来自小麦的糖级分、分离方法以及发明的应用领域的制作方法
【专利摘要】描述了从发芽的且浸渍在水中的小麦种子提取的级分，该级分具有包括在3和30千道尔顿之间的分子量。
【专利说明】来自小麦的糖级分、分离方法以及发明的应用领域
【技术领域】
[0001] 本发明涉及天然提取物、特别是来自谷物的提取物的领域，并且涉及用于它们的 分离的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，蛋白质型（诸如例如生长因子）或甘氨酸型（诸如例如透明质酸、未处理 的淀粉或水解的淀粉及其级分、其它GAG、葡胺聚糖等等）的大分子以及从各种植物（例 如，芦荟（Aloe vera)、积雪草（Centellaasiatica)等等）得到的化学上不确定的提取物 (chemically undefined extract)的临床应用和化妆品应用已变得普遍化，这些产品广泛 地应用于例如包括表皮组织的疾病（例如伤口或溃疡）中或者用于化妆品目的。
[0003] 在EP 743 323(以相同 申请人:的名义）中，例如，描述了从淀粉得到的糖级分。
[0004] 在一些研宄中，参见例如，D'Agostino 等人的 "A fraction purified from Triticumvulgare has trophic effects on Ca⑶-2" [GASTROENTEROLOGY, ELSEVIE R，PHILADELPHIA, vol. 104,n。4,Suppl, IJanuary 1993,pp.819]和在 Fiore 等人的 "Differential activities of Triticumvulgare extract and its fractions in mouse fibroblasts"[ACTA THERAPEUTICA Vol. 19，n。2, 1993pages 151 - 162]中，描述了获得的 糖级分而未具体说明用于使植物发芽和生长的方法，且其还含有肽级分、己糖和己糖胺。
[0005] 这些提取物用作上皮再生阶段的刺激剂且由此的疤痕形成的刺激剂，诸如皮肤刺 激情况下的安抚剂，例如润肤剂，并且一般用于皮肤和粘膜的所有非感染性紊乱。
[0006] 还针对上面提到的类型的新化合物的分离进行研宄，不仅用以扩宽产物用于上面 提到的目的的可用性，而且用以分离具有增强的活性的化合物，而且用以在没有过高成本 的情况下得到产物，诸如例如，生长因子和上述的多种葡萄糖材料。
[0007] 然而，正如已经述说的，上述的所有天然提取物（包括小麦提取物）皆由不确定且 增大的数量的各种类型的物质和/或大分子组成，它们的大多数还未被鉴定；然而，把活性 归因于任何经鉴定的成分并不总是可能的。
[0008] 这也是用于得到植物材料和可以任选地从其纯化的级分的方法未以标准化方式 进行完全描述的原因。
[0009] 相反，且出人意料地，作为本发明的主题以及被鉴定且化学表征的级分，表现出总 提取物的所有活性并由此代表负责提供总提取物的作用的要素。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1表示通过分别分析参考空白（水）、根据本发明的级分（在图中被标记为CP 级分）和从中分离根据本发明的方法的第（d)段中所得到的级分的、在图中被指定为TVE 的级分而得到的色谱图。
【发明内容】
[0011] 描述了从在水中浸渍的小麦的胚芽提取的级分，该级分具有3至30千道尔顿范围 内的分子量。
【具体实施方式】
[0012] 本发明涉及从在水中浸渍的小麦的胚芽得到的提取物的级分，其具有生长因子典 型的许多生物学特征，只是它明显地是植物来源和动物来源，并且具有多糖而非蛋白质的 化学结构；所述完全非预期的特性使得该级分对制备可用于治疗伤口和溃疡的药物和产品 而言特别有益。
[0013] 更具体而言，本发明涉及在如关于现有技术所述的上文所描述的一般用于得到已 经已知的类似提取物的条件下从发芽的小麦的种子得到的级分，其具有3至30千道尔顿范 围内的分子量。
[0014] 应当牢记在心，根据本发明的级分不存在于未发芽的种子中，并且只有或主要是 该级分（即，在3-30千道尔顿范围内的级分）具有上述性能。
[0015] 根据本发明，该方法提供根据已知方法从发芽的小麦得到的原始提取物的制备和 后续的活性级分的纯化。
[0016] 上面提到的方法包括下列步骤：
[0017] a)使小麦种子在水中和/或在惰性的天然或人工生长支持物上在任何光（优选在 黑暗中）、湿度（优选在超过60%的湿度）、温度（优选在5_20°C)条件下发芽，优选产出 生长至高度为3-15cm的芽；
[0018] b)在85_125°C范围内的温度下加热得到的植物材料（任选地预防性地压碎成小 尺寸，并且添加水），任选地添加水，以准备下一个步骤并且防止微生物生长；
[0019] C)浸渍得到的材料，将其放在水中（优选在pH 2-4)并且任选地留置使其在低温 下浸渍（最高10°c);
[0020] d)借助于过滤、压制或者借助于诸如提取器的其它等同系统清除固体残澄，以得 到可被灭菌的第一澄清溶液（理解为原始提取物）；
[0021] e)从上文提到的溶液纯化具有3, 000至30, 000道尔顿之间的分子量的级分，从而 得到具有提高的百分比含量的活性级分的第二溶液；
[0022] f)从上文提到的第二溶液分离特征为3, 000至30, 000范围内分子量的纯化的活 性级分。
[0023] 若需要，则可以在步骤a)之前利用纯化水使种子润湿。
[0024] 根据常规技术优选在高压灭菌器中进行步骤b)和步骤d)中提到的灭菌。
[0025] 步骤c)优选在2和4之间的pH下进行，优选持续1-72小时。
[0026] 步骤c)和步骤d)中固体残澄的清除可以以卷制（curling)方法进行。在这种情 况下，将步骤d)中得到的溶液替代步骤c)中的水添加至根据步骤b)的发芽的新幼苗，并 且重复步骤c-d。这样可得到更高的产率。
[0027] 具有低于3000的分子量的级分和高于30, 000的分子量的级分的清除（步骤e) 可以通过本领域专家已知的常规方法进行，例如借助于凝胶过滤或超滤。
[0028] 照此类推，感兴趣的级分借助于上文提到的技术被分离。
[0029] 迄今为止所提到的分子量意图指用于纯化作为本发明的主题的级分的超滤膜： 此类值涉及球状蛋白质且因此仅被视作指示自其分离的级分的真实分子量：用以选择所 讨论的级分的所有更多的理由（all the more reason to select the fraction under discussion)，其是糖类型并且具有直链和支链结构，因此恰恰不是球状。
[0030] 在其最终形式中，作为本发明的主题的级分可以使用常规方法干燥或冻干，或优 选地以已知且预定的浓度留在水溶液中；任选地添加防腐剂和/或被灭菌。
[0031] 通过下列具体实施例将更清晰地说明上文一般描述的方法：
[0032] 实施例
[0033] L 发芽
[0034] 将5kg润湿的木纤维素分配至一系列合适的钢罐内；在其上，接下来使预先用水 润湿的2. 4kg小麦种子分散；在空调室中允许该种子在黑暗中发芽数天（4-10天）直至得 到高度为5-15cm的幼苗。生长期间，通过添加足量的水来每天润湿支持物。
[0035] 该室的温度维持在5_20°C的范围内；且相对湿度为彡60%。
[0036] 2.加热
[0037] 将罐的内容物放在合适的、气密封的容器中，然后在1大气压（~ 121°C )下高压 灭菌1小时。
[0038] 3.浸渍和提取
[0039] 然后，将材料转移至合适容量的钢容器内，并添加1001含有120ml的10% v/v硫 酸和60ml的10% v/v盐酸的纯化水。可以使浸渍进行1-72小时。然后在300大气压的压 力下提取水相，并且清除耗尽的固相。
[0040] 使由此得到的液体（定义为"第一压制"）补充120ml 10% v/v硫酸和60ml 10% v/v盐酸，并且与其它罐的另外的等同数量的内容物（the contents of a further equivalent number of other tanks)混合。然后重复被描述为"第一压制"的程序，由此 得到"第二压制"。
[0041] 再次重复相同的操作，由此得到"第三压制"和"第四压制"。
[0042] 当将液相放置成与植物材料接触以进行提取时，使液相有力地混合并且接下来在 冷处（5-9°C )保持约24-72小时。
[0043] 也可以使最终的液体在冷处（5-9°C )保持大约24至72小时。
[0044] 4.过滤和灭菌
[0045] 来自第四压制的液体通过常规方法来过滤；然后，在合适的容器中，在1大气压下 通过施加相当于1小时的周期来高压灭菌该液体。
[0046] 5.超滤
[0047] 使用具有3千道尔顿的截断值的滤筒的合适的超滤仪器，将上文得到的液体超滤 至该仪器所允许的最大值；将水添加至剩余的液体，并重复超滤2-3次以弃掉洗脱相中所 含有的较低分子量。
[0048] 然后，使用相同的方法但是用具有30千道尔顿的截断值的其它滤筒取代该滤筒， 进一步超滤含有大于3, 000道尔顿的分子量的残渣：然而，在这种情况下剩余的残渣代表 大于30, 000千道尔顿的分子量并且被弃掉，同时洗脱相含有具有3, 000至30, 000道尔顿 范围内的分子量的活性级分。
[0049] 然后，照原样或在合适的支持物上冻干（或干燥）含有活性级分的溶液；或者使其 灭菌（照原样，添加防腐剂，例如2% w/w苯氧乙醇）。
[0050] A.关于活性级分的化学数据
[0051] 1.该级分的色谱分析
[0052] 选择连接有PAD检测器（脉冲安培检测器）的、尤其是标明用于碳水化合物分析 的HPAE (高压阴离子交换）色谱系统。
[0053] 色谱系统具有下列特征：
[0054] -具备具有二元梯度的线性洗脱的泵的系统
[0055] 洗脱液 1 :0· 5M NaOH
[0056] 洗脱液2 :0· 5M NaOH中IM醋酸钠
[0057] 梯度通过下列线性程序来施加（恒流等于I. Oml/min)，其中％ 2表示关于泵2的 洗脱液相对于总混合物的百分比：
[0058]
【权利要求】
1. 一种用于制备从发芽的小麦种子得到的级分的方法，所述级分具有3, 000至30, 000 道尔顿范围内的分子量，所述方法提供： -使小麦种子在水上或在天然或人工支持物上发芽，直至得到幼苗； -热处理所述幼苗； -在水溶液中浸溃得到的材料； -清除固体残渣直至得到第一澄清溶液，所述第一澄清溶液被灭菌； -清除具有低于3, 000道尔顿的分子量的级分和具有高于30, 000道尔顿的分子量的级 分，实现具有3, 000至30, 000范围内的分子量的级分的纯化。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)在水上或在惰性的人工生长支持 物上在任何光（优选在黑暗中）、湿度（优选超过60% R. H)、温度（优选在5-20°C )条件 下进行，产出优选高至3-15cm的高度的幼苗。
3. 根据权利要求1-2所述的方法，其特征在于，步骤b)在高温巧5-150°C )、任选地添 加水、且持续25-120分钟来进行；W及该步骤对所得到的原样或压碎至减小的尺寸的大小 的植物材料进行。
4. 根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，步骤C)在2和7之间的抑和在低温 (2-10°C )进行。
5. 根据权利要求1-4所述的方法，其特征在于，步骤d)使用合成膜、纸滤器、压机或液 体-固体提取器来进行。
6. 糖级分，所述糖级分是借助于根据权利要求1-5所述的方法可得到的，并是任何纯 化等级的。
7. 根据权利要求6所述的借助于方法可得到的糖级分，其特征在于，所述方法通过超 滤来得到并且它给出了如图1所示的色谱图。
8. 根据权利要求5所述的得到的级分的用途，作为用于制备可W用于治疗皮肤上或粘 膜上的溃瘍、伤口，或者至少用于治疗皮肤的素乱的药用物质、医疗设备、化妆品的活性要 素或者至少作为成分。
9. 药物组合物，其含有与赋形剂和常规载体物质混合的有效量的权利要求5所述的溶 液和/或权利要求6所述的级分。
10. 根据权利要求9所述的组合物，是W小瓶、洗液、乳膏、软膏、凝胶、溶液、药物、栓 剂、胚珠剂、皂、泡沫、片剂、粉末、乳状物的形式。
11. 化妆品组合物，其含有与赋形剂和常规载体物质混合的有效量的权利要求5所述 的总提取物和/或权利要求6所述的级分。
12. 根据权利要求11所述的组合物，是W小瓶、洗液、乳膏、软膏、凝胶、溶液、药物、栓 剂、胚珠剂、皂、泡沫、片剂、粉末、乳状物的形式。
【文档编号】A61K36/899GK104470528SQ201380029302
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年6月4日 优先权日:2012年6月4日
【发明者】鲁道夫·里乔 申请人:达莫尔制药公司