siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途
【专利摘要】本发明涉及siRNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途。所述的siRNA分子组合物包含：核苷酸序列含有a）5′-ccccggaggugauuuccaucuacaa-3′，5’-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3’的siRNA分子，和核苷酸序列含有b）5′-gucuuuggucuggugccuggucuga-3′，5’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’的siRNA分子。本发明证实上述siRNA分子组合物可以促进体外的增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，还对动物模型中的增生性瘢痕具有良好的治疗效果。
【专利说明】S i RNA分子组合物及其在治疗增生性瘢痕中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和基因治疗【技术领域】，具体地说，是siRNA分子在治疗增生性瘢痕中的用途。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最大器官，具备防护、免疫、排泄等功能，其中最为重要的功能是防护、维持体内环境的稳态。当皮肤的完整性受到较大破坏时，体内的稳态出现不平衡，外界侵袭因子容易进入体内，直接威胁到个体的生存。在物种进化的过程中，出现了创口的瘢痕愈合模式,这种愈合方式能最快地恢复皮肤的完整性,大大提高了物种的生存机率。因此,瘢痕是人体皮肤创口愈合不可或缺的产物。
[0003]但在创口愈合的过程中常常发生瘢痕的过度生长，形成增生性瘢痕，影响功能和外观。据文献报道，40%-70%的外科手术术后患者以及91%的烧伤患者愈合后形成增生性瘢痕，整形外科门诊通常有超过半数的患者因瘢痕就诊。目前对于增生性瘢痕的治疗方法包括手术方法和非手术方法，但都存在一定的局限性。如何改善、治疗增生性瘢痕，一直是整形外科医生关注的课题，同时也是大众关心的问题。
[0004]增生性瘢痕病因主要包括创口张力过大、感染等。增生性瘢痕形成的机制包括成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化、成纤维细胞的增殖、过度血管化、细胞胶原分泌增加以及细胞外基质过度堆积。在增生性瘢痕形成的机制研究中，对TGF-β (转化生长因子-β)的研究最多。在TGF-β的三个亚型中，TGF-β I与增生性瘢痕的形成关系最为密切，TGF-β I参与了成纤维细胞向肌 成纤维细胞转化，并促进细胞分泌胶原和组织血管化。已有诸多的实验报道，抑制TGF-β I的表达可以减轻增生性瘢痕。C0X-2 (环氧合酶-2)是PGE (前列腺素Ε)的前体酶，PGE是炎症反应的重要因子，对血管新生有促进作用。同时TGF-β I和C0X-2对于创口愈合过程当中的上皮间质转换都有一定的促进作用。目前关于C0X-2在治疗增生性瘢痕中的研究较少，关于TGF-β I和C0X-2之间的作用也鲜有报道。
[0005]中国专利文献CN201010260249.8，申请日2010.08.24，发明名称为“促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA即应用”，公开了促进皮肤伤口无疤痕愈合的siRNA分子、靶向多个伤口无疤痕愈合相关基因的多个siRNA分子的鸡尾酒组合、以siRNA分子或者其鸡尾酒组合作为有效成分的药物组合物，通过细胞实验以及小鼠和猪皮肤创伤模型证明了该药物组合物可以促进因外伤、外科手术或糖尿病皮肤溃疡等造成的皮肤伤口达到无疤痕愈合，其中siRNA分子可以靶向那些造成伤口病理性修复或不良反应的基因，siRNA双链有不同的长度和不同的末端，可以靶向人、小鼠及猪细胞同一基因的同源序列，鸡尾酒组合中的多个siRNA能同时抑制伤口炎症和血管再生的各种相关基因，药效更显著，药物组合物中组氨酸-赖氨酸聚合物、树枝状聚合物或脂质体等药物载体能以纳米颗粒的形式增强siRNA导入皮肤组织。但是该文献公开的是将siRNA应用于创口在愈合过程中促进愈合并减少疤痕形成，创口治疗和已形成的瘢痕治疗是完全不同的两个概念，涉及不同的生理过程，而目前关于用siRNA来治疗已形成的增生性瘢痕还未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种siRNA分子组合物。
[0007]本发明另一的目的是，提供上述SiRNA分子组合物的用途。
[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是: siRNA分子组合物,所述的siRNA分子组合物包含:
核苷酸序列含有 a) 5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3',
5，-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3，的 siRNA 分子，和 核苷酸序列含有 b) 5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3',
5，-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3，的 siRNA 分子。
[0009]优选地，所述的siRNA分子组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0010]优选地，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。
[0011]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的siRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕的药物中的用途。
[0012]所述的治疗增生性瘢痕是指治疗已形成的增生性瘢痕，优选地，所述的治疗增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕的体积。
[0013]本发明优点在于:
本发明应用TGF-β I和C0X-2联合`siRNA方法，对体外的增生性瘢痕成纤维细胞进行TGF-β I和C0X-2表达的敲低，可以达到促进增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的效果；此外，在动物模型中，证实TGF- β I和C0X-2联合siRNA对增生性瘢痕的消退具有良好的治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是体外实验中瘢痕成纤维细胞的镜下形态。
[0015]图2是体外实验基因沉默效应检测中目的基因TGF- β 1、C0X-2mRMA表达情况。
[0016]图3是体外实验细胞增殖周期检测结果。
[0017]图4是体外实验基因沉默效应检测中相关目的基因a -SM, Col Ial、Col3almRMA表达情况。
[0018]图5是体外实验a -SMA免疫荧光染色结果。
[0019]图6是体外实验Annexin V/PI流式细胞凋亡检测结果。
[0020]图7是体外实验瘢痕成纤维细胞的扫描电镜图。
[0021]图8是体外实验瘢痕成纤维细胞的透射电镜图。
[0022]图9是体外实验细胞上清羟脯氨酸含量检测结果。
[0023]图10是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织块大体形态结果。
[0024]图11是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织块体积测量结果。
[0025]图12是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织中目的基因TGF- β 1、C0X-2、α-SMA、Collal 的表达情况。
[0026]图13是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织HE染色结果。
[0027]图14是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织Masson三色染色结果O[0028]图15是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织VEGF免疫组化染色结
果O
[0029]图16是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织⑶31免疫组化染色结
果O
[0030]图17是体内实验人增生性瘢痕组织块植入模型的瘢痕组织内羟脯氨酸含量检测检测结果。
[0031]图18中左图是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织块拍照结果，右图是瘢痕组织块体积测量结果。
[0032]图19是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织中目的基因TGF-β 1、C0X-2、a -SM, Collal的表达情况。
[0033]图20是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织HE染色结果。
[0034]图21是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织Masson三色染色结果。
[0035]图22是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织VEGF免疫组化染色结果。
[0036]图23是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织CD31免疫组化染色结果。
[0037]图24是体内实验裸鼠背部植皮模型的瘢痕组织内羟脯氨酸含量检测结果。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0039]实施例1 I实验材料
1.1 SiRNA有效成分
TGF- β I siRNA 分子:正义链:5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3'，反义链:5，_uuguagauggaaaucaccuccgggg-3J ；
COX-2 siRNA 分子:正义链:5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3'，反义链 A’-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3’ ；
药物载体:缩氨酸(HKP)，组氨酸和赖氨酸的聚合物；
STP705 (siRNA鸡尾酒):将上述TGF-β I siRNA分子、COX-2 siRNA分子和HKP形成纳米颗粒，其中TGF-βΙ siRNA分子、COX-2 siRNA分子拷贝数比例为1:1，两种siRNA分子与HKP的重量比为1:4。治疗时以20μ g/ml的siRNA浓度进行局部病灶注射。
[0040]以上药物由苏州圣诺生物有限公司提供。
[0041]1.2 抗体
兔抗人 α _ 肌动蛋白(α _SMA, alpha smooth muscle Actin)单克隆抗体(ab5694,Abeam, 1wa，USA)，免疫组化染色一抗稀释比例1:200，免疫荧光染色一抗稀释比例1:100 ；兔抗人I型主要组织相容性抗原(human MHC class I)单克隆抗体(cat.#1913-1,Epitomics, California, USA),免疫组化染色一抗稀释比例1:250 ；
兔抗人CD31单克隆抗体(ab38264，Abeam, 1wa, USA)，免疫组化染色一抗稀释比例
1:50ο ；
兔抗人血管内皮生长因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)单克隆抗体(cat.#1909-1，Epitomics，California，USA)，免疫组化染色一抗稀释比例 1: 50。[0042]1.3 Q-PCR 用引物
【权利要求】
1.SiRNA分子组合物，其特征在于，所述的SiRNA分子组合物包含: 核苷酸序列含有 a) 5' -ccccggaggugauuuccaucuacaa-3', 5，-uuguagauggaaaucaccuccgggg-3，的 siRNA 分子，和 核苷酸序列含有 b) 5' -gucuuuggucuggugccuggucuga-3', 5，-ucagaccaggcaccagaccaaagac-3，的 siRNA 分子。
2.根据权利要求1所述的siRNA分子组合物，其特征在于，所述的siRNA分子组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
3.根据权利要求2所述的siRNA分子组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体选自组氨酸和赖氨酸的聚合物。
4.权利要求1-3任一所述的siRNA分子组合物在制备治疗增生性瘢痕的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的治疗增生性瘢痕是指消退已形成的增生性瘢痕或减小已形成的增生性瘢痕的体积。
【文档编号】A61K48/00GK103642800SQ201310577630
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】周佳, 刘凯, 黄晓璐, 李青峰 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院