液后，连续观察7天，小鼠无毒性反应和死亡，精神状态良好，进食和饮水量无异常，体重正常增长。莲威阿那奇颗粒平均最大耐受量为:20g小鼠给药2.0ml (0.5g/ml),即一天小鼠剂量为lg/20g=50g/kg，若等量成人体重剂量为3500g/70kg，按照成人70kg颗粒剂一天的用量30计，即相当于成人临床用药量的3500/30~116.67倍。由此可以看出，成人低剂量同样不会出现毒性反应。
[0039]小鼠热板法镇痛实验:以小鼠热板法实验评估莲威阿那奇颗粒的镇痛作用。
[0040]动物分组:昆明种小鼠50只，体重18_22g，雌雄各半，检疫3天无异常后分成阴性对照组、阳性对照组、实验低剂量组、实验中剂量组和实验高剂量组，每组10只。
[0041]给药:各组小鼠禁食12小时后，分别给各组小鼠给药:
阴性对照组:分别给予每只小鼠生理盐水0.2ml灌胃，连续5天；
阳性对照组:分别给予每只小鼠阿司匹林90mg/kg体质量灌胃，连续5天；
实验低剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒2000mg/kg体质量灌胃，连续5天； 实验中剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒4000mg/kg体质量灌胃，连续5天； 实验高剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒8000mg/kg体质量灌胃，连续5天。
[0042]记录:第5天灌药后半小时，将每只小鼠放在预先加热到55°C的金属板上，以舔后足为疼痛反应指标，分别记录每组30min和90min小鼠疼痛的反应时间平均值；90min痛阈提高百分率以下式计算，以上平均结果()进行显著性检验(t检验)。
[0043]结果:结果见表6，由表6可以看出，莲威阿那奇颗粒各组均可不同程度的提高痛域值，莲威阿那奇颗粒的中剂量和大剂量组的镇痛效果较阿司匹林组好，说明莲威阿那奇颗粒具有较好的镇痛作用。
[0044]小鼠足跖肿胀实验:以小鼠足跖肿胀实验评估莲威阿那奇颗粒的抗炎作用。
[0045]动物分组:昆明种小鼠50只，体重18g至22g，雌雄各半，检疫3天无异常后分成阴性对照组、阳性对照组、实验低剂量组、实验中剂量组和实验高剂量组，每组10只。
[0046]给药:各组小鼠禁食12小时后，分别给各组小鼠给药:
阴性对照组:分别给予每只小鼠生理盐水0.2ml灌胃，连续5天；
阳性对照组:分别给予每只小鼠醋酸泼尼松5mg/kg体质量灌胃，连续5天；
实验低剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒2000mg/kg体质量灌胃，连续5天； 实验中剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒4000mg/kg体质量灌胃，连续5天；实验高剂量组:分别给予每只小鼠莲威阿那奇颗粒8000mg/kg体质量灌胃，连续5天。
[0047]记录--第5天灌药后半小时，于小鼠左右足跖腱膜下注射1%角叉菜胶0.04ml致炎，5小时后从踝关节处对称剪下小鼠足跖并称重，以左右足跖重量差作为小鼠足跖肿胀度，并记录各组小鼠足跖肿胀度平均值，通过下式计算出肿胀度和肿胀抑制率平均值，并且各组平均结果()进行显著性检验(t检验)。
[0048]肿胀度(mg)=左后足跖重量一右后足跖重量
结果:结果见表7，由表7可以看出，莲威阿那奇颗粒各组均可不同程度的减轻角叉菜胶所致的小鼠足跖肿胀，说明莲威阿那奇颗粒具有抑制急性炎症的作用。
[0049]观察莲威阿娜奇颗粒对大鼠骨关节软骨细胞凋亡的影响
4.1、软骨细胞的常规培养:将大鼠原代软骨细胞接种于Coming塑料培养瓶，并置于DMEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清，100KU/L青霉素和100mg/L链霉素)，置37°C、体积分数为5% C02饱和湿度条件下培养，培养过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞的生长状况，首次换培养液间隔72 h，以后每间隔48 h更换新鲜培养液，一般I周左右形成细胞单层。细胞生长至亚融合状态时，用胰蛋白酶消化法做传代接种，取对数生长期细胞用于实验。[0050]法测定连威阿娜奇颗粒对大鼠软骨细胞增殖的影响:取对数生长期的软骨细胞，用2.5g/L的胰蛋白酶消化，含体积分数10%胎牛血清的培养液调成5X IO4个的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200uL，在37°C、体积分数为5% CO2饱和湿度条件下培养24h，待细胞贴壁后，更换无胎牛血清的培养基培养24h，使细胞同步化。
[0051]分组:软骨细胞根据处理因素不同分为阴性对照组、脂多糖损伤对照组、莲威阿娜奇颗粒低剂量组、莲威阿娜奇颗粒中剂量组和莲威阿娜奇颗粒高剂量组。
[0052]给药:阴性对照组不加任何处理因素，脂多糖损伤对照组在培养液中加入终浓度为20 ug/ml的脂多糖200 UL0
[0053]莲威阿娜奇颗粒低剂量组在培养液中预加入终浓度为20 ug/mL的莲威阿娜奇颗粒100 uL，60 min后加入终浓度为20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0054]莲威阿娜奇颗粒中剂量组在培养液中预加入终浓度为lOOug/mL的莲威阿娜奇颗粒100 uL，60 min后加入终浓度为20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0055]莲威阿娜奇颗粒高剂量组在培养液中预加入终浓度为500ug/mL的莲威阿娜奇颗粒100 uL，60 min后加入终浓度为20 ug/ml的脂多糖100 uL。
[0056]记录:每组观察点设6个复孔，培养24h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20 uL，在37°C、体积分数为5% C02饱和湿度条件下孵育4h，弃去上清液，每孔加入150 uL DMS0，振荡混匀使蓝紫色结晶物溶解后，以空白对照孔调零，用酶标仪于570 nm测定吸光度比值。测定结果平均值见表8。
[0057]结果:测定结果见表8，由表8可以看出，莲威阿娜奇颗粒对大鼠软骨细胞增殖的影响:与阴性对照组相比，脂多糖损伤对照组细胞增殖量明显降低，且差异有显著统计学意义(P〈0.01)，不同剂量的莲威阿娜奇颗粒可促进软骨细胞增殖，与脂多糖损伤对照组比较，差异有显著统计学意义(P〈0.01)，与阴性对照组比较，莲威阿娜奇颗粒高剂量组促进软骨细胞增殖作用明显，且差异有显著统计学意义(p〈0.01 )。
[0058]因此，莲威阿娜奇颗粒针对骨关节软骨细胞破坏及炎症有较好的效果，并且具有一定的镇痛效果，能够用于治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症疾病。
[0059]以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
【权利要求】
1.一种莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用。
2.根据权利要求1所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于莲威阿娜奇颗粒按下述制备方法得到: 第一步，按重量份计分别称取骨碎补8份至12份、土鳖虫1份至5份、雪莲7份至11份、肉苁蓉13份至17份、威灵仙13份至17份、仙灵脾8份至12份、鸡血藤8份至12份、阿纳齐根8份至12份、桑椹13份至17份、鹿衔草13份至17份、透骨草8份至12份和生白术13份至17份； 第二步，将所需量的雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾和鸡血藤混合在一起作为醇提药材，向醇提药材中加入质量是醇提药材质量12倍的体积浓度为70%的乙醇水溶液在溶液沸腾状态下进行醇提，提取2次，每次2.5h，醇提后得到醇提液和醇提药渣，将醇提液在压力为-0.098MPa、温度为50°C至60°C条件下减压浓缩成常温下相对密度为1.30至1.35的稠膏； 第三步，对所需量的生白术进行提取挥发油并分别得到挥发油、白术药液和干药渣，然后向挥发油中加入质量是挥 发油质量8倍的β -环糊精，在20°C条件下搅拌Ih得到包合物； 第四步，将所需量的阿纳齐根、桑椹、鹿衔草、透骨草和醇提药渣以及干药渣混合在一起作为水提药材，向水提药材中加入质量是水提药材质量12倍的纯水在水沸腾状态下进行水提，提取3次，每次2小时，水提后得到水煎液，将水煎液在压力为-0.098MPa、温度为70°C至80°C条件下减压浓缩成每Iml药液中含有0.2g生药的水提药液，将水提药液和白术药液混合在一起后冷却至室温，接着向其中加入体积浓度为95%的乙醇水溶液至混合液的体积含醇量达到80%，室温下放置I小时后，密封于4°C冰箱，冷藏24小时，然后进行抽滤，抽滤后得到的滤渣即为粗多糖； 第五步，将稠膏和粗多糖混合在一起后在压力为-0.08MPa、温度为60°C条件下干燥6小时得到浸膏粉，将所需量的骨碎补和土鳖虫打成150目至200目的细粉，分别称取质量是浸膏粉质量10%的微晶纤维素细粉和质量是浸膏粉质量0.5%的羧甲基纤维素钠，将细粉、微晶纤维素细粉、羧甲基纤维素钠和浸膏粉混合均匀，然后向其中加入体积浓度为70%的乙醇水溶液得到手握成团、轻按即散的软材，接着过16目筛网制粒，过筛颗粒在温度为60°C条件下进行干燥得到干颗粒，将干颗粒和包合物混匀后得到莲威阿那奇颗粒剂。
3.根据权利要求2所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第二步中，将雪莲、肉苁蓉、威灵仙、仙灵脾、鸡血藤粉碎至能过I号筛后，再进行醇提。
4.根据权利要求2或3所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第三步中，用挥发油提取器或挥发油提取罐提取所需量的生白术中的挥发油。
5.根据权利要求2或3所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于先将挥发油用等体积的无水乙醇稀释均匀得到挥发油稀释液，然后将所需量的环糊精溶于水并加热溶解成环糊精水溶液、冷却后得到环糊精饱和溶液，接着在20°C条件下将挥发油稀释液与β -环糊精饱和溶液混合在一起搅拌lh，冷藏至少24小时后，用30°C至60°C的石油醚将滤渣洗涤三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小时得到包合物。
6.根据权利要求4所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于先将挥发油用等体积的无水乙醇稀释均匀得到挥发油稀释液，然后将所需量的(6-环糊精溶于水并加热溶解成(6-环糊精水溶液、冷却后得到(6-环糊精饱和溶液，接着在20°C条件下将挥发油稀释液与3 -环糊精饱和溶液混合在一起搅拌lh，冷藏至少24小时后，用30°C至60°C的石油醚将滤渣洗涤三次后，置于真空干燥箱于30°C干燥4小时得到包合物。
7.根据权利要求2或3所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一起再进行水提。
8.根据权利要求4所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一起再进行水提。
9.根据权利要求5所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一起再进行水提。
10.根据权利要求6所述的莲威阿娜奇颗粒在制备治疗骨关节软骨细胞破坏及炎症药物的应用，其特征在于第四步中，将阿纳其根、桑椹、鹿衔草、透骨草剪碎成绿豆大小的颗粒状后和醇提药渣以及干药渣混合在一`起再进行水提。
【文档编号】A61P19/02GK103735649SQ201310543923
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】耿东升, 金小越, 张宏涛, 王宁 申请人:中国人民解放军新疆军区联勤部药品仪器检验所, 新疆医科大学第六附属医院