皮肤共生益生元剂和包含其的组合物的局部使用的制作方法

皮肤共生益生元剂和包含其的组合物的局部使用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于改善皮肤微生物组的健康状态、从而潜在地改善皮肤的状况和/或外观的皮肤共生益生元的局部使用，以及包含该皮肤共生益生元的局部化妆品组合物。所述局部化妆品组合物可包含皮肤病学可接受的载体和有效量的益生元，并且可与一种或多种口服的或局部的益生元、益生菌和/或益生菌裂解物一起使用。
【专利说明】皮肤共生益生元剂和包含其的组合物的局部使用

【技术领域】
[0001] 本文的组合物和方法一般地涉及针对皮肤共生微生物的益生元剂的使用。更具体 地，本文的组合物和方法涉及局部施用的益生元剂。

【背景技术】
[0002] 大多数人的皮肤和胃肠道（"GI"）定植着大量各种不同类的微生物。定植一般开 始于出生后不久，当婴儿暴露于母亲的微生物区系和通常导致向先前无菌的人类胎儿的定 植的其他环境事件时。从初始的定植时起，人类的微生物组保持不断变化的状态，其中常驻 微生物区系的组成响应于对宿主而言内在和外在的因素而随着时间变化。一般来讲，定植 于人类宿主的微生物可被划分为三个不同的类别。（1)零星驻留并通常不增殖的那些，（2) 可增殖并与宿主在一起（例如，在皮肤上或在胃肠道中）相对短时期的那些，和（3)可永久 性地定植于宿主的那些。
[0003] 已经认识到，宿主的健康状态至少部分地依赖于宿主的微生物组的健康状态。例 如，通常存在于人类胃肠道的某些微生物提供的健康有益效果已被很好地研究。相似地，不 健康的或不平衡的胃肠道微生物组的不可取的效应也是为人们所熟知的。有关宿主的健康 状态和宿主的胃肠道微生物组的健康状态之间关系的知识，已产生了市场定位于改善或维 持人类胃肠道微生物组中的一个或多个成员的健康状态的多种可商购获得的产品。这些可 商购获得的产品一般被分类为益生菌、益生元或合生元。益生菌是所谓的"好"微生物（通 常为细菌），其活着被人摄入，使得所引入的微生物能够定植在此人的胃肠道中。常规的益 生元是可摄取的成分，其选择性地支持有利地存在于胃肠道中的"好"微生物的生长或生 存。常规的益生元通常是能够被胃肠道微生物组中的一个或多个成员吸收、但不能被人类 宿主消化的营养物质来源（例如，低聚果糖或低聚半乳糖）。合生元是益生元和益生菌的混 合物。合生元的益生元部分向合生元的益生菌部分提供合适的营养物质来源，这据信提高 了益生菌存活和定植的可能性。
[0004] 不久前，关注转向了存在于人类皮肤上的微生物区系，以更好地了解驻留的微生 物区系的健康状态和宿主的健康状态之间的关系。不出意料地，已经发现健康平衡的皮肤 微生物组能够向人类宿主提供健康和/或美容有益效果，例如，通过刺激人类的免疫系统 和/或产生定向减少不希望的微生物的定植的抗微生物物质。另一方面，破坏皮肤微生物 区系的微妙平衡的扰动可以为宿主和/或微生物区系带来不可取的后果。例如，与痤疮丙 酸杆菌的增殖相关联的游离脂肪酸副产物的增产可促进粉刺的发展。就所存在的微生物 的类型和多样性两者而言，人类皮肤微生物组的组成与胃肠道微生物组的组成是显著不同 的。因此，毫无意外的是，至少部分地由于两种微生物组存在于其中的显著不同的环境和可 供用作食物的底物，胃肠道和皮肤微生物组的成员可利用不同的营养物质来源。
[0005] 为人们所熟知的是，微生物的饮食需求从一个物种到另一个可显著地不同，并且 对于在特定微生物上表现出益生元活性的试剂，在不同的微生物上表现出无益生元活性是 并不稀奇的。例如，被设计用于胃肠道微生物区的益生元历史上是基于碳水化合物的材料， 其作为食物用于驻留的糖分解驱动的微生物。但存在于人的皮肤上的微生物区系能够包括 亲脂的生物，其不一定能被预期吸收碳水化合物。甚至可存在于皮肤上的糖分解的微生物 也可能不利用与胃肠道微生物相同种类的碳水化合物，因为存在于皮肤上的微生物一般不 暴露于与胃肠道中的微生物相同种类的碳水化合物。
[0006] 尽管可能毫无意外的是，人类的胃肠道和皮肤微生物组的组成可显著地不同，也 许更加令人意外的是相同微生物组的组成在个体之间也能够存在显著的变异度这一发现。 提供健康、平衡的皮肤微生物组的健康和美容有益效果直到最近才被较好地了解。因此，仅 鉴定了有限数量的合适的益生元剂用于皮肤上的使用。此外，常规的益生元剂通常是口服 施用的，例如，作为营养补充剂方案的部分。虽然口服摄取可能适于向胃肠道递送益生元 齐IJ，它可能不是向存在于皮肤上的微生物区递送益生元的最佳途径。
[0007] 因此，存在通过提供在一种或多种皮肤共生微生物上表现出益生元活性的试剂来 改善人类皮肤的健康状态和/或外观的需求。还存在对于向皮肤共生微生物递送益生元剂 的改善的机制的需求。


【发明内容】

[0008] 为了提供对上述问题中的一个或多个的解决，本文公开了用于改善皮肤的状况和 /或外观的方法。所述方法包括向皮肤局部施用化妆品组合物。所述化妆品组合物包含皮 肤病学可接受的载体和低聚半乳糖。

【专利附图】

【附图说明】
[0009] 图1示出了示例性的微生物组群体分布。
[0010] 图2示出了基于体外测试，随着时间进程对测试试剂的微生物ATP响应。
[0011] 图3示出了基于体外测试，随着时间进程对测试试剂的细菌计数响应。
[0012] 图4示出了基于体外测试，对不同含量的测试试剂的微生物ATP响应。
[0013] 图5示出了基于体外测试，对不同含量的测试试剂的细菌计数响应。
[0014] 图6示出了基于体内测试，对测试试剂的需氧微生物的细菌计数响应。
[0015] 图7示出了基于体内测试，对测试试剂的厌氧微生物的细菌计数响应。
[0016] 图8示出了对多种组合物的体外的细菌ATP响应。
[0017] 图9显示了就体内研究而言的测试计划表的一部分。
[0018] 图10示出了测试区域在人的前臂上的示例性位置。

【具体实施方式】
[0019] 定义
[0020] "化妆品组合物"是指适于局部施用于哺乳动物皮肤和/或诸如毛发和指/趾甲的 角质组织上的组合物，其旨在改善所述皮肤或角质组织的状况和/或外观，或以其他方式 提供护肤有益效果。局部是指皮肤或其他角质组织的表面。化妆品组合物包括任何有色化 妆品、指/趾甲、或护肤产品。"护肤"是指调节和/或改善皮肤状况。护肤有益效果的一 些非限制性例子包括通过提供更光滑、更均匀的外观和/或感觉来改善皮肤外观和/或感 觉；增加皮肤的一个或多个层的厚度；改善皮肤的弹性或回弹力；改善皮肤的紧致度；和减 少皮肤的油性的、有光泽的、和/或无光泽的外观、改善皮肤的水合状态或保湿状态、改善 细纹和/或皱纹的外观、改善皮肤肌理或光滑性、改善皮肤剥落或脱屑、使皮肤丰满、改善 皮肤屏障性能、改善皮肤色调、减少红色或皮肤斑点的外观、和/或改善皮肤的亮度、光彩、 或半透明性。化妆品组合物的一些非限制性例子包括在面部留下颜色的产品，例如粉底、睫 毛膏、遮瑕膏、眼线膏、眉彩、眼影、腮红、唇膏、润唇膏、化妆底粉、固体乳液粉盒等。"护肤产 品"包括但不限于护肤霜、保湿剂、洗剂、和沐浴露。
[0021] "皮肤病学可接受的载体"是指可局部施用于皮肤或角质组织的载体。皮肤病学可 接受的载体可以是很多种形式，例如，简单溶液（水基或油基的）、固体形式（凝胶或棒状 物）和乳液（油包水或水包油）。
[0022] "有效量"是指在指定条件下足够具有指定特性的指定组分的量。例如，益生元的 有效量是指足够在体外和/或体内导致一种或多种所选择的微生物的代谢物含量和/或细 菌计数的所期望的增加的量。
[0023] "胃肠道微生物"或"GI微生物"是定植（S卩，生活和繁殖）在人类消化道中的原 核生物和/或真核生物。
[0024] "增加"是指高于基础含量或与对照相比的增加。例如，可以测定基础含量以用于 体内研究，而对照被用于体外测试。
[0025] "代谢"是指在微生物内发生的任何化学反应。代谢包括合成代谢，即生物分子的 合成（例如蛋白质合成和DNA复制），和分解代谢，即生物分子的裂解。
[0026] "微生物裂解物"是指产生自微生物裂解的细胞组分和试剂的混合物。"裂解"涉 及通过处理（例如，化学的、生物学的、机械的、或热的处理）使细胞的细胞壁和/或细胞膜 破裂，导致该细胞的生物学组分的一些或全部的释放的动作。
[0027] "微生物体"和"微生物"是同义的，是指细菌、真菌、和藻类。
[0028] "基本碳培养基"（"MCM"）是指用于支持微生物的有限生长（即，在24小时期间 菌落形成单位数（"CFU"）小于0. 2对数增长）和/或生存的物质的混合物，在其中碳是限 制性资源。在某些实施例中，MCM可以是液体或凝胶的形式。由于在不同微生物之间基本的 碳需求可能有差别，MCM中存在的碳的量也可以有差别。在某些实施例中，例如，MCM可以完 全不含碳。在某些实施例中，MCM可以基本上不含碳（即，基于培养基的重量计，小于0.001 重量％)。在某些实施例中，MCM可包含0.001%至0.1%的碳。碳的量以存在的碳的摩尔 份数或分子量％被测定。例如，葡萄糖按重量计为40%碳。
[0029] "低聚糖"是指包含少量（例如，二至十）的单糖的糖类聚合物。
[0030] "可口服摄取"是指旨在被置于口中并被吞下的组合物。
[0031] "PCR"是指聚合酶链反应，并且包括实时PCR、定量PCR( "QPCR"）、半定量PCR、以 及它们的组合。
[0032] "益生元"是指能够作为营养物质被所选择的微生物（例如，皮肤共生微生物或胃 肠道微生物）利用、能够诱导所选择的微生物的生长和/或活性、能够诱导所选择的微生物 的复制、能够作为能量源被所选择的微生物利用、和/或能够被所选择的微生物用于生物 分子（即，RNA、DNA、和蛋白质）的制备的任何物质或多种物质的组合。益生元的非限制性 例子包括黏多糖、低聚糖如低聚半乳糖（"G0S"）、多糖、氨基酸、维生素、营养物质前体、收 集的生物体的代谢产物、脂类、和蛋白质。为了确定测试试剂是否在一种微生物上表现出益 生元活性，可能期望将该测试试剂与惰性缓冲液（例如，盐水溶液）或溶剂混合。合适的溶 剂的非限制性例子包括二甲基亚砜（DMSO)、诸如甲醇和乙醇的醇类、和诸如水和培养基的 水性溶液。
[0033] "复制"是指微生物向子细胞的分裂（例如，通过有丝分裂或二分裂）。
[0034] "皮肤"是指表皮、真皮、和下皮（即，皮下组织）、毛囊、毛根、毛球、甲床（爪床）的 腹侧上皮层、皮脂腺和汗腺（外分泌的和顶泌的）中的一种或多种。
[0035] "皮肤共生微生物"是指在体外和/或体内可定植（即，在人类皮肤上生活和繁 殖）或暂时栖息在人类皮肤上的原核生物和真核生物。示例性的皮肤共生微生物包括但 不限于 α 变形菌（Alphaproteobacteria)、β 变形菌（Betaproteobacteria)、γ 变形菌 (Gammaproteobacteria)、丙酸杆菌（Propionibacteria)、棒状杆菌（Corynebacteria)、 放线菌（Actinobacteria)、梭菌（Clostridiales)、乳杆菌（Lactobacillales)、葡 萄球菌（Staphylococcus)、芽抱杆菌（Bacillus)、微球菌（Micrococcus)、链球菌 (Streptococcus)、拟杆菌（Bacteroidales)、黄杆菌（Flavobacteriales)、肠球菌 (Enterococcus)、假单胞菌（Pseudomonas)、马拉色菌（Malassezia)、Maydida、德巴利酵母 (Debaroyomyces)、和隐球菌（Cryptococcus)。
[0036] "局部的"及其变型是指旨在被直接施用于皮肤或其他角质组织的外表面的组合 物。
[0037] 冠词"一个"和"一种"被理解为指所指称的和/或描述的对象的一个或多个。
[0038] 靶标微牛物的诜择
[0039] 哺乳动物皮肤的表面通常包含很多种的微生物，其可以是物种与物种不同的、个 体与个体不同的、和甚至是一个个体的位置与位置不同的。总之，这些微生物形成了微生物 组。健康的皮肤微生物组将大体由皮肤共生微生物的平衡的集合组成。人类宿主的皮肤微 生物组可包含帮助提升宿主皮肤的健康状态和/或外观的多种驻留微生物。但在一些情况 下，某些不期望的微生物如病原性细菌、酵母和真菌可能企图定植在皮肤上。此类微生物的 定植能够扰乱健康的微生物组的平衡。幸运的是，通常（并且有利地）存在于人类皮肤微 生物组中的驻留微生物已进化出多种主动和被动的机制来抑制和/或防止不期望的微生 物在皮肤上定植。被动机制的例子包括针对可被不期望的微生物占据的生态位的竞争，以 及消耗对于不期望的微生物的生长和增殖至关重要的营养物质。就主动的机制而言，合乎 期望的微生物可产生抑制不期望的微生物的增殖、或甚至将它们彻底杀灭的代谢物。除了 对不期望的微生物的抑制之外，还有越来越多的证据表明某些驻留微生物区系影响先天免 疫。例如，已经证明皮肤微生物组的某些成员通过它们对脂类、蛋白质和碳水化合物的代谢 产生有助于维持皮肤的"酸性壳层"的酸。
[0040] 使微生物组保持处于健康、平衡的状态和/或使微生物组回到健康、平衡的状态 的一种方法可以是向某些合乎期望的微生物提供足够的营养物质，以使其兴旺发展，并从 而胜过和/或杀灭不期望的细菌。例如，可能有利的是在人们在它们的日常护肤方案中使 用的组合物中包含一种或多种益生元剂。然而，这并不是一件容易的事，因为人与人之间 微生物的组成的可变性可导致作为有效的益生元适合一个人的皮肤共生微生物的特定的 试剂不适合另一个人。尽管在不同个体的皮肤共生微生物中可观察到广泛的可变性，已 发现的确存在一些共性。例如，已发现杰氏棒状杆菌（Corynebacterium jeikeium("C. jeikeium")）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis( "S.epidermidis")）、和痤疮 丙酸杆菌（Propionibacterium acnes("P.acnes")）以不同的程度以可测量的量存在于人 类的面部和前臂两者上。
[0041] 图1示出了可存在于人的面部和前臂上的类似但不同的微生物群体。图1中示出 的微生物是通过用磷酸盐缓冲盐水（"PBS"）润湿的无菌拭子对皮肤取样而分离的。图1中 示出的QPCR分析利用了从拭子样品分离的DNA。如图1所示，葡萄球菌（Staphylococcus)、 棒状杆菌（Corynebacterium)和丙酸杆菌（Propionibacterium)均存在于所取样的个 体的面部和前臂上。因此，在益生元筛选方法中包括痤疮丙酸杆菌（P.acnes)、葡萄球菌 (Staphylococcus)和棒状杆菌（Corynebacterium)可能对于预测潜在的益生元剂的体内 效应是尤其有用的。图1还示出了丙酸杆菌（Propionibacterium)相较于前臂更常见于面 部，而就棒状杆菌（Corynebacterium)和葡萄球菌（Staphylococcus)而言似乎正好相反。 因此，由于痤疮丙酸杆菌（P.acnes)对前臂和面部微生物组的组成的相应贡献，表现出对 痤疮丙酸杆菌的益生元活性的试剂可能对皮肤健康和/或皮肤微生物组具有显著的影响。 并且表现出对棒状杆菌（Corynebacterium)和葡萄球菌（Staphylococcus)的益生元活性 的试剂可被用于提供特定于前臂和/或具有类似微生物组组成的其他身体区域的靶向皮 肤健康有益效果。
[0042] 就可有利地影响皮肤微生物组和/或皮肤健康的皮肤共生微生物而言，据信杰氏 棒状杆菌（C. jeikeium)、表皮葡萄球菌（S. epidermidis)、和痤疮丙酸杆菌（P. acnes)提供 皮肤健康和/或期望的微生物组有益效果，通过向这些微生物提供具有益生元潜能的化合 物可使它们增加。具体地，已经证明杰氏棒状杆菌（C. jeikeium)产生螯合铁的铁载体。杰 氏棒状杆菌（C. jeikeium)还采用特化的机制来捕集锰，二者均是某些不期望的微生物的 生长所必需的。
[0043] 表皮葡萄球菌（S.印idermidis)据信在刺激皮肤的免疫系统中起着积极作用，例 如，通过影响经Toll样受体("TLR"）信号的角质细胞的先天免疫应答。此外，表皮葡萄球菌 (S. epidermidis)据信占据了宿主细胞上的、还被诸如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的更具毒性的微生物识别的受体。另外，表皮葡萄球菌（S. epidermidis)产生包含 羊毛硫氨酸的抗菌肽（有时被称为细菌素），已知其表现出对某些有害细菌物种的抗菌特 性。此类肽的例子包括：表皮素（epidermin)、epilancin K7、epilancin 15X Pep5、和葡萄 球菌素（staphylococcin) 1580。由表皮葡萄球菌（S. epidermidis)产生的其他肽反作用于 种内和种间的竞争者。上述肽有效地抗金黄色葡萄球菌（Streptococcus aureus)、A组链 球菌（streptococcus)、和酿胺链球菌（Streptococcus pyogenes)。
[0044] 痤疮丙酸杆菌（P. acnes)是共生的、非孢子的、杆状的（棒状的）、革兰氏阳性的细 菌，存在于人体的多种位置，包括皮肤、口、泌尿道和大肠的区域。痤疮丙酸杆菌（P.acnes) 能够消耗皮肤的油并产生诸如短链脂肪酸和丙酸的副产物，这些副产物已知有助于维持健 康的皮肤pH和屏障性能。诸如痤疮丙酸杆菌（P.acnes)的丙酸杆菌还产生细菌素和细菌 素样的化合物（例如，propionicin P1G-1、jenseniin G、propionicins SMI、SM2 T1、和 acnecin)，这些化合物对不期望的产乳酸细菌、革兰氏阴性细菌、酵母、和霉菌是抑制性的。
[0045] 考虑到据信由杰氏棒状杆菌（C. jeikeium)、表皮葡萄球菌（S. epidermidis)、和 痤疮丙酸杆菌（P.acnes)提供的有益的功能，以及它们似乎存在于人的前臂和面部上，对 这些皮肤共生微生物中的一种、两种、或甚至全部提供表现出适当的体内益生元活性的试 剂将是合乎期望的。并且由于至少一些化妆品组合物通常被施用于人的面部、手和/或前 臂，可能有利的是向这些化妆品组合物中掺入促进杰氏棒状杆菌（c. jeikeium)、表皮葡萄 球菌（S. epidermidis)、和/或痤疮丙酸杆菌（P. acnes)的健康状态和/或生存的成分。当 然，应当理解本文所述的益生元活性不限于前述微生物，而是可同样表现出对其他皮肤共 生微生物的适当的益生元活性。
[0046] 益牛元剂
[0047] 微生物，以及实际上全部的生命形式，已进化为在它们的环境中是成功的。生物体 的进化的一个方面是适于利用通常存在于该生物的栖息地的可用的食物源。因此，皮肤共 生微生物倾向于利用通常存在于皮肤上和/或在其内的营养物质来源，而栖息在胃肠道的 微生物倾向于利用通常存在于胃肠道的食物源。例如，存在于大多数人的皮肤上的痤疮丙 酸杆菌（P. acnes)已知消耗皮脂腺中的脂肪酸或由毛囊分泌的皮脂。另一方面，通常存在 于人类胃肠道的双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)能够利用低聚半乳糖（"G0S"） 作为食物源。由于胃肠道中的环境和皮肤上的环境之间的实质差异以及通常存在于各自环 境中的可用的营养物质的实质差异，皮肤共生微生物和胃肠道微生物预期不利用相同的食 物源。
[0048] 诸如G0S的可摄取形式的益生元剂用于改善胃肠道微生物组的健康状态是为人 们所熟知的。如前文所指出的，一般被认为是存在于人类胃肠道中的有益菌种的双歧双歧 杆菌（Bifidobacterium bifidum)已知利用G0S作为食物源。G0S是利用β-半乳糖苷酶的 半乳糖基转移酶活性通常从乳糖产生的包含半乳糖的低聚糖。根据下式，取决于用于制备 其的方法，G0S可包括二、三、四、五、或六糖或这些中的两种或更多种的混合物：
[0049] Glc al-4[P-Gal l-6]n
[0050] 其中 η = 2-5，
[0051] Gal表示半乳糖残基而
[0052] Glc表示葡萄糖残基。
[0053] 在尤其合适的实施例中，G0S可以是混合物的形式，其包含20至35% w/v的二糖、 20至35% w/v的三糖、约15至约25% w/v的四糖、和10至20% w/v的五糖。授予Gibson 等人的美国专利7, 883, 874和授予Tzortzis等人的美国专利8, 030, 049和8, 058, 047各 自公开了 G0S和制备G0S的方法的例子。
[0054] G0S是可以诸如粉末和糖浆的多种形式商购获得的。G0S还可作为成分存在于供 人类和/或动物消耗的销售的食物产品中。G0S的可商购获得的来源的尤其合适的例子是 BIMUN0,可购自Clasado, Inc. (Panama)。据信BIMUN0是G0S、膳食纤维和其他填充成分的 混合物。授予Gibson等人的美国专利7, 883, 874公开了通过双歧双歧杆菌（B. bifidum)的 菌株产生的G0S的合适的例子，该菌株通过半乳糖苷酶活性将乳糖转化为前述的G0S的混 合物。以这种方式产生的G0S被描述为包含至少一种二糖、至少一种三糖、至少一种四糖和 至少一种五糖。尽管G0S是已知的针对胃肠道微生物的益生元剂，G0S通常不以显著量存在 于人类皮肤上。因此，G0S先前尚未被考虑用作针对皮肤共生微生物的益生元。然而，已出 人意料地发现，G0S表现出对至少一些皮肤共生微生物的可取水平的益生元活性。具体地， GOS表现出对杰氏棒状杆菌（C. jeikeium)、表皮葡萄球菌（S.印idermidis)、和痤疮丙酸杆 菌（P.acnes)的益生元活性。
[0055] 尽管前述例子描述了 G0S作为合适的皮肤共生益生元剂，需要理解的是，其他胃 肠道益生元（但不是所有的胃肠道益生元），如下文所详细讨论的，可能适用作皮肤共生益 生元剂。可能适用作皮肤共生益生元的胃肠道益生元的一些非限制性例子包括羟基异亮氨 酸；小麦糊精；阿拉伯半乳聚糖（例如，松木多糖（larch arabinogalactin));柑橘纤维； 豌豆纤维；麦芽糖糊精；低聚果糖（即，果寡糖或"F0S"）；菊粉；菊粉低聚纤维；甘露聚糖水 解产物；葡甘露聚糖水解产物；半乳甘露聚糖；低聚龙胆糖；异麦芽低聚糖；猕猴桃和猕猴 桃衍生化合物（例如，来源于猕猴桃并可购自Vital Foods的ZYACTINASE 45品牌酶复合 物）；甜菜浆；和米糠。
[0056] 要适用作针对皮肤共生微生物的益生元，该组合物或试剂应当促进所述微生物的 生存和/或生长。为了测定测试试剂的益生元潜能，可能有利的是测定因使皮肤共生微生 物暴露于该测试试剂而形成的代谢物。合适的微生物输出包括但不限于细胞裂解时被释放 的诸如ATP、NAD、NADP、NADH、NADPH、cAMP、cGMP、和/或ADP的代谢物的含量。在一些情况 下，可使用可商购获得的基于酶的测定来测量代谢指标。除此之外或作为另外一种选择，可 能有利的是测量微生物的数量和/或浓度的变化（即，增殖），以确定是否表现出益生元活 性。例如，细菌计数（例如，当用适当的平板计数测试测量时）的增加可能足以表明益生元 活性。
[0057] 对于测定益生元活性，体内测试一般是优选的。但此类测试可能是耗时的和高成 本的。常规的体外测试（例如，ATP测定或平板计数）尽管通常比体内测试更快和成本更低， 却可能不提供对体内活性的适当预测。因此，可能有利的是使用复合方法，在其中一种或多 种类型的体外测试被用于预测G0S是否在体内表现出益生元活性，任选地随后是用以确认 此类活性的体内测试。用于确定益生元活性的复合筛选测定和方法的尤其合适的例子公开 于共同待决的美国专利13/672, 163 ;13/672, 192 ;和13/672, 211中，全部由Lanzalaco等 人提交。
[0058] 图2和3示出了基于测试样品的体积计，当以0. 5重量％的量存在时G0S对时间 的体外益生元效应。图2示出了在24小时和48小时相对于水对照组，三种皮肤共生微 生物的ATP产生的百分比变化。图2和3中示出的三种皮肤共生微生物是表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)(显示为"Sepi"）、杰氏棒状杆菌（C. jeikeium)(显示为"Cj"）和痤疮丙 酸杆菌（P. acnes)(显示为"Pacnes"）。如图2所示，在24和48小时，相对于水对照组，全 部三种皮肤共生微生物的ATP产生增加了。ATP含量是按照下文所详述的ATP测试测定的。 图3示出了当在24小时和48小时测量时，相对于水对照组，三种皮肤共生微生物的细菌计 数的百分比变化。细菌计数是通过下文所详述的平板计数测试测量的。如图3所示，相对 于水对照组，细菌计数在24和48小时增加。换句话讲，对于所测试的微生物，G0S在体外 在24和48小时表现出益生元活性。用于产生图2和3所示的数据的测试样品是按照下文 关于起始培养物、工作培养物和测试样品的建立所描述的方法制备的。测试样品是BIMUN0 品牌G0S、基本碳培养基、和所选择的微生物的混合物。
[0059] 图4和5示出了基于测试样品的体积计，0. 05重量％和0. 5重量％的G0S的比较 性体外益生元效应。如图4所示，相对于水对照组，在0. 05%和0. 5%两者含量上，全部三 种皮肤共生微生物的ATP产生均增加。图5示出了在0. 05%和0. 5%的含量，细菌计数的增 力口。因此，当以0.05%和0.5%存在时，GOS在体外表现出益生元活性。用于产生图4和5 所示的数据的测试样品是按照下文关于起始培养物、工作培养物和测试样品的建立所描述 的方法制备的。测试样品是BIMUNO品牌GOS、基本碳培养基、和所选择的微生物的混合物。
[0060] 图6示出了当微生物暴露于基于测试样品的体积计1重量％的G0S测试样品时， G0S对皮肤微生物组中的至少一些需氧微生物的体内益生元效应。图表10示出了对应于取 自详述于下文的体内临床实验中的人类受试者的样品的需氧细菌计数。图表10中显示为 TPS 1和TPS 2的样品对应于取自该研究的处理阶段的微生物样品，在其中1 % G0S测试样 品存在于受试者的前臂上。图表10中显示为RGS 1的样品对应于取自该研究的复原阶段 的第一微生物样品，在其中G0S不存在于前臂上。如图6所示，相对于在详述于下文的初始 的条件化阶段测量的基线水平，需氧细菌计数在处理阶段增加，并且相对于处理阶段，需氧 细菌计数在复原阶段减少。基于图6显示的数据，据信在处理阶段G0S的存在导致了需氧 细菌计数的增加，并且随后在复原阶段G0S的缺乏导致了需氧细菌计数的减少。换句话讲， 当以1%存在时，G0S在体内表现出对至少一些需氧的皮肤共生微生物的益生元活性。用于 产生图6所示的数据的测试样品是1% BIMUNO品牌G0S的水性溶液。
[0061] 图7示出了当微生物暴露于1%的G0S测试样品时，G0S对皮肤微生物组中的至少 一些厌氧微生物的体内益生元效应。TPS 1、TPS 2、和RGS1对应于就图6而言所描述的相 同的取样时间。RGS2对应于取自复原阶段的第二微生物样品。如可见于图7中，相对于在 条件化阶段测量的基线水平，厌氧细菌计数在处理阶段增加，并且相对于处理阶段，厌氧细 菌计数在复原阶段减少。另外，图7示出了相对于RGS1，厌氧细菌计数在RGS2中的继续减 少。基于图7的图表20所显示的数据，据信在处理阶段G0S的存在导致了厌氧细菌计数的 增加，并且随后在复原阶段G0S的缺乏导致了厌氧细菌计数的减少。换句话讲，当以1 %存 在时，G0S在体内表现出对至少一些厌氧的皮肤共生微生物的益生元活性。用于产生图7所 示的数据的测试样品是1% BIMUNO品牌G0S的水性溶液。
[0062] 尽管已出人意料地发现，某些胃肠道益生元表现出对皮肤共生微生物的适当的益 生元潜能，但这并不是对所有的通常已知的胃肠道益生元都成立，即使是在组成上与G0S 相似（即，基于碳水化合物）的那些。图8示出了通过测量相对于水对照组的细菌ATP含 量变化，多种基于碳水化合物的胃肠道益生元对表皮葡萄球菌（S.印idermidis)、杰氏棒状 杆菌（C. jeikeium)和痤疮丙酸杆菌（P. acnes)的益生元潜能。如可见于图8中的，并非所 有的胃肠道益生元均表现出对这三种皮肤共生微生物的所期望的益生元潜能。用于产生图 8所示的数据的测试样品是按照下文关于起始培养物、工作培养物和测试样品的建立所描 述的方法制备的。测试样品包括基于该测试样品的体积计，以1重量％存在的图8中显示 的测试试剂中的一种。测试样品是测试试剂、基本碳培养基、和所选择的微生物的混合物。
[0063] 美容纟目合物
[0064] 不受理论的约束，据信皮肤微生物组的健康状态可能与期望的皮肤功能或外观相 关和/或可在其他方面提供一种或多种护肤有益效果。例如，有可能通过维持或改善皮肤 微生物组中的一个或多个成员的健康状态来维持或改善皮肤的外观、屏障功能、保湿性和 /或其他特性。在一些情况下，如果皮肤的特定的某个区域或某些区域表现出不期望的功 能和/或外观，可能有利的是将皮肤的该特定的某个区域或某些区域作为维持或改善的靶 标。例如，可能有利的是将诸如面部（例如，前额、脸颊、和面部的眶周部分）、手和/或前臂 上的皮肤的特定区域作为靶标，上述区域趋于比皮肤的某些其他区域更多地因暴露于环境 (例如，紫外线辐射、风、污染、氧化、刺激物）而受损和/或可能发生内在老化的可见迹象。 用于改善皮肤的健康状态和/或外观的局部施用的化妆品组合物是为人们所熟知的（例 如，洗剂、保湿调理霜、油、粉底（液体和粉末）、唇膏、遮瑕物、剃刮准备组合物、液体或固体 的洁肤皂）。因此，可能有利的是将诸如GOS的益生元剂掺入到局部化妆品组合物中，以利 用可由健康的、平衡的皮肤微生物组提供的健康和/或外观有益效果。
[0065] 本文的化妆品组合物可包含有效量的皮肤共生益生元剂。该益生元剂可以按所 述组合物的重量计大于0. 〇〇l%、〇. 〇l%、〇. 05%、0. 1%、0. 5%、1%、2%、3%、4%或甚至大 于5%的量存在。可能有利的是将本发明的化妆品组合物中益生元剂的量限制在按所述组 合物的重量计小于25 %、20 %、15 %、或甚至10 %的量，以避免美容上不期望的特性（例如， 黏性或不良的铺展性）。在某些实施例中，所述益生元剂可以足够使至少一种皮肤共生微 生物的ATP含量在体外增加了至少80% (例如80 - 1000%或更多，或该范围内的任何值） 的量存在。另外或作为另外一种选择，所述益生元剂可以足够使至少两种皮肤共生微生物 的ATP含量在体外增加了至少50% (例如50 - 1000%或更多，或该范围内的任何值）的量 存在。此外，所述益生元剂可以足够使至少三种皮肤共生微生物的ATP含量在体外增加了 至少25% (例如25 - 1000%或更多，或该范围内的任何值）的量存在。应当理解的是，所 述益生元剂可以在体外提供ATP含量的上述增加中的一种或多种的量存在于所述组合物 中。例如，所述益生元剂可以足够使第一皮肤共生微生物的ATP含量计数在体外增加至少 了 80%，并且第二皮肤共生微生物的ATP含量在体外增加了至少50%的量存在。继续这个 例子，所述益生元剂还可以足够使第三皮肤共生微生物的ATP含量在体外增加了至少25% 的量存在。ATP含量可按照下文所详述的ATP测试在体外测定。
[0066] 在某些实施例中，所述益生元剂可以足够使至少一种皮肤共生微生物的细菌计数 在体外增加了至少10% (例如10 - 200%或更多、50 - 175%、100_ 150%、或这些范围内 的任何值）的量存在。除此之外或作为另外一种选择，所述益生元剂可以足够使至少两种 皮肤共生微生物的细菌计数在体外增加了至少10% (例如10 - 200%或更多、20 - 180%、 30 - 160%、40 - 150%、50 - 120%、或这些范围内的任何值）的量存在。此外，所述益生元 剂可以足够使至少三种皮肤共生微生物的细菌计数在体外增加了至少10% (例如10-200%或更多，或该范围内的任何值）的量存在。应当理解的是，所述益生元可以在体外提 供细菌计数的上述增加中的一种或多种的量被包含在本发明的组合物中。例如，所述益生 元剂可以足够使第一皮肤共生微生物的细菌计数在体外增加了至少50%并且第二皮肤共 生微生物的细菌计数在体外增加了至少20%的量存在。继续这个例子，所述益生元剂还可 以足够使第三皮肤共生微生物的细菌计数在体外增加了至少10%的量存在。体外的细菌计 数可以按照下文所详述的平板计数测试测定。
[0067] 本发明的化妆品组合物有利地以足够使至少一种需氧的和/或厌氧的皮肤共生 微生物（例如，上文所述的皮肤共生微生物中的一种或多种）的体内细菌计数增加的量包 含益生元剂。在某些实施例中，所述益生元剂可以使需氧的和/或厌氧的体内细菌计数增 加了至少 10% (例如，至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、 120%、130%或更多，或这些范围内的任何值）、但小于ΙΟΟχ的增加（例如，小于90x、80x、 7(^、6(^、50、4(^、30、2(^、1(^、或51)的量存在。本发明的化妆品组合物有利地以足够提供 护肤有益效果的量包含所述益生元剂。
[0068] 在某些实施例中，所述化妆品组合物可包含皮肤病学可接受的载体、有效量的皮 肤共生益生元、和通常包含在所提供的特定化妆品组合物中的类型的一种或多种任选成 分。
[0069] 皮肤病学可接夸的载体
[0070] 在某些实施例中，本文的化妆品组合物可包含一种或多种水和/或水混溶性溶剂 形式的合适载体。载体可以基于所述组合物的重量按重量计1%至99%的量存在（例如， 1 %,3%,5 % U0 % >15 %,20 %,25%,30 %,35 %,40 %,45 %,50%,55 %,60 %,65 %,70%, 75%、80%、或85%至90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、 35 %、30 %、25 %、20 %、15 %、10 %、或5 % )。合适的水混溶性溶剂包括一元醇、二元醇、多 元醇、甘油、二醇、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、以及它们的混合物。当化妆品组合物是乳液的 形式时，水和/或水混溶性溶剂通常与该乳液的水相相关联。
[0071] 本文的化妆品组合物可包含一种或多种合适的油。该油可以是挥发性的或非挥发 性的油。适用于本文的挥发性油可具有在25°C下0.5至5厘沲（cSt)范围的粘度。挥发性 油可被用于促进护肤组合物在其被施用于皮肤后更快地干燥。可包含非挥发性油以向皮肤 提供润滑和防护有益效果。
[0072] 在某些实施例中，所述化妆品组合物可包含一种或多种合适的硅油，例如，一种或 多种聚硅氧烷。适用于本文的聚硅氧烷可具有在25°C下0. 5至1，000, 000厘沲的粘度，并 且能够以下列化学通式表示：
[0073] R3SiO[R2SiO]xSiR3
[0074] 其中R独立地选自氢或直链或支链的、饱和或不饱和的烷基、苯基或芳基、三 烷基甲硅烷氧基；并且X是0至10, 〇〇〇的整数，被选择为实现所需的分子量。在某些实施 例中，R是氢、甲基、或乙基。可商购获得的聚硅氧烷包括聚二甲基硅氧烷，其也被称为聚二 甲基娃氧烧（dimethicones)，其例子包括来自Shin-Etsu的DM-Fluid系列、由Momentive Performance Materials Inc.销售的 Vicasil」'系列、和由 Dow Corning Corporation 销售 的Dow Corning'1'' 200系列。合适的聚二甲基硅氧烷的具体例子包括具有0. 65、1. 5、50、 100、350、10,000、12,500100,000、和 300,000。5七的粘度的0(^€：〇1'11丨1^1<200 打111(1(还 作为 XiameterK PMX-200Silic〇ne Fluids 销售）。
[0075] 合适的聚二甲基硅氧烷包括以下列化学通式表示的那些：
[0076] R3Si0[R2Si0]x[RR，Si0]ySiR 3
[0077] 其中R和R'各自独立地为氢或直链或支链的、饱和或不饱和的烷基、芳基、或 三烷基甲硅烷氧基；并且X和y各自是1至1，〇〇〇, 〇〇〇的整数，被选择为实现所需的分子量。 合适的聚二甲基娃氧烧包括苯基聚二甲基娃氧烧（来自Botanigenics, Inc.的Botansil? Η)-151)、二苯基聚二甲基硅氧烷（来自Shin-Etsu的KF-53和KF-54)、苯基聚三甲基硅氧 烧（来自Dow Corning的556 Cosmetic Grade Fluid)、或三甲基娃烧氧苯基聚二甲基娃 氧烷（来自Wacker-Belsil的PDM-20、PDM-200、或PDM-1000)。其他例子包括烷基聚二甲 基硅氧烷，其中至少R'是脂肪烷基（例如，C12_22)。一种合适的烷基聚二甲基硅氧烷是鲸 蜡基聚二甲硅氧烷，其中R'是直链C16链并且R是甲基。鲸蜡基聚二甲硅氧烷可以2502 Cosmetic Fluid 购自 Dow Corning 或以 Abil Wax 9801 或 9814 购自 Evonik Goldschmidt GmbH 〇
[0078] 可适用于本文的化妆品组合物的其他硅油包括具有下列通式的环状硅氧烷：
[0079]

【权利要求】
1. 一种增加皮肤上的厌氧的和/或需氧的皮肤共生微生物的数量的方法，包括： 向靶标皮肤表面局部施用化妆品组合物一段足够的时间以增加所述厌氧的和需氧的 皮肤共生微生物中的至少一种的数量，其中所述化妆品组合物包含皮肤病学可接受的载体 和有效量的皮肤共生益生元。
2. 根据权利要求1所述的方法，还包括将所述靶标皮肤表面鉴定为需要处理，所述处 理提供皮肤有益效果。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述皮肤有益效果选自改善皮肤外观、改善皮肤 感觉、增加皮肤的一个或多个层的厚度、增加皮肤的弹性、增加皮肤的回弹力、增加皮肤的 紧致度、减少皮肤的油性外观、减少皮肤的有光泽的外观、减少皮肤的无光泽的外观、增加 皮肤的水合状态、增加皮肤的保湿状态、减少细纹的外观、减少皱纹的外观、改善皮肤肌理、 改善皮肤光滑性、改善皮肤剥落、改善皮肤脱屑、使皮肤丰满、改善皮肤屏障性能、改善皮肤 色调、减少红色的外观、减少皮肤斑点的外观、改善皮肤的亮度、改善皮肤的光彩、改善皮肤 的半透明性。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括每天至少一次向所述靶标皮肤表面 施用所述化妆品组合物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述化妆品组合物被连续施用两天或更多天。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据平板计数测试，所述皮肤共生微 生物的数量在体内增加了至少10%。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述益生元以约0. 001%至约25%的 量存在。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述益生元以足够使所述至少一种皮 肤共生微生物的细菌ATP含量根据ATP测试在体外增加了至少80%的量存在。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述益生元以足够使所述至少两种皮 肤共生微生物的细菌ATP含量根据ATP测试在体外增加了至少50%的量存在。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述益生元以足够使所述至少三种 皮肤共生微生物的细菌ATP含量根据ATP测试在体外增加了至少25%的量存在。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述益生元选自低聚半乳糖、羟基异 亮氨酸、小麦糊精、阿拉伯半乳聚糖、柑橘纤维、豌豆纤维、麦芽糖糊精、低聚果糖、菊粉、菊 粉低聚纤维、甘露聚糖水解产物、葡甘露聚糖水解产物、半乳甘露聚糖、低聚龙胆糖、异麦芽 低聚糖、猕猴桃衍生化合物、甜菜浆、和米糠。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述低聚半乳糖选自二糖、三糖、四糖、五糖、六 糖以及这些的混合物。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述低聚半乳糖为约20至约35% w/v的所述 二糖、约20至约35% w/v的所述三糖、约15至约25% w/v的所述四糖、和约10至约20% w/v的所述五糖的混合物。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述皮肤共生微生物为选自葡萄球 菌属、棒状杆菌属、丙酸杆菌属的物种。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括结合所述第一化妆品组合物使用 第二化妆品组合物，其中所述第二化妆品组合物包含选自胃肠道益生菌、胃肠道益生菌裂 解物、胃肠道益生元和营养补充剂的材料。
【文档编号】A61K8/97GK104105471SQ201380008776
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年2月12日 优先权日:2012年2月14日
【发明者】A·C·兰扎拉科, D·L·查博尼奥, B·W·霍华德 申请人:宝洁公司