一种具有抗纤维化作用的中药提取物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种具有良好抗纤维化作用的马甲子提取物及其制剂和用途。马甲子提取物主要成分包括黄酮类、萜类、生物碱类、香豆素类、多糖类和纤维素以及上述黄酮、萜、生物碱、香豆素的苷及其单体成分。本发明还涉及马甲子提取物的制备方法和用途，单独使用马甲子提取物和/或以马甲子提取物为主要活性成分的药物组合物在制备抗纤维化药物中的用途也在本发明的范围内。
【专利说明】一种具有抗纤维化作用的中药提取物及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药提取及应用领域，具体是指一种具有治疗纤维化的马甲子提取物及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]纤维化一种由炎症导致器官实质细胞坏死，组织内细胞外基质异常增多和过度沉积的病理过程。轻者表现为纤维化，重者引起组织结构破坏而发生器官硬化。纤维化可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，是许多疾病致残、致死的主要原因。统计显示，美国因各种疾病而致死的病人中，接近45%可以归于组织纤维增生疾病。
[0003]任何原因引起的组织细胞损伤，均可导致组织细胞发生变性、坏死和炎症反应。如损伤较小，损伤细胞周边正常实质细胞将通过增殖对损伤区域进行修复，进而完全恢复组织器官的正常结构和功能；如损伤较大或反复损伤超出了损伤周围实质细胞的再生能力时，间质纤维结缔组织(细胞外基质)将大量增生对缺损组织进行修复，因此纤维化在本质上是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。然而，增生的纤维结缔组织虽然修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能，如果这种修复反应过度、过强和失控时，就会引起器官的纤维化并导致器官的功能下降，甚至缺失。
[0004]目前针对纤维化的基础和临床进行了大量研究，但发病机制仍不清楚，也缺乏疗效确切的治疗药物。中药治疗组织纤维化具有一定的效果，如专利CN1439376A公开了一种抗肺纤维化的积雪草甘中药制剂，专利CN1453014A公开了一种预防肝纤维化、治疗肝硬化的中药制剂，但这些制剂的临床疗效能够达到何种程度均需进一步的确认。
[0005]本发明中我们公开了一种治疗组织纤维化的中药提取物及其制剂。 申请人:惊奇的发现马甲子提取物在抗脏器纤维化具有令人满意的效果。`
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种具有良好治疗各种脏器纤维化作用的马甲子提取物或以马甲子为主要活性成分的药物组合物，所述马甲子提取物主要成分含有但不限于萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类及上述萜、黄酮、生物碱和香豆素的苷和单体以及多糖类以及纤维素等成分。
[0007]马甲子提取物加入药物学上可接受的辅料可制备成多种途径给药的药物制剂，例如通过口服(包括颊内或舌下)、经鼻、局部(包括颊内、舌下或经皮)、不经肠道(包括皮下、皮内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输注)途径给药。这些制剂可通过药剂学技术中已知的任何方法，例如通过使活性成分与载体或赋形剂结合来制备。例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸、微球、滴丸、控释制剂、缓释制剂或注射剂。
[0008]适于口服给药的药物制剂可呈现为独立单位，诸如胶囊、片剂、粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液、悬浮液、水包油型液体乳液或油包水型乳液。可以以单位剂量形式制备口服液体，如溶液、糖浆和酏剂。糖浆可通过使化合物溶解于经适当调味的水溶液中来制备，而酏剂是经由使用无毒载体(vehicle)来制备。还可添加增溶剂和乳化剂(诸如乙氧基化异十八醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(诸如薄荷油或天然甜味剂，或糖精或其它人工甜味剂)及类似物。适当时，用于口服给药的剂量单位制剂可以是微胶囊化的也可通过涂布或包埋颗粒物质于聚合物、蜡或类似物中来制备制剂以延长或持续释放。还可以以脂质体给药系统(诸如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体)的形式给药，脂质体可由各种各样的磷脂，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
[0009]适于经皮给药的药物制剂可以以意欲保持与接受者表皮紧密接触较长时段的独立贴片形式呈现。适于局部给药的药物制剂可配制为软膏剂、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、搽剂或油剂。
[0010]马甲子提取物可以采用如下方法制备得到:取马甲子全株，包括根、茎、叶全部或其中任一部位的鲜品或者冷冻干燥品，用有机溶媒预处理马甲子鲜品或者冷冻干燥品，或将马甲子鲜品或冻干品直接用有机溶媒提取，得到马甲子提取物，用有机溶媒提取的方法包括但不限于浸溃法、回流法、渗漉法等本领域常规的提取方法。亦可根据其具体包含的萜类、黄酮类、生物碱类、香豆素类、多糖类以及纤维素的性质采用醇提水沉、水提醇沉等本领域的常规提取方法，通过大孔树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺及葡聚糖凝胶等常规填料进行分离提取获得。
[0011]所述马甲子在用有机溶媒处理前必须为鲜品或冷冻干燥品。
[0012]所述有机溶媒选自甲醇、10-100%乙醇，优选95%的乙醇。
[0013]所述减压回收温度在30-60 V之间。
[0014]马甲子提取物优选采用如下方法制备:取新鲜马甲子全株，加入8-10倍重量份的95%乙醇浸溃I天，然后将马甲子粉碎，再加入6-10倍重量份的95%乙醇浸溃提取2-3天，收集提取液，减压回收溶剂，`得到的提取物浓缩液，干燥即得马甲子乙醇提取物，其中干燥方法包括但不限于减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、微波干燥。
[0015]更优选新鲜马甲子茎叶，加入8倍重量份的95%乙醇浸泡I天，然后将马甲子粉碎，再加入10倍重量份的95%乙醇提取，回流提取，收集提取液，60°C减压回收乙醇至无醇味，得到的提取物浓缩液、干燥后得马甲子乙醇提取物。
[0016]更优选新鲜马甲子茎叶，加入8倍重量份的甲醇浸泡I天，然后将马甲子粉碎，再加入10倍重量份的甲醇提取，回流提取，收集提取液，60°C减压回收甲醇，得到的提取物浓缩液、干燥后得马甲子甲醇提取物。
[0017]进一步讲，还可以将马甲子乙醇提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，浓缩后干燥得到石油醚提取物或者乙酸乙酯提取物。
[0018]上述提取物或活性部位主要包括黄酮类化合物，其中，黄酮类化合物重量百分含量不少于10%，优选在10%~50%，其中黄酮类化合物含有如下单体成分:异樱花苷、枸桔苷
坐寸ο
[0019]进一步讲，提取物或活性部位中含有三萜类化合物，其重量百分含量不少于2%，优选2%~11%，其中三萜类化合物含有如下单体成分:美洲茶酸、异美洲茶酸、美洲茶酸-28 β-葡萄糖酯、异美洲茶酸-28 β-葡萄糖酯、22S，23R-环氧-甘遂焼 ~1~ 稀 _3 ct，24，25- 二醇等。[0020]进一步讲，提取物或活性部位中含有生物碱类化合物，其重量百分含量不少于2%，优选2%~10%，生物碱类化合物含有如下单体成分:主要含有环肽生物碱，大类成分包括13元环的间柄型、14元环的对柄型、15元环的间柄型环肽生物碱，具体为洛土辛及其衍生物、无刺率因、无刺率环肽、nummularine及其衍生物、mucronine及其衍生物、sativanine及其衍生物等。
[0021]进一步讲，提取物或活性部位中含有香豆素类化合物，其重量百分含量不少于1%，优选1%~19%，香豆素类化合物含有如下单体成分:伞形花内酯、篙属香豆素、葡萄内酯、佛手柑内酯、比克白芷素、虎耳草素等。
[0022]进一步讲，提取物或活性部位中含有多糖和纤维素类成分。
[0023]其中黄酮类化合物、三萜类化合物、生物碱类化合物、香豆素类化合物测定方法如下:
[0024]取马甲子提取物或活性部位0.lg，三份，加入IOml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入IOml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6ml，混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度，置70°C恒温水浴中加热15min，冷却至室温，并转移至IOml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量(含三萜以美洲茶酸计)。经计算得出Ig马甲子提取物或活性部位中三萜类成分含量。
[0025]取马甲子提取物或活性部位0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取lml，置IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波长处测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量(含黄酮量以芦丁计)。经计算得出马甲子提取物或活性部位中总黄酮含量。
[0026]取马甲子提取物或活性部位0.lg，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，以18%氨水2ml润湿lh，加乙醚2氯仿2乙醇(25: 8: 2.5)混合溶剂30ml，超声提取20min，倾出上清液至小锥形瓶中，再加入上述混合溶剂30ml，冷浸放置半小时，再超声震荡提取20min，滤过，以相同溶剂15ml分3次洗涤`残渣和滤纸，合并滤液于锥形瓶中，于60°C水浴上蒸干，准确加入IOml氯仿使其全部溶解，再准确吸取5mL转移至小分液漏斗中，加6mL氯仿，2ml缓冲液(pH=5.0,0.2Μ邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用Immol.L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定，并不断震摇；接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5ml，继续滴定并不断震摇，静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计)。经计算得出马甲子提取物或活性部位中生物碱含量。
[0027]取马甲子提取物0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取lml，置IOml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波长处测定测定吸光度，计算供试品溶液中总香豆素含量(含香豆素量以伞形花内酯计)。经计算得出马甲子提取物中总香豆素含量。
[0028]本发明的马甲子提取物，还可以与现有技术中具有抗纤维化的中药、西药联合使用，用于抗纤维化。包括但不限于三七总甙、川芎嗪、丹参、刺五加注射液、川芎嗪注射液、红花注射液、银杏黄酮苷、生脉、丹参注射液、双黄连、香丹注射液、益气活血颗粒、抗纤颗粒、肺康颗粒、百合固金丸、虫草蛤蚧散合洋参丸、黄芪、西红花、生地黄、三七、绞股蓝、姜黄、黄葵、苦杏仁甙、汉防己甲素、大黄素、恩替卡韦、拉米夫定、胡萝卜素、维生素Ε、磷脂酰胆碱、S-腺苷蛋氨酸、前列地尔、地诺前列酮、秋水仙碱、雌激素、血管紧张素II受体阻断药、交感神经系统抑制剂、干扰素、脯氨酰-4-羟化酶抑制剂、肝素、水飞蓟素、熊去氧胆酸等。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0030]实施例1
[0031]取马甲子全株1kg，加入8倍量的95%乙醇浸溃I天后，然后进行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇浸溃2天提取，收集提取液，50°C减压回收乙醇至无醇味，干燥即得马甲子乙醇提取物。
[0032]实施例2
[0033]取马甲子茎叶1kg，加入10倍量的95%乙醇浸溃I天后，然后进行粉碎，再加入10倍量的95%乙醇回流提取，收集提取液，60°C减压回收乙醇至无醇味，干燥即得马甲子乙醇提取物。将马甲子乙醇提取物加水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到马甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
[0034]实施例3
[0035]取马甲子全株1kg，加入10倍量的甲醇浸溃I天后，然后进行粉碎，再加入8倍量的甲醇浸溃2天，收集提取液，40°C下减压回收甲醇，干燥即得马甲子甲醇提取物，将马甲子甲醇提取物加水分散后，依次 用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到马甲子石油醚提取物和乙酸乙酯提取物。
[0036]实施例4
[0037]取实施例2的马甲子石油醚提取物0.lg，三份，加入IOml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入IOml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6ml,混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度,置70°C恒温水浴中加热15min,冷却至室温，并转移至IOml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量(含三萜以美洲茶酸计)。经计算Ig马甲子提取物中三萜类成分含23mg。
[0038]取实施例2的马甲子石油醚提取物0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波长处测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量(含黄酮量以芦丁计)。经计算Ig马甲子提取物中总黄酮含103mg。
[0039]取实施例2的马甲子石油醚提取物0.lg，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，以18%氨水2ml润湿lh，加乙醚2氯仿2乙醇(25:8: 2.5)混合溶剂30ml，超声提取20min，倾出上清液至小锥形瓶中，再加入上述混合溶剂30ml，冷浸放置半小时，再超声震荡提取20min,滤过，以相同溶剂15ml分3次洗涤残渣和滤纸，合并滤液于锥形瓶中，于60°C水浴上蒸干，准确加入IOml氯仿使其全部溶解，再准确吸取5mL转移至小分液漏斗中，加6mL氯仿，2ml缓冲液(pH=5.0,0.2Μ邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用lmmol -L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定，并不断震摇；接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5ml，继续滴定并不断震摇，静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计)。经计算Ig马甲子提取物中生物碱含2lmg。[0040]取实施例2的马甲子石油醚提取物0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取Iml，置IOml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波长处测定测定吸光度，计算供试品溶液中总香豆素含量(含香豆素量以伞形花内酯计)。经计算Ig马甲子提取物中总香豆素含
10.2mg。
[0041]实施例5
[0042]取实施例2的马甲子乙酸乙酯提取物0.lg，三份，加入IOml容量瓶内，加乙酸乙酯至刻度，再从中精密吸取4ml溶液加入IOml容量瓶内，挥干溶剂后，加入5%香草醛-冰醋酸0.4ml、高氯酸1.6ml,混匀，并由乙酸乙酯稀释至刻度,置70°C恒温水浴中加热15min,冷却至室温，并转移至IOml容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在540nm波长处测定吸收度，计算供试品溶液中总三萜含量(含三萜以美洲茶酸计)。经计算Ig马甲子提取物中三萜类成分含108mg。
[0043]取实施例2的马甲子乙酸乙酯提取物0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置IOml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在510nm波长处测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量(含黄酮量以芦丁计)。经计算Ig马甲子提取物中总黄酮含497mg。
[0044]取实施例2的马甲子乙酸乙酯提取物0.lg，三份，精密称定，置具塞锥形瓶中，以18%氨水2ml润湿lh，加乙醚2氯仿2乙醇(25: 8: 2.5)混合溶剂30ml，超声提取20min，倾出上清液至小锥形瓶中 ，再加入上述混合溶剂30ml，冷浸放置半小时，再超声震荡提取20min,滤过，以相同溶剂15ml分3次洗涤残渣和滤纸，合并滤液于锥形瓶中，于60°C水浴上蒸干，准确加入IOml氯仿使其全部溶解，再准确吸取5mL转移至小分液漏斗中，加6mL氯仿，2ml缓冲液(pH=5.0,0.2Μ邻苯二甲酸氢钾缓冲液)。用lmmol -L-1溴麝香草酚蓝溶液滴定，并不断震摇；接近终点时，分出氯仿层，再加入新鲜氯仿5ml，继续滴定并不断震摇，静置分层，至水层略显黄色即为终点。计算总生物碱(含生物碱以马甲子碱B计)。经计算Ig马甲子提取物中生物碱含107mg。
[0045]取实施例2的马甲子乙酸乙酯提取物0.lg，三份，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取Iml，置IOml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，在340nm波长处测定测定吸光度，计算供试品溶液中总香豆素含量(含香豆素量以伞形花内酯计)。经计算Ig马甲子提取物中总香豆素含186mg0
[0046]实施例6对大鼠肝纤维化的影响
[0047]SD大鼠60只(200_240g，雄性)，按体重分层随机均分成空白对照组(0.5%西黄芪胶)、模型对照组(0.5%西黄芪胶)、阳性对照组(地塞米松，lmg/kg)、马甲子提取物(按照实施例I的方法制备得到)低剂量组(0.4g/kg)、中剂量组(0.8g/kg)、高剂量组(1.6g/kg)。除空白对照组外，均按lml/kg皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，每周2次，连续3月，同时给予高脂饲料以及5%的乙醇水溶液。灌胃给予受试物，每日I次，连续3月。给药结束后次日腹主动脉取血，分离血浆，测定丙氨酸转氨酶(ALT)、III型前胶原(PC-1II)、透明质酸(HA)和层黏连蛋白(LH)水平；随后处死动物，取肝脏进行病理学检查。血清生化检测结果如表1。[0048]表1马甲子提取物对实验性肝纤维化大鼠肝脏及血液生化指标的影响
Ca=IOi 1 土s )
【权利要求】
1.一种具有抗纤维化作用的中药提取物，其特征在于:所述中药提取物为马甲子提取物，包括马甲子的甲醇、乙醇、石油醚或者乙酸乙酯提取物；主要成分包括黄酮类、萜类、生物碱类、香豆素类、多糖类和纤维素以及黄酮、萜、生物碱、香豆素的苷及其单体成分。
2.根据权利要求1所述马甲子提取物的制备方法，其特征在于:用有机溶媒预处理马甲子全株或任一部位的鲜品或者冷冻干燥品，或将马甲子鲜品或冻干品直接用有机溶媒采用浸溃法、回流法和/或渗漉法提取，得到马甲子提取物。
3.根据权利要求1所述的马甲子提取物，其特征在于:石油醚提取物或者乙酸乙酯提取物的制备方法为，将权利要求1或2所述的马甲子提取物用水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚提取物或者乙酸乙酯提取物。
4.根据权利要求1所述的马甲子提取物，亦可根据其成分的性质采用醇提水沉、水提醇沉提取纯化，或通过大孔树脂、硅胶、氧化铝、聚酰胺及葡聚糖凝胶进一步纯化。
5.根据权利要求1~4任意一项所述，马甲子提取物的各类制剂，其特征在于:优选为片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸、微球、滴丸、控释制剂、缓释制剂或注射剂。
6.根据权利要求1~4任意一项所述，马甲子提取物的用途包括单独使用马甲子提取物或以马甲子提取物为主要活性成分的药物组合物在制备抗纤维化药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于:所述纤维化包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心肌纤维化。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于:还可以加入其它具有治疗纤维化的中药、西药联合使用。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于:其它具有治疗纤维化的中药、西药选自:三七总甙、川；嗪、丹参、刺五加注射液、川；嗪注射液、红花注射液、银杏黄酮苷、生脉、丹参注射液、双黄连、香丹注射液、益气活血颗粒、抗纤颗粒、肺康颗粒、百合固金丸、虫草蛤蚧散合洋参丸、黄芪、西红花、生地黄、三七、绞股蓝、姜黄、黄葵、苦杏仁甙、汉防己甲素、大黄素、恩替卡韦、拉米夫定、β -胡萝卜素、维生素Ε、磷脂酰胆碱、S-腺苷蛋氨酸、前列地尔、地诺前列酮、秋水仙碱、雌激素、血管紧张素II受体阻断药、交感神经系统抑制剂、干扰素、脯氨酰-4-羟化酶抑制剂、肝素、水飞蓟素、熊去氧胆酸。
【文档编号】A61K45/00GK103751315SQ201410018576
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】徐超群, 袁志翔, 李东晓, 舒光明, 张磊, 李兴平, 雷玲, 白筱璐 申请人:四川省中医药科学院