治疗炎症的方法和组合物的制作方法

治疗炎症的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了治疗性组合物和方法，用于在有需要的患者的胃肠道中诱导抗炎响应和/或治疗炎症和/或累积肠微生物抗原特异性抗炎T细胞。
【专利说明】治疗炎症的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用 本申请根据35 U. S. C. § 119(e)要求2012年3月26日提交的美国临时申请 61/615, 743号的优先权，通过引用将其以整体形式合并至本文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及关于免疫疗法和药物的组合物和方法。特别地，本发明涉及治疗炎症 (例如是胃肠道炎症）的疗法。
[0003] 背景 炎症性肠病（IBD)是导致肠变得发炎(红肿）的一群疾病的总称。每年有超过600000 美国人患有某种类型的炎症性肠病。这类疾病通常在性质上是慢性的，并且伴随一些症状， 例如腹痛、呕吐、腹泻、直肠出血、骨盆区域的严重内部绞痛/肌肉痉挛、以及体重减轻。IBD 相关的症状可能限制生活质量并每天影响受害者。
[0004] IBD的治疗形式主要包括降低患者的总体免疫力的免疫抑制法。这种治疗是有风 险的，经常将患者置于由于免疫受损导致的感染和疾病的风险中。
[0005] 本领域需要治疗该疾病但不损害患者总体免疫力的目标疗法。本发明满足了这种 需求并提供相关的优点。
[0006] 概述 为响应现有技术的需求，本发明公开了的是治疗方法和组合物，其激活并扩大了现存 的致力于抑制慢性炎症反应的内源性机制。在一个方面，本发明提供用于治疗胃肠道的炎 症的组合物和方法。
[0007] -个方面涉及通过施用有效量的抗原-MHC-纳米颗粒复合物来诱导细胞或组织 中的抗炎反应的方法；其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的抗原， 或是GI关联抗原。本发明还提供了用于诱导细胞或组织中的抗炎反应的抗原-MHC-纳米 颗粒，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的抗原，或是GI关联抗 原。本发明还提供了抗原-MHC-纳米颗粒在制备用于诱导细胞或组织的抗炎反应的药物中 的应用，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的抗原，或是GI关联抗 原。
[0008] 在另一个方面，本发明提供一种通过施用有效量的抗炎-MHC-纳米颗粒复合物 治疗有需要的患者中的炎症的方法；其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的 微生物的抗原，或是GI关联抗原。本发明还提供了用于治疗有需要的患者中的炎症的抗 原-MHC-纳米颗粒，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的抗原，或 是GI关联抗原。本发明还提供了抗原-MHC-纳米颗粒在制备用于治疗有需要的患者中的 胃肠道炎症的药物中的应用，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的 抗原，或是GI关联抗原。
[0009] 在另一个方面，本发明提供一种通过施用有效量的抗炎-MHC-纳米颗粒复合物来 在有需要的患者中积累抗炎T细胞的方法；其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠 道的微生物的抗原，或是GI关联抗原。本发明还提供了用于在有需要的患者中积累抗炎T 细胞的抗原-MHC-纳米颗粒，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微生物的 抗原，或是GI关联抗原。本发明还提供了抗原-MHC-纳米颗粒在制备用于在有需要的患者 中积累抗炎T细胞的药物中的应用，其中所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的微 生物的抗原，或是GI关联抗原。
[0010] 其他方面涉及一种复合物，其包含以下组分、或实质上由以下组分组成、或由以下 组分组成：纳米颗粒、MHC蛋白、以及抗原，所述抗原是来自于在胃肠道内或感染胃肠道的 微生物的抗原，或是GI关联抗原。本发明还提供了一种组合物，其包含以下组分、或实质上 由以下组分组成、或由以下组分组成：如本文所述的抗原-MHC-纳米颗粒，以及载体。
[0011] 本发明还提供一种试剂盒，其包含以下组分、或实质上由以下组分组成、或由以下 组分组成：如本文所述的组合物，以及使用所述组合物用于它们的预期目的的说明。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 附图构成说明书的一部分并且用来进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过 参考这些附图中的一个或多个并结合所呈现的【具体实施方式】的详细描述而被更好地理解。
[0013] 图1A-1C证实了 BacIYL以高亲和性结合至H-2Kd，所产生的pMHC复合物结合至 IGRP2(I6_214-特异性T细胞。A，Kd分子在RMA-SK d细胞上的肽诱导的稳定化。TUM是阳性对 照，Gp33是阴性（Db-结合）对照。B和C，虽然比NRP-V7/K d四聚体具有较低的亲和性，但 BacHL/Kd四聚体特异性结合至8. 3-CD8+T细胞。
[0014] 图2A-2D显示了 BacIYL在分离中起到拮抗剂的作用，但在存在LPS的情况下起到 部分激动剂的作用，其供体蛋白是有效的且由树突细胞交叉提供（cross-presented)。A，在 存在BacHL、IGRP 2Q6_214 (阳性对照）或TUM (阴性对照）的情况下培养的8. 3-CD8+ T细 胞中的⑶44和⑶69的表达。B，拮抗实验。TUM用作阴性对照。注意BacIYL (而非TUM， 一种结合Kd的阴性对照)的逐渐增加的浓度如何拮抗IGRP2(I6_ 214诱导的8. 3-⑶8+ T细胞响 应（IFNg分泌，顶部；增殖，底部）。C，BacIYL在存在LPS的情况下起激动剂的作用。NTG， 非转基因的（⑶8+ T细胞）。D，DC可处理来自重组野生型整合酶或重组突变整合酶(其中 BacIYL 表位突变成编码 IGRP2(I6_214)的 BacIYL 或 BACrcKP2(l6_214 样表位。
[0015] 图3A-3D显示BacIYL表位在体外诱导记忆⑶8+ T细胞形成。A和B，在存在肽脉 冲（10或0. 001 ug/ml)的DC的情况下培养28后的8. 3-CD8+ T细胞的表型。17. 6-CD8+ T细胞是非常低亲和性的IGRP2(I6_214特异性⑶8+ T细胞；如所预期的，它们在与BacIYL培 养28天后仍保持原样。C，应对肽应激（p印tide challenge)时细胞内IFNy含量变化。作 为对IGRP2(I6_214刺激的响应，BacIYL培养的8. 3-CD8+ T细胞快速产生IFN γ。D，作为对肽 应激的响应，分泌出IFN γ，并且记忆样8. 3-⑶8+ T细胞增殖（由BacIYL诱导)。
[0016] 图4A-4H显示BacIYL36_44反应性CD8+ T细胞响应提供了免患DSS诱导的结肠炎 的保护。A和B显示了 DSS处理和未处理的8. 3-N0D，17. 6-N0D小鼠的体重曲线（A)和疾 病活动分值（B)。图C和D显示了 DSS处理后8. 3-N0D及ItgP 7_〃 8. 3-N0D小鼠的体重 曲线（C)和疾病活动分值（D)。图E和F显示了在A-D中研究的小鼠的生存曲线。图G证 实了 IGRPi214+NOD (而非N0D)小鼠在4% DSS诱导的结肠炎时可抵抗体重减轻。图H显 示与非CTL输入的副本相比，BacHL36_44交叉反应性CD8+ CTL向IGRPm4+ NOD小鼠的过 继性转移导致疾病活动分值的显著降低。
[0017] 图5A-5B显示BacHL36_44反应性CD8+ CTL保护17. 6-N0D小鼠免患DSS诱导的结 肠炎。图5A显示了体重曲线，图5B显示了 17. 6-N0D小鼠在DSS处理+8. 3-CTL转移、单独 DSS处理、以及没有任何处理时的疾病活动分值。注意BacIYL36_44交叉反应性⑶8+ CTL向 17. 6-N0D小鼠的过继性转移，在响应DSS处理时，与它们的非CTL输入的副本相比，是如何 显著地降低疾病活动分值和体重减轻的。
[0018] 图6证实了在IGRP4_22/I-Ag7-NP处理的NOD小鼠中，Trl样自动调节CD4+ T细胞 向肠相关淋巴组织的征募。图中显示了两只小鼠的数据。
[0019] 图 7 显示了 pMT/V5 中的 Baclnt4(l_54-I-Ab-C-Jun 图。DNA 构建体的 Nco I (854) 至 Xho I (1738)位点之间的部分编码 HA-BacInt4Q_54-I-Abeta (b)-C-Jun 融合蛋白（293 a. a)。该融合蛋白包括15 a. a HA前导序列，之后为Baclnt4(l_54 (TNV)肽（15 a. a.)。编码 肽的 DNA 序列经 16 a. a GS 接头被连接至 I-Abeta (b) (199 a. a. )。I-Abeta (b)的 C 末 端经8 a. a GS接头被连接至C-Jun序列（40 a. a. )。a. a.=氨基酸。
[0020] 图8显示了 BacInt4(l_54-I_Abeta (b)-C-Jun构建体的蛋白质序列和DNA序列。该 融合蛋白中的单个成分的序列是HA前导序列（带下划线）,之后为BacInt^ 1肽序列（双下 划线）、I-Abeta (b)(虚线下划线）和C-Tun序列。GS接头未突出显示。
[0021] 图 9 显示了 pMT/V5 中的 I-Aalpha (b)-C-Fos-BirA-His6 图。编码 HA 先导序列-I-Aalpha (b)-C-Fos-BirA-His X 6 融合蛋白（284 a. a)的 DNA 构建体被克隆到 pMT/V5 苍蝇细胞表达载体的Nco I (854)到Xba I (1711)位点之间。该融合蛋白包括I-Aalpha (d) (195 a. a.)，之后经GS接头（6 a. a.)连接有C-Fos,再后为BirA序列和6 X His。
[0022] 图10显示I-Aalpha (b)-C-Fos构建体的蛋白质序列和DNA序列。该融合蛋白的 单个成分的序列为HA先导序列（下划线）,之后为I-AalDha (b)(双下划线）、C-Fos (虚 线下划线）、BirA (阴影）和6 X His序列。GS接头未突出显示。
[0023] 图 11 显示了 pMT/V5 中的BacInt8B5-I-Ab-C-Jun 图。Nco I (854)到Xho I (1738) 位点之间的DNA构建体编码HA-Baclnt81_95-I-Abeta (b)-C-Jun融合蛋白（293 a. a)。该 融合蛋白包括15 a. a HA先导序列，之后为Beclnt81_95 (LGY)肽（15 a. a·)。编码肽的DNA 序列经 16 a. a GS 接头连接至 I-Abeta (b) (199 a. a. )。I-Abeta (b)的 C 末端经 8 a. a GS接头连接至C-Jun序列（40 a. a.)。
[0024] 图12显示了 BacInt81_95_I_Abeta (b)-C-Jun构建体的蛋白质序列和DNA序列。该 融合蛋白的单个成分的序列为HA先导序列（下划线)，之后为BacInt^肽序列(双下划 线）、I-Abeta (b)(虚线下划线）和C-Jun (阴影）序列。GS接头未突出显示。
[0025] 图 13 显示了 pMT/V5 中 Baclnt365_379-I-Ab-C-Jun 的图。Nco I (854)到 Xho I (1738)位点之间的 DNA 构建体编码 HA-Baclnt365_379-I-Abeta (b)-C-Jun 融合蛋白（293 a. a)。该融合蛋白包括15 a. a HA先导序列，之后为Baclnt365_379 (TQI)肽（15 a. a.)。编 码肽的 DNA 序列经 16 a. a GS 接头连接至 I-Abeta (b) (199 a. a. )。I-Abeta (b)的 C 末 端经8 a. a GS接头连接至C-Jun序列（40 a. a.)。
[0026] 图14显示了 BacInt365_379_I_Abeta (b)-C-Jun构建体的蛋白质序列和DNA序列。该 融合蛋白质中的单个成分的序列为HA先导序列（下戈Ij线)，之后为BacInt w379肽序列(双 下划线).I-Abeta (b)(虚线下划线）和C-Jun (阴影）序列。GS接头未突出显示。
[0027] 图 15 显示了 pMT/V5 中的 Baclnt57_71-I-Ab-C-Jun 的图。Nco I (854)至 Xho I (1738)位点之间的 DNA 构建体编码 HA-Baclnt57_71-I-Abeta (b)-C-Jun 融合蛋白（293 a. a)。该融合蛋白包括15 a. a HA先导序列，之后为Baclnt57_71 (INH)肽（15 a. a.)。编码 肽的 DNA 序列经 16 a. a GS 接头连接至 I-Abeta (b) (199 a. a. )。I-Abeta (b)的 C 末端 经8 a. a GS接头连接至C-Jun序列（40 a. a.)。
[0028] 图16显示了 BacInt57_71_I_Abeta (b)-C-Jun构建体的蛋白质序列和DNA序列。该 融合蛋白的单个成分的序列为HA先导序列（下划线)，之后为BacInt 5zzll肽序列(双下划 线）、I-Abeta (b)(虚线下划线）和C-Jun (阴影）序列。GS接头未突出显示。
[0029] 图 17 显示了 pMT/V5 中 Baclnt88_1(l2-I-Ab-C-Jun 的图。Nco I (854)至 Xho I (1738)位点之间的 DNA 构建体编码 HA-BacInt88_1Q2-I-Abeta (b)-C-Jun 融合蛋白（293 a. a)。该融合蛋白包括15 a. a HA先导序列，之后为Baclnt88_1(l2 (IPA)肽（15 a. a.)。编 码肽的 DNA 序列经 16 a. a GS 接头连接至 I-Abeta (b) (199 a. a·)。I-Abeta (b)的 C末 端经8 a. a GS接头连接至C-Jun序列（40 a. a.)。
[0030] 图18显示了 BacInt88_1(l2-I_Abeta (b)-C-Jun构建体的蛋白质序列和DNA序列。 该融合蛋白的单个成分的序列为HA先导序列（下划线)，之后为BacInt ss,,肽序列(双下 划线).I-Abeta (b)(虚线下划线）和C-Jun (阴影）序列。GS接头未突出显示。
[0031] 图19显示了以高密度Γ5χ1013/πι1)浓缩且单分散的pMHC涂布的金ΝΡΓ14 nm) 的代表性TEM图像。放大：50, OOOX。
[0032] 图20显示了 pMHC (GNP)剂量和pMHC效价对pMHC涂布的GNP的激动性质的作用。 图中比较了同源8. 3-⑶8+ T细胞在应对两种不同pMHC-GNP样品时分泌的IFN γ的量(两 者均由直径为14 nm的?2xl013 GNP/ml组成)。Au-022410和Au-21910分别携带?250和 ?120 pMHC/GNP。Au-011810-C 携带?120 对照 pMHC/GNP。
[0033] 图21证实了 8. 3-⑶8+ T细胞的pMHC-NP诱导的IFN γ分泌随着pMHC效价而变 化。8. 3-CD8+ T细胞（2. 5x10s个细胞/ml)与逐渐增加数量的涂布了三种不同IGRP2Q6_214/ Kd效价的NP -起培养。
[0034] 图22显示pMHC-NP的较低激动活性可通过增加 pMHC-NP密度来补偿，但仅高于 pMHC效价的阈值。图表比较了三种不同pMHC-NP制剂(携带三种不同效价的pMHC)在一系 列NP密度时的激动活性。注意携带8 pMHC的NP与携带11 pMHC的NP不同，前者即使在 高pMHC-NP密度的情况下，与携带54 pMHC的NP相比，也不能充分地引发分泌。
[0035] 图23显示了 pMHC效价阈值对pMHC-NP的激动性质的作用随着总pMHC输入量而 变化。
[0036] 图24显示pMHC效价对以较大氧化铁NP核产生的pMHC-NP的激动性质的作用。
[0037] 图25显示了尺寸对激动活性的作用。Au-0224-15是涂布了相对低的pMHC效价 但以高密度制备的14 nm GNP;Au-0323-40是涂布了高pMHC效价但以低密度制备的40 nm GNP。Au-0224-15比Au-0323-40样品具有更好的激动活性。
[0038] 图26显示了保护性PEG对pMHC-GNP的功能的作用。Au-021910由?2xl013个直 径14 nm的GNP/ml组成，通过2 kD巯基-PEG保护，并以?120 pMHC/GNP涂布。Au-012810 GNP(也由?2xl013 14 nm GNPs/ml组成）通过5 kD巯基-PEG保护，并以?175 pMHC/GNP涂 布。样品Au-021910具有更好的激动活性。
[0039] 图27显示了 NRP-V7/Kd涂布的金NP实现的NRP-V7反应性⑶8+ T细胞的有效 扩增。施用了携带25 yg的pMHC(150 pMHC/NP)的3 X IO12 NP (尺寸为?10 nm)。以 NRP-V7/kd涂布的金NP每周注射前驱糖尿病10周大NOD小鼠两次，持续5周。TUM/Kd四 聚体为阴性对照。每个柱图对应一个不同的小鼠。
[0040] 图28显示了以PMHC涂布的NP处理的小鼠中同源⑶8+ T细胞的大量表达。使用 了携带 25 μ g 的 pMHC(150 pMHC/NP)的 3 X IO12 IGRP2Q6_214/Kd-NP (尺寸为?10 nm)。上 图：给药4次后的小鼠的曲线。下图：注射10次后两只不同小鼠的曲线(仅用血液；提交此 申请时仍存活)。
[0041] 详细描述 要理解的是，本发明并不限于所描述的特定实施方式，因为这些实施方式肯定可以变 化。还要理解的是，本文所使用的术语仅为描述特定实施方式的目的而使用，并非意在限 制，因为本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
[0042] 必须注意的是，本文和权利要求中所使用的单数形式"一个"和"该"，除非文中有 明确说明，否则都包括复数个指代。因此，例如，当提到"赋形剂"时，其包括多种赋形剂。
[0043] I.定义 除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的含义。如本文所使用的，以下术语具有下述含义。
[0044] 如本文所使用的，术语"包括"是指该组合物和方法包括所引述的内容，但不排除 其他内容。当用来定义组合物和方法时，"实质上由…组成"意味着排除对于该组合物或方 法具有任何实质性意义的其他内容。因此，如本文所定义的，实质上由该元素组成的组合物 不会排除不会实质性影响所要求保护的发明的基本的和新颖的特性的材料或步骤，该特性 例如是治疗有此需要的对象中的炎症性肠病的能力和/或诱导抗炎反应。"由…组成"意味 着排除高于痕量的其他组分和实质性的方法步骤。由每个这些过渡术语定义的实施方式都 在本发明的范围内。
[0045] "生物相容性的"是指递送系统的成分不会导致组织损伤或对人类生物系统造成 损伤。为赋予生物相容性，会优先使用已在人体中有安全使用记录或具有GRAS(Generally Accepted As Safe)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性是指用在组合物中的组分和赋形 剂最终会被"生物吸收"或被身体清除而不会对身体产生不利作用。一种组合物要成为生物 相容的，并且被认为是无毒的，其必须不能对细胞造成毒性。类似地，术语"生物可吸收的" 是指由在一段时间内在体内经历生物吸收的材料制成的纳米颗粒，因而可避免在患者体内 形成该材料的长期累积。在优选的实施方式中，该生物相容性纳米颗粒在少于2年的时间 段内被生物吸收，优选少于1年，更优选少于6个月。生物吸收率与颗粒的尺寸、所使用的 材料、以及本领域技术人员普遍意识到的其他因素相关。生物可吸收的生物相容性材料的 混合物可被用来形成本发明中使用的纳米颗粒。在一个实施方式中，可将氧化铁和生物相 容性的生物可吸收的聚合物混合。例如，可将氧化铁与PGLA混合以形成纳米颗粒。
[0046] 抗原-MHC-纳米球复合物是指在表面上（例如生物相容性生物可降解纳米球 上）的抗原分子或蛋白质的肽、碳水化合物、脂质或其他抗原节段、片段或表位的表现形式 (即，自身肽或自身抗原）。如本文所使用的，"抗原"是指可在对象中诱导免疫响应或抗病 原性细胞的扩增的分子的全部、部分、片段或节段。
[0047] 当用在数字表示(例如温度、时间、量和浓度）之前时(包括范围值)，术语"约"表示 近似值，其可上（+ )下（-）改变10 %、5 %或1 %。
[0048] "模拟物"是特定配体或肽的类似物，其中该类似物与该配体实质上相似。"实质上 相似"是指该类似物的结合属性与该配体类似，但该模拟物具有一个或多个功能基团或修 饰位点，它们共同占据该配体的分子量的少于约50%、少于约40%、少于约30%、少于约20%、 少于约10%、或少于约5%。
[0049] 术语"免疫细胞"是指免疫系统的细胞。免疫系统的细胞包括例如成人脾细胞、T 淋巴细胞、B淋巴细胞和来源于骨髓的细胞，例如哺乳动物的抗原提呈细胞，其对该免疫细 胞所来源的器官具有活性。还包括先天免疫系统的细胞，例如自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜 酸性细胞、嗜碱性细胞和吞噬细胞(例如巨噬细胞、嗜中性细胞和树突细胞)。
[0050] 术语"抗炎T细胞"是指促进抗炎响应的T细胞。T细胞的抗炎功能可通过抗炎蛋 白质、细胞因子、趋化因子等的生成和/或分泌而实现。抗炎蛋白质也包括抑制免疫响应的 抗增殖性信号蛋白。抗炎蛋白质包括IL-4、IL-10、IL-13、IFN-a、TGF-β、IL-lra、G-CSF 以及TNF和IL-6的可溶性受体。还包括具有炎症表型但杀死抗原提呈细胞或安排特定自 身免疫响应的抗炎细胞。在某些实施方式中，这些细胞生成IFNy和TNFa以及其他细胞 因子。在某些实施方式中，抗炎T细胞以低亲和性识别肠细菌表位。在另外的实施方式中， 抗炎T细胞是细胞毒性T细胞。
[0051] 术语"IL-10"或"白介素-10"是指由IL-10基因编码的细胞因子。IL-I-序列可 通过 GenBank 登录号 NM_000572. 2 (mRNA)和 NP_000563. 1 (蛋白质）获得。
[0052] 术语"TGF-β "或"转化生长因子β "是指可具有抗炎作用的蛋白质。TGF-β是 以至少三种同种型存在的分泌蛋白，分别为TGF-β UTGF-P2和TGF-P3。它也是TGF-β 1 的原名，其是该家族的创始成员。TGF-β家族转化生长因子β超家族的一部分，其包括抑 制素类、激活素、抗中肾旁管激素、骨形态生成蛋白、decapentaplegic蛋白和Vg-1。
[0053] 术语"胃肠道"是指上胃肠道和下胃肠道。上胃肠道由食道、胃和十二指肠构成。 下胃肠道包括小肠和大肠。
[0054] 术语"微生物"是指单细胞微观生物体。微生物包括例如细菌、真菌、古生菌和原 生生物。
[0055] "有效量"是足以实现预期目的的量，预期目的的非限制性的例子包括：启动免疫 响应、调节免疫响应、抑制炎症响应和调节T细胞活性或T细胞群。在一个方面，有效量是 指实现所提及的治疗目的的量，例如治疗有效量。如本文所详细描述的，有效量或剂量取决 于目的和组合物、成分，并且可根据本发明公开的内容来确定。
[0056] 词语"一个"或"一种"与术语"包括"在权利要求和/或说明书中结合使用时，其 可能意味着"一个"，但也可指"一个或多个"、"至少一个"以及"一个或多于一个"。
[0057] 术语"整合酶"是指一种在拟杆菌中表达的蛋白质。对应整合酶序列的GenBank 登录号是YP_001300081. 1。该序列以SEQ ID No. 2表示。SEQ ID No. 3代表整合酶的 编码DNA序列。SEQ ID No. 1对应于整合酶蛋白质中的一个表位。该表位是HLKTNVYL (SEQ ID No. 1)。已知具有HLKTNVYL (SEQ ID No. 1)表位的拟杆菌菌株包括例如拟杆菌 种9_1_42FAA、拟杆菌种D4、拟杆菌种3_1_33FAA、拟杆菌dorei 5_1_36/D4、拟杆菌dorei DSM 17855、普通拟杆菌ATCC 8482、拟杆菌种4_3_47FAA、普通拟杆菌PC510。
[0058] "纳米球"、"NP"或"纳米颗粒"在本文是指以单个或多个形式适当施用给对象、细 胞或组织的小的离散颗粒。在某些实施方式中，纳米球的形状是实质上球形的。如本文所 使用的，术语"实质上球形的"是指颗粒的形状不偏离球状超过约10%。在某些实施方式中， 纳米颗粒不是脂质体或病毒颗粒。在另外的实施方式中，纳米颗粒是固体。本发明的各种 已知抗原或肽复合物可被施用至这种颗粒。本发明的纳米球的尺寸为约I nm至约I Mm，并 且优选地为约10 nm至约I Mm，并且在某些方面，当指代多个纳米球时，是指多个纳米球的 平均直径或中间值。较小的纳米尺寸的颗粒可通过例如分离工艺获得，从而允许较大的颗 粒沉淀在水性溶液中。该溶液的上部随后通过本领域已知的方法回收。该上部富集了较小 尺寸的颗粒。该工艺可被重复直到生成期望的平均尺寸。
[0059] 权利要求中使用的术语"或"，除非另有明确说明仅指择一方案或这些替代方案相 互排斥之外，是指"和/或"，即使公开的内容支持指代择一方案和"和/或"的定义。
[0060] 如本文所使用的，术语"免疫响应"或其等同体"免疫学响应"是指针对胃肠道微 生物特异性抗原或对胃肠道的微生物特异的抗原的相关表位产生的细胞街道的响应（由抗 原特异性T细胞或它们的分泌产物介导）的进展。细胞免疫响应是通过将多肽表位与I类 或II类MHC分子相关联而提呈来诱导，从而激活抗原特异性CD4 + T辅助细胞和/或CD8+ 细胞毒性T细胞。这些响应有可能涉及其他成分的激活。
[0061] 本文使用的术语"炎症反应"和"发炎"表示个体的血管组织对有害刺激(例如病 原体、受损细胞或刺激物）的复杂的生物学响应，包括分泌细胞因子，更具体地是促炎性细 胞因子，即，主要是由活化的免疫细胞产生并且涉及炎症反应的扩大的细胞因子。促炎性细 胞因子的例子包括但不限于，IL-1、IL-6、TNF-a、IL-17、IL21、IL23和TGF-β。示例性的 发炎包括急性发炎和慢性发炎。急性发炎表示短期过程，特点在于由于血浆和白细胞对组 织的浸润导致的典型的发炎症状(肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失)。急性发炎通常只要 存在损伤刺激即出现，并且一旦刺激被除去、分解或通过形成瘢痕而隔离(纤维化）即停止。 慢性发炎表示一种状态，其特点是并发活性炎症、组织破坏并且尝试修复。慢性发炎没有以 上列出的急性发炎的那些典型症状。相反，慢性发炎组织的特点是单核免疫细胞(单细胞、 巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)的浸润、组织破坏，并尝试愈合(包括血管生成和纤维化)。在 本发明的意义上，发炎可通过影响，特别是抑制形成个体内炎症相关的复杂生物学响应的 任何一个事件来抑制。
[0062] 术语"表位"和"抗原决定簇"可互换使用，并且是指抗原上B细胞和/或T细胞 所响应或识别的位点。B细胞表位可由连续氨基酸形成或通过蛋白质的三次折叠而并置的 非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍保留，但由三次 折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时会丢失。表位通常包括至少3个、更常见为至少5 个或8-10个以独特空间构象存在的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线 晶体分析法和2维核磁共振法。参见例如Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996)。T细胞识别CD8细胞的约9个氨基酸的连续表位，或CD4细胞的约13-15个氨基 酸的表位。识别该表位的T细胞可通过测定抗原依赖性增殖的体外实验来识别，该测定可 通过 3H-胸腺嘧啶加入、通过已接触抗原的T细胞对表位的响应（Burke et al.，J. Inf. Dis.，170:1110-1119，1994)、通过抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞实验，Tigges et al.，J. Immunol.，156(10):3901-3910, 1996)、或通过细胞因子分泌来确定。细胞介导 的免疫响应的存在可通过增殖实验（CD4+ T细胞）或CTL实验(细胞毒性T淋巴细胞)来确 定。
[0063] 任选地，抗原(优选是抗原的表位）可化学地结合至，或表达为，与其他蛋白融合的 融合蛋白，所述其他蛋白例如是MHC和MHC相关蛋白。
[0064] 如本文所使用的，术语"患者"和"对象"可意思相近，并且是指哺乳动物。在一些 实施方式中，患者是人。在其他实施方式中，患者或对象是通常用在实验室中的哺乳动物， 例如是小鼠、大鼠、猴、狗、猫、牛、马或羊。
[0065] 如本申请中所使用的，术语"多核苷酸"是指一种核酸分子，其可为重组的，或是分 离的且不含全基因组核酸。术语"多核苷酸"包括寡核苷酸(长度为100个残基或更少的 核酸)、重组载体(包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等)。在某些方面，多核苷酸包括调节序 列，它们被分离得实质上远离它们的天然基因或蛋白质编码序列。多核苷酸可为RNA、DNA、 其类似物、或它们的组合。编码多肽的全部或部分的核酸可含有编码该多肽的全部或一部 分的连续核酸序列，并具有以下长度：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、 140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、 330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、 510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、 700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、 890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、 1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、 6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、或更多个核苷酸、核苷或碱基对。还预期的是，来 自特定物种的特定多肽可由含有天然变体的核酸编码，所述天然变体具有稍微不同的核酸 序列但编码相同或实质性相似的蛋白质、多肽或肽。
[0066] 多核苷酸是由特定序列的四种核苷酸碱基构成的：腺嘌呤（A);胞嘧啶（C);鸟嘌呤 (G);胸腺嘧啶（T);以及如果多核苷酸是RNA时替代胸腺嘧啶的尿嘧啶（U)。因此，术语"多 核苷酸序列"是多核苷酸分子的字母表现形式。该字母表现形式可被输入到具有中央处理 单元的计算机的数据库中，并且可用于生物信息学应用，例如功能基因组学和同源性检索。 [0067] 如本文关于核酸(例如DNA或RNA)所使用的，术语"分离的"或"重组的"是指分离 自其它DNA或RNA的分子，分别为存在于大分子以及多肽的天然来源中的分子。术语"分离 的或重组的核酸"包括不是天然地作为片段存在并且在自然状态下找不到的核酸片段。术 语"分离的"在本文中也用来指分离自其他细胞蛋白质的多核苷酸、多肽和蛋白质，并且意 在包括纯化的和重组的多肽。在其他实施方式中，术语"分离的或重组的"是指分离自成分、 细胞，其中细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段在天然状态下通常是联合 在一起的。例如，一个分离的细胞是指分离自不相似表型或基因型的组织或细胞的一个细 胞。分离的多核苷酸是分离自3'和5'连续核苷酸，该分离的多核苷酸在其天然或自然环 境中（例如在染色体上）通常是与3'和5'连续核苷酸相连的。对于本领域技术人员明显 的是，非天然的核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要进行"分离"从而预期天然副 本相区别。
[0068] 多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域）与另一序列具有特定百分数(例 如，80%、85%、90%或95%)的"序列一致性"是指，在比较着两个序列时，当比对时，该百分 数的碱基(或氨基酸）是相同的。该比对以及同源性或序列一致性百分比可利用本领域已 知的软件来确定，例如在 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al·， eds. 1987) Supplement 30，7. 7. 18部分，表格7. 7. I中描述的那些软件。优选地，比对 时使用默认参数。优选的比对程序是BLAST，使用默认参数。特别地，优选的程序为BLASTN 和BLASTP，使用以下默认参数：遗传密码=标准；过滤器=无；链=两种；切断=60 ;预 期=10 ;Matrix = BL0SUM62 ;描述=50个序列；分类=HIGH SCORE ;数据库=非冗余 GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS翻译 + SwissProtein + SPupdate + PIR。 这些程序的详细信息可在以下网址找到ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST。
[0069] 不用明确说明即可推测得出，除非另有说明，否则当本发明涉及到多肽、蛋白质、 多核苷酸或抗体时，其等价物或生物学等价物也在本发明的保护范围之内。如本文所使用 的，当提到参考蛋白、抗体、片段、多肽或核酸时，术语"其生物学等价物"与"其等价物"同 义，并且是指具有最小同源性但仍保持期望的结构或功能性的蛋白、抗体、片段、多肽或核 酸。除非本文另有特别说明，否则预期的是，任何本文提及的多核苷酸、多肽或蛋白质也包 括其等价物。在一个方面，等价多核苷酸是在严格条件下与本文所述用于所描述的方法的 多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。在另一个方面，等价抗体或抗原结合多肽是指以 至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的亲和性或更高的 亲和性结合至参考抗体或抗原结合片段的抗体或多肽。在另一个方面，其等价物在竞争性 ELISA实验中与该抗体或抗原结合片段竞争结合至其抗原。在另一个方面，等价物具有至少 约80%同源性或一致性，或者至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约98%的同源 性或一致性，并且表现出与参考蛋白、多肽或核酸实质上等同的生物学活性。
[0070] "杂交"是指一个或多个多核苷酸发生反应以形成复合物的反应过程，该复合物通 过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而稳定化。氢键结合可为Watson-Crick碱基配对、 Hoogstein结合或任何其他序列特异性方式结合。该复合物可包括形成双链结构的两个链、 形成多链复合物的三个或更多个链、单个自身杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以 为更广泛过程中的一个步骤，例如是PC反应的起始步骤，或多核苷酸核酶催化中的酶促裂 解步骤。
[0071] 严格杂交条件的例子包括：温育温度为约25°C至约37°C;杂交缓冲液浓度为约6x SSC至约IOx SSC ;甲酰胺浓度为约0%至约25%;并且洗涤溶液为约4x SSC至约8x SSC。 中等杂交条件的例子包括：温育温度为约40°C至约50°C ;缓冲液浓度为约9x SSC至约2x SSC ;甲酰胺浓度为约30%至约50% ;并且洗涤溶液为约5x SSC至约2x SSC。高严格杂交条 件的例子包括：温育温度为约55°C至约68°C;缓冲液浓度为约lx SSC至约0. Ix SSC ;甲酰 胺浓度为约55%至约75%;并且洗涤溶液为约lx SSC、0. Ix SSC、或去离子水。一般而言，杂 交温育时间为5分钟至24小时，具有1、2或更多个洗涤步骤，并且洗涤温育时间为约1、2、 或15分钟。SSC是0. 15 M NaCl和15 mM柠檬酸盐缓冲液。要理解的是，可使用利用其它 缓冲系统的SSC等价物。
[0072] "同源性"或"一致性"或"相似性"是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相 似性。同源性可通过比较每个序列中的一个位置来确定，这些序列可被对齐从而进行比较。 当被比序列中的一个位置被相同碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在该位置是同源的。 序列之间的同源性程度与序列共享的匹配或同源位置的数量有关。"不相关的"或"非同源 的"序列与本发明的序列中的一个共享少于40%的一致性，或少于25%的一致性。
[0073] "同源性"或"一致性"或"相似性"也可以指在严格条件下杂交的两个核酸分子。
[0074] 如本文所使用的，术语"治疗"是指获得期望的药理学和/或生理学效果。该效果 可为预防性的，表现为完全地或部分地阻止疾病或其迹象或症状，和/或可为治疗性的，表 现为部分地或完全地治愈疾病和/或由该疾病造成的负面作用。在一个方面，治疗表示患 者的炎症的减少。测定的方法包括，但不限于，血管舒张、炎症标记物的产生和白细胞浸润 停止。炎症标记物包括例如11-6、11^-8、11^-18、1即-〇和〇^。本领域已知测量和监控这 些标记物的任何合适的方法。
[0075] 本发明的意图在于在体外或体内阻止倾向于患有疾病或具有作用的系统或对象 中出现该疾病或作用。
[0076] "组合物"是指活性试剂和惰性(例如可检测试剂或标记物）或活性的另一种化合 物或组合物(例如佐剂）的组合。
[0077] "药物组合物"包括活性试剂与惰性或活性载体的组合，所述载体使得该组合物适 于体外、体内或间接体内的诊断或治疗用途。
[0078] 术语"功能上等同的密码子"是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸 的6个密码子，并且也指编码生物学等价氨基酸的密码子(见下表)。
[0079] 密码子表

【权利要求】
1. 一种包含抗原-MHC复合物的纳米颗粒，其中所述复合物包含复合至抗原的MHC蛋 白，所述抗原来源于胃肠道的微生物，或所述抗原是一种GI关联抗原。
2. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径选自：约I nm至约100 nm ;约5 nm至约5 nm ;或约5至约15 nm。
3. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原-MHC复合物比纳米颗粒 的比率为约10:1至约1000:1。
4. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原-MHC复合物是共价连接 或非共价连接至所述纳米颗粒的。
5. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原-MHC复合物是通过尺寸 小于5 kD的接头共价连接至所述纳米颗粒的。
6. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原来自于以下微生物的一 种：拟杆菌、梭菌、梭杆菌、真细菌、瘤胃球菌、消化球菌、消化链球菌或双歧杆菌，或者所述 抗原是来源于选自卵清蛋白、酵母甘露聚糖或麦醇溶蛋白的蛋白质的GI关联抗原。
7. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原来源于拟杆菌或来源于拟 杆菌的蛋白质。
8. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原来源于整合酶。
9. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述抗原包含与SEQ ID No. 1、4、 5、6、7或8的肽序列具有至少80% -致性的肽。
10. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是生物相容性的或 生物可吸收的。
11. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述MHC包含I类MHC或II类 MHC。
12. 根据前述任一项权利要求所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒是非脂质体的。
13. -种组合物，其包含权利要求1-12任一项所述的纳米颗粒，以及载体。
14. 一种制备或获得权利要求1-12任一项所述的纳米颗粒的方法，所述方法包括将所 述抗原-MHC复合物复合至所述纳米颗粒。
15. -种分离的且纯化的多肽，包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No. 1、4、5、6、7或 8,或与SEQ ID No. 1、4、5、6、7或8具有至少约80%序列一致性的多肽，或由下述多核苷酸 编码的多肽，所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与编码SEQ ID No. 1、4、5、6、7或8的 多核苷酸杂交，或与编码与SEQ ID No. 1、4、5、6、7或8具有至少约80%序列一致性的多肽 的多核苷酸杂交，或与上述多核苷酸的互补序列杂交。
16. -种编码权利要求15所述的多肽的分离的且纯化的多核苷酸，或等价物，或在严 格条件下与所述多核苷酸、其等价物或其互补序列杂交的多核苷酸，其中所述严格条件包 括约25°C至约37°C的温育温度、约6x SSC至约IOx SSC的杂交缓冲液浓度、约0%至约25% 的甲酰胺浓度、以及约4x SSC至约8x SSC的洗涤溶液。
17. -种组合物，其包含权利要求15所述的多肽，以及载体。
18. -种组合物，其包含权利要求16所述的多核苷酸，以及载体。
19. 一种在细胞或组织中诱导抗炎响应的方法，所述方法包括将所述细胞或组织与有 效量的权利要求1-12的任一项所述的纳米颗粒接触。
20. -种治疗有需要的患者的炎症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的权 利要求1-12的任一项所述的纳米颗粒复合物，从而治疗炎症。
21. -种在有需要的患者的GI道中累积抗炎T细胞核/或抗炎细胞的方法，所述方法 包括向所述患者施用有效量的权利要求1-12的任一项所述的纳米颗粒，从而治疗所述患 者。
22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中所述患者患有选自以下疾病的胃肠道疾 病：炎症性肠病、结肠炎、Crohn氏病、胃肠道的过敏性炎症、或乳糜泻。
23. 根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞或组织是所述GI道的细胞或组织。
24. 根据权利要求21-22的任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。
25. 根据权利要求21-22或24的任一项所述的方法，其中所述T细胞分泌IL-IO或 TGF β。
26. 根据权利要求19或23所述的方法，其中所述抗炎响应在所述胃肠道中被诱导。
27. 根据权利要求20所述的方法，其中胃肠道的炎症被治疗。
29. -种在有需要的患者中转移靶定肠细菌表位的细胞毒性T淋巴细胞的方法，所述 方法包括向所述患者施用有效量的权利要求1-12的任一项所述的抗原-MHC-纳米颗粒复 合物。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞毒性T淋巴细胞以低亲合力识别所述 肠细菌表位。
【文档编号】A61K39/02GK104321077SQ201380022126
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年3月25日 优先权日:2012年3月26日
【发明者】佩德罗·圣塔马尼亚 申请人:Uti有限合伙公司