冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法
【专利摘要】冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法，将蔗糖及右旋糖酐40各自加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，115℃0.09-0.10MPa下蒸汽灭菌45min；将甘氨酸加入到15～30℃注射用水中，搅拌使其完全溶解，使用0.22μm的微孔滤膜除菌过滤；根据测定的前期疫苗原液的蛋白质含量或抗原含量，按总蛋白质含量不高于80μg/剂进行配制，加入终浓度为4～10wt%蔗糖、1～4wt%右旋糖酐40、0.5～2wt%甘氨酸，即为半成品；将半成品分装并半压塞后入冻干机箱体内、设定冻干参数，进行冷冻干燥；预冻、抽真空、升华、解析干燥，真空压塞，冻干结束，制得冻干人用狂犬病疫苗。本发明提供的疫苗可以很好地保护其有效成分、热稳定性强、有效期至少可以达到24个月。
【专利说明】冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗生产领域。尤其涉及一种人用狂犬病疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]现有的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的液体剂型，系用狂犬病病毒固定毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、浓缩、灭活、纯化后，加入适宜的稳定剂制成。为无色澄明液体。液体剂型有效期短，仅12个月，产品质量也不稳定，且含有防腐剂硫柳汞钠。
【发明内容】
[0003]为解决现有技术中存在的问题，本发明提供可以很好的保持疫苗有效成分的、热稳定性强的、且疫苗的有效期至少可以达到24个月以上的冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法。
[0004]为达到上述目的，发明人将冷冻干燥保护剂以一定比例加入到纯化的前期疫苗原液中混匀分装，按照适宜的冻干曲线进行冷冻干燥；通过冷冻干燥工艺可以将制剂预先冻结成固体，然后在真空条件下使其中的水分升华出来，从而将有效成分保留在冻结的骨架中。
[0005]本发明更具体的技术方案如下:
[0006]冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0007]a.冻干保护剂的配制`
[0008]将蔗糖及右旋糖酐40各自加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，115°C 0.09-0.lOMPa下蒸汽灭菌45min ;将甘氨酸加入到15~30°C注射用水中，搅拌使其完全溶解，使用0.22 μ m的微孔滤膜除菌过滤；
[0009]b.半成品配制
[0010]根据测定的前期疫苗原液的蛋白质含量或抗原含量，按总蛋白质含量不高于80 μ g/剂进行配制,加入终浓度为4~10wt%鹿糖、1~4wt%右旋糖酐40、0.5~2wt%甘氨酸，即为半成品；
[0011]C.成品的制备
[0012]3.1将半成品分装并半压塞后入冻干机箱体内、设定冻干参数，进行冷冻干燥；
[0013]3.2预冻阶段:降温至样品温度达_45°C以下，保温2~4小时；
[0014]3.3抽真空阶段:冷凝器温度降至_45°C以下时，启动真空泵，冻干箱压力控制在30Pa以内；
[0015]3.4升华阶段:搁板温度控制在-50~-10°C、样品温度控制在_45~_25°C，干燥12~18小时；
[0016]3.5解析干燥阶段:升华结束后，将样品温度上升至20~30°C，升温时间约4~6小时，保温时间8~12h，真空状态下压塞，冻干结束，制得冻干人用狂犬病疫苗。
[0017]上述的冻干机可以选用任意一种本领域普通技术人员所公知的型号，优选的选用冻干机型号为:Lyo-l (SIP、CIP)，生产厂家为上海东富龙科技有限公司。
[0018]本发明同时要求保护按照上述方法所制得的冻干人用狂犬病疫苗本身。
[0019]本发明的有益效果是:利用本发明所用方法制得的冻干人用狂犬病疫苗，可以很好的保持疫苗的热稳定性和效价，有效期可以达到24个月以上。且无需使用含硫柳汞钠等防腐剂，安全无毒。
【具体实施方式】
[0020]本发明共16个实施例。实施例1-8采用同一批的前期疫苗原液；实施例9-16采用另一批前期疫苗原液。
[0021]冻干机的型号可以使用本领域普通技术人员所公知的冻干机，但作为实施例，发明人使用的冻干机型号为:Lyo-l (SIP、CIP)，生产厂家为上海东富龙科技有限公司。
[0022]作为公知技术，前期疫苗原液的制备按本领域普通技术人员所公知的制备液体制剂时制备前期疫苗原液的方法制备即可。但作为实施例，发明人使用的原液制备方法具体如下:
[0023]1)细胞制备
[0024]选用12~14日龄的健康地鼠，无菌操作下取肾，150~160只地鼠肾集中于一个容器内，剪碎，0.125%的胰蛋白酶溶液4~6°C消化18小时后用细胞生长液制成细胞悬液，分种3L瓶中，每瓶300~400ml，置37°C培养；
[0025]2 )培养液
[0026]细胞生长液为含7.5%新生牛血清、37.5%199培养基、硫酸庆大霉素100单位/ml、
0.25%水解乳蛋白Hanks液。病毒维持液为含37.5%的199培养基、0.13%人血白蛋白、硫酸庆大霉素100单位/ml的Hanks液；
[0027]3)病毒接种和培养
[0028]地鼠肾原代细胞培养4天后，弃去培养液，用PBS冲洗去除新生牛血清，加入600~700ml细胞维持液，将毒种按0.01~0.1M0I接种，置33~35°C培养；
[0029]4)病毒收获
[0030]培养5天后，收获一次病毒液；根据细胞生长情况，重新加入新配制的病毒维持液500~600ml，4天后收获二次病毒液；再根据细胞生长情况，重新加入新配制的病毒维持液400~600ml，3天后收获三次病毒液；
[0031]5)合并及超滤、浓缩
[0032]将检定合格的多瓶多次病毒收获液在严格无菌操作下合并，用30万分子量的超滤膜超滤、PBS清洗，浓缩至适宜的蛋白质含量范围；
[0033]6)病毒灭活
[0034]每1000ml超滤浓缩液按终浓度1/4000，加10%的β -丙内酯溶液2.5ml，充分摇匀，置4°C 24小时，置37°C 2小时水解；
[0035]7)纯化
[0036]病毒灭活液经Sepharose4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化，每次上样量800~1500ml。根据紫外监测峰形，及时收取目的峰，杂蛋白去除率不低于99%，加入终浓度为1%的人血白蛋白作稳定剂，即为原液。[0037]实施例1
[0038]a.冻干保护剂的配制
[0039]将蔗糖及右旋糖酐40各自加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，115°C0.09MPa下蒸汽灭菌45min ;将甘氨酸加入到30°C注射用水中，搅拌使其完全溶解，使用0.22 μ m的微孔滤膜除菌过滤；
[0040]b.半成品配制
[0041]根据测定的前期疫苗原液的蛋白质含量或抗原含量，按总蛋白质含量不高于80 μ g/剂进行配制，加入蔗糖、右旋糖酐40、甘氨酸，即为半成品；
[0042]c.成品的制备
[0043]3.1将半成品分装并半压塞后入冻干机箱体内、设定冻干参数，进行冷冻干燥；
[0044]3.2预冻阶段:降温至样品温度达_45°C以下，保温2~4小时；
[0045]3.3抽真空阶段:冷凝器温度降至_45°C以下时，启动真空泵，冻干箱压力控制在30Pa以内；
[0046]3.4升华阶段:搁板温度控制在-50~-10°C、样品温度控制在_45~_25°C，干燥12~18小时；
[0047]3.5解析干燥阶段:升华结束后，将样品温度上升至20~30°C，升温时间约4~6小时，保温时间8~12h，真空状态下压塞，冻干结束，制得冻干人用狂犬病疫苗。
[0048]实施例1-8的制备唯一不同之处在于保护剂的成分配比。其具体配比和效果如下表 1-1:
[0049]见表1-1
[0050]
【权利要求】
1.冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤:a.冻干保护剂的配制将蔗糖及右旋糖酐40各自加入到注射用水中，搅拌至完全溶解，115°C 0.09-0.lOMPa下蒸汽灭菌45min;将甘氨酸加入到15~30°C注射用水中，搅拌使其完全溶解，使用0.22 μ m的微孔滤膜除菌过滤；b.半成品配制根据测定的前期疫苗原液的蛋白质含量或抗原含量，按总蛋白质含量不高于80 μ g/剂进行配制，加入终浓度为4~10wt%鹿糖、1~4wt%右旋糖酐40、0.5~2wt%甘氨酸，即为半成品；c.成品的制备3.1将半成品分装并半压塞后入冻干机箱体内、设定冻干参数，进行冷冻干燥；3.2预冻阶段:降温至样品温度达_45°C以下，保温2~4小时；3.3抽真空阶段:冷凝器温度降至_45°C以下时，启动真空泵，冻干箱压力控制在30Pa以内；3.4升华阶段:搁板温度控制在-50~_10°C、样品温度控制在-45~-25°C，干燥12~18小时；3.5解析干燥阶段:升华结束后，将样品温度上升至20~30°C，升温时间约4~6小时，保温时间8~12h，真空状态下压塞`，冻干结束，制得冻干人用狂犬病疫苗。
2.根据权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于:所述半成品配制步骤中的蔗糖、右旋糖酐40和甘氨酸的加入终浓度为6wt%蔗糖、2wt%S旋糖酐40、lwt%#氨酸。
3.根据权利要求1所述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于:所述的冻干机型号为:Lyo-l (SIP、CIP)，生产厂家为上海东富龙科技有限公司。
4.冻干人用狂犬病疫苗，是按权利要求1所述的方法制备而得，疫苗的有效期至少可以达到24个月以上。
【文档编号】A61K39/205GK103690943SQ201310690235
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】赵平, 徐德启, 蒋世鹏, 于化鹏, 董晓丽, 辛晓伟, 王文雯, 封雪 申请人:大连汉信生物制药有限公司