用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法

用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗致病性阴道生物被膜的方法和组合物。更具体地讲，本发明涉及包含硼酸和二乙胺四乙酸(EDTA)组合的药物组合物和使用该类组合物治疗或预防与阴道感染例如细菌性阴道病(BV)、女阴阴道念珠菌病(VVC)、滴虫病或混合感染相伴的生物被膜形成的方法。
【专利说明】用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法
[0001]本申请是申请日为2008年11月26日、发明名称为“用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法”、申请号为200880126280.3的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于治疗阴道感染和致病性阴道生物被膜的组合物和方法。
【背景技术】
[0003]依照疾病控制中心(CDC)，阴道炎是育龄妇女极常见的诊断疾病，致使每年有超过I千万人去诊所看病。绝大多数的阴道炎病例涉及三种感染之一:细菌性阴道病(BV)、女阴阴道念珠菌病(VVC)(亦称为"阴道酵母菌感染")、和滴虫病。细菌性阴道病占所有感染的约40 - 45%，而VVC和滴虫病分别占约20 - 25%和15 — 20%。在某些情况下，阴道炎的病因可混合。不幸的是，阴道炎的全国性监视数据缺乏，如无可报告的疾病；然而，由NationalHealth and Nutriti on Examination Survey对BV的患病率评估显不在全美国年龄4-49岁的人口中近三分之一(29%)的妇女呈该感染阳性。
[0004]虽然大量FDA批准的疗法可用于治疗阴道炎，但是由于抗治疗有机体和复发和持续感染的比率增加常常使治疗具有挑战性并更复杂。此外，有不断增加的科学证据鉴定这些感染作为更严重的健康并发症的重要危险因素，尤其在怀孕期间。据报导去诊所看病和自我治疗阴道炎的直接费用估计是每年多于10亿美元；然而，涉及继发性并发症(例如，在怀孕中发病、盆腔炎症性疾病、和手术后感染)和丧失劳动能力的间接费用远远更大。
[0005]因此，这些感染的公共卫生含意是显著的，并有需要改善治疗方法。
[0006]生物被膜相关性感染于1978年首次描述，且现在认为是多于60%的人类感染尤其是其持续性感染和复发性感染的诱发因素。对于由细菌和真菌有机体引起的宽范围的慢性感染，包括皮肤创伤和烧伤、中耳炎、牙周病、心内膜炎、泌尿道感染和装置相关性感染(例如，导管、心脏瓣膜)，已经描述了生物被膜，但不认为在阴道感染的病因中重要，并因此实际上还没有由阴道炎治疗领域的那些技术人员来论述。
[0007]生物被膜是嵌入保护性表多糖(即，碳水化合物)基质的高度有机的微生物群，该基质经由粘附蛋白附着至无活性膜表面和活膜表面(即，固着的群)。与其自由浮游的或"浮游生物的〃微生物相反，众所周知生物被膜相关性微生物耐抗微生物治疗一直到1000倍或更大一并是许多复发性感染和顽固性感染的缘由。认为其持续性在一部分上涉及基因的向上调节，该基因赋予高度不同的和抗药的生物被膜表型，该生物被膜表型使生物被膜群落的生长和生存永存。这包括生物被膜基质材料的形成，这限制抗微生物剂的穿透并干扰正常宿主的防御机制、和基本上不耐杀的"耐药株"有机体的增殖。
[0008]生物被膜在固体表面上移行离开高应力区域的能力一称为群游的能力一及其慢生长速率也被认为促成其病原性和持续性。证据还支持:建立的生物被膜通过充当保护这些有机体不被免疫系统和常规抗微生物治疗破坏的防御贮器，而在其它续发病原体例如病毒的持续性中起作用。[0009]硼酸(Boric Acid)或硼酸(boracic acid) [B(OH)3]是有弱抗微生物性质的弱无机酸。在体外，硼酸对白色念珠菌(C.albicans)以及非白色念珠菌包括热带念珠菌(C.tropicalis)、光滑念珠菌(C.glabrata)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)的临床分离株弱抑制真菌(Shubair, 1990;Pruttingl998)。While硼酸也在体外显示对通常的细菌性病原体包括葡萄球菌和链球菌，绿脓杆菌(P.aeruginosa)、大肠杆菌(E.coli)、和变形菌(Proteus),克雷伯氏菌(Klebsiella)和肠杆菌(Enterobacter)的抑菌活性(Meersl990)，硼酸的抗菌效应作用慢，与许多抗生素相反，似乎不依赖于细胞生长，因为已经显示分裂期细胞和稳定期细胞同样受影响(Meers1990)。硼酸的弱抗微生物性质使它令人惊讶:硼酸将对阴道感染的治疗有效，尤其是天然抗药的、持续的和复发的那些阴道感染。
[0010]硼酸也显示其它生物效应。例如，已经显示硼酸在钙的调节中起作用并通过作用于细胞外基质形成和生长因子合成(DZOndO2002)而刺激创伤愈合。也已经显示硼酸在前列腺癌细胞系中具有抗增殖效应并在胃损伤的动物模型中具有细胞保护作用(Barranco2006) ; (Alsaif2004)。也有证据进一步支持:硼酸具有抗病毒活性，尤其是对单纯疱疹病毒(Skinnerl979;Rodul988)。在分子水平上，硼酸结合c/s —二醇化合物包括涉及细胞代谢和信号传导的膜多糖和核酸的碳水化合物部分(例如，RNA、NAD、ATP)，这可部分地解释所报导的硼酸对膜和细胞功能的效应(Kim2006);然而硼酸与乙二胺四乙酸(EDTA)的组合已经在体外证明对角膜渗透性的独特协同作用(Kikuchi2005)。

【发明内容】

[0011]本发明一般涉及令人惊讶的发现:硼酸可用于治疗和/或预防阴道感染，由于其作为阴道生物被膜破坏的角色。我们假定:生物被膜在阴道感染中，尤其在阴道炎中，且更具体地讲，在细菌性阴道病(BV)、女阴阴道念珠菌病(VVC)(亦称为"阴道酵母菌感染")、和滴虫病中扮演重要的角色。
[0012]在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的、包含硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)的药物组合物。
[0013]在本发明药物组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg—约10g，且更优选约0.1mg-约lg，且甚至更优选约Img —约250mg。
[0014]在本发明药物组合物中，EDTA的量优选为约0.0Olmg —约lg，且更优选约0.01mg —约 250mg。
[0015]在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1:1 一约1000:1。
[0016]在另一实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2:1 — 100:1。
[0017]在另一实施方案中，本发明的药物组合物还包含一种或多种生物活性试剂，该生物活性试剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油、锌离子、和镓。
[0018]在另一实施方案中，本发明的药物组合物还包含至少一种添加剂，该添加剂选自胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂、和生物粘附剂。
[0019] 在一个实施方案中，本发明的药物组合物还包含适用于阴道和/或女阴给药的药学上可接受的载体。[0020]在另一实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括在没有任何治疗量的醋酸时，将有效治疗量的硼酸给予有需要的患者。
[0021]在 另一实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将有效治疗量的包含硼酸和EDTA的药物组合物给予有需要的患者。
[0022]在一个实施方案中，本发明的方法包括将药物组合物每日一次至每日三次应用至阴道和/或女阴。
[0023]在另一实施方案中，本发明的方法包括将药物组合物间歇地例如每周两次应用至阴道和/或女阴，作为预防。
[0024]在另一实施方案中，将本发明的药物组合物局部应用至患者的阴道和/或女阴。
[0025]药物组合物可以以下面的形式应用:栓剂、软膏剂、霜剂、固体(例如，片剂、胶囊、ovule、栓剂)、溶液、悬浮液、凝胶剂、泡沫剂、薄膜、或脂质体组合物。药物组合物也可包含于阴道环、棉塞、栓剂、海绵、垫座、粉扑、或渗透泵系统内。
[0026]本发明的药物组合物可以与其它药学活性化合物例如与甲硝唑联合给药。
[0027]也可利用各种聚合物、纤维、树脂、蜡、油、或药物化学领域的那些技术人员所使用的其它药用赋形剂，将药物组合物的剂型配制成缓释剂型，以产生药物组合物活性组分的延长释放。
[0028]在一个实施方案中，阴道感染是细菌感染。
[0029]在另一实施方案中，阴道感染是女阴阴道念珠菌病。
[0030]在还另一实施方案中，阴道感染是滴虫病。
[0031]在还另一实施方案中，阴道感染是病毒感染。
[0032]假如不适当治疗的话，那么阴道感染可导致泌尿道感染。因此，在另一实施方案中，本发明涉及泌尿道感染的治疗和预防。
[0033]在还另一实施方案中，阴道感染由选自细菌、真菌、寄生虫、和病毒的两种或多种病原体引起，并称为混合感染。
[0034]在另一实施方案中，本发明涉及包含包装材料和在包装材料内的本发明药物组合物的制品。药物组合物占足以治疗阴道感染或致病性阴道生物被膜患者的量，优选占等于至少一个单位剂量的量。包装材料包含标签，该标签指示药物组合物可以用于治疗阴道感染和相关的致病性阴道生物被膜。优选标签包括其它印刷标记例如成分列表、制造商的名称和地址等。优选包装材料也包括内置的印刷物包括负责药品管理的政府机构可以要求的组合物详细信息、其用于治疗阴道感染和致病性生物被膜的给药方法、副作用、禁忌症等标记。
【专利附图】

【附图说明】
[0035]图1是描绘BV病原体共生关系的图；
[0036]图2是以log(生物被膜负荷减少量)对未治疗的生物被膜对照的方式，来描绘硼酸和EDTA对白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的效应的图。
[0037]图3是以log(生物被膜负荷减少量)对未治疗的生物被膜对照的方式，来描绘硼酸和EDTA对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的效应的图。
[0038]图4是描绘用硼酸治疗的顽固性BV妇女的治愈可能性的Kaplan-Meier图。
【具体实施方式】
[0039]定义
[0040]当用于本文时，〃生物被膜〃指陷入自我产生的表聚糖基质内的、表面附着的、高度有结构的、单或多种微生物群，并显示不同的生物被膜表型，该基质使微生物容易在表面例如阴道粘膜上附着、集群和生长。
[0041]当涉及作为活性剂的化合物时，申请者有意使术语"化合物"或"活性剂"不仅包括具体的分子实体而且包括其药学上可接受的药理活性盐。
[0042]当用于本文时，术语〃治疗treating"和〃治疗treatment"指引起症状的严重度和/或频率的降低、症状和/或潜在原因的消除、症状和/或其潜在原因的发生的预防、和/或改善。因此，用所述本发明组合物"治疗"患者包括在敏感性个体中预防特定的病症，以及处理有临床症状的个体，以抑制病症或疾病或引起病症或疾病的消退。治疗可以包括预防、治疗、或治愈。例如，生物被膜的治疗包括预防在对生物被膜的发展敏感的患者中形成生物被膜，以及通过抑制、控制潜在的疾病或引起潜在疾病的消退来治疗生物被膜患者。
[0043]当用于本文时，术语〃阴道〃有意包括阴道区域，一般也包括女阴、前庭、和宫颈。
[0044]术语〃阴道感染 〃包括任何阴道区域包括女阴、前庭、和宫颈的任何感染性病症包括生物被膜相关性感染。术语也包括复数的阴道感染。
[0045]术语〃破坏〃有意包括对生物被膜施加任何的损伤和所有的损伤。
[0046]术语〃有效治疗量〃的本发明药物组合物指在可应用于任何药物治疗的合理的利益/风险比率下治疗病症的足量的组合物。然而，应理解:将由主治医师在可靠医学判断的范围内决定本发明组合物的每日总用量。用于任何特定患者的具体有效剂量水平将依赖于许多种因素，包括正被治疗的病症和病症的严重度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所使用的特定化合物的给药时间、给药途径、和排泄速率；疗程；与所使用的特定化合物联合或同时使用的药物；和在医学领域中熟知的相似因素。例如，本领域的技术良好:组合物的起始剂量低于达到预期疗效所需的水平，并逐渐增加剂量直至达到预期效应。
[0047]当用于本说明书和附加的权利要求书时，单数形式"a"、"an"和"the"包括复数指示物，除非上下文另有清楚地描述。因此，例如，参考〃生物活性试剂〃包括两种或多种生物活性试剂的混合物，参考"药学上可接受的赋形剂"包括此类赋形剂的多种混合物等。
[0048]本发明涉及用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的、包含硼酸和EDTA的药物组合物。
[0049]在本发明的药物组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg —约10g，更优选为约0.1mg 一约Ig,且甚至更优选为约Img —约250mg。
[0050]在本发明药物组合物中，EDTA的量优选为约0.0Olmg —约lg，且更优选约0.01mg —约 250mg。
[0051]在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1:1 一约1000:1。
[0052]在另一实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2:1 — 100:1。[0053]本发明的药物组合物还包含一种或多种生物活性试剂，该生物活性试剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油、锌离子、和镓。这些生物活性试剂可增强和/或补充硼酸和EDTA的生物被膜破坏效应。
[0054]例如，可将镓添加至药物组合物，以通过靶定致病性微生物的铁代谢并用其在生物被膜形成中的信号传导角色干扰，来增强硼酸和EDTA的生物被膜破坏效应。
[0055]可添加锌离子或其盐，以增强硼酸和EDTA的生物被膜破坏效应。
[0056]可将表面活性剂添加至药物组合物。表面活性剂可通过进一步降低表面张力并促进活性物质的分散来提供组合物与阴道粘膜的更佳表面接触，或可具有抗生物被膜性质，这可补充所述硼酸和EDTA组合物的那些性质。可添加的表面活性剂包括但不限于硫酸月桂基酯和tecpol等。
[0057]本发明的药物组合物还包含其它添加剂例如胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂、和生物粘附剂。
[0058]本发明的药物组合物还包含适用于阴道和/或女阴给药的药学上可接受的载体。
[0059]本发明的药物组合物可包括生理学上可容许的防腐剂。
[0060]合适的生理学上可容许的防腐剂包括制菌剂、防腐剂、抑制剂等，例如对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、和丁酯(对羟基苯甲酸酯类)；没食子酸丙酯；山梨酸及其钠盐和钾盐；丙酸及其钙盐和钠盐；6_乙酸氧基-2，4-二甲基-m-二B,惡烧；2-溴代-2-硝基丙烷-1，3-二醇；水杨苯胺类例如二溴代水杨苯胺和三溴代水杨苯胺、1-(3-氯丙烯基_3，5，7-三氮杂-1-氮杂金刚烷氯化物的 顺式异构体；六氯酚；苯甲酸钠；酚类化合物例如丁基羟茴香醚、丁基轻甲苯、氯甲酌类和溴甲酌类、和chloro-oxylenols与bromo-oxylenols ;季胺类化合物例如苯扎氯铵；芳香醇类例如2-苯乙醇和苯甲醇；三氯叔丁醇；喹啉衍生物例如碘氯羟基喹啉等。优选，防腐剂占组合物总重量的约0.05%重量一约0.2%重量。
[0061]可以包括于本发明药物组合物中的药学上可接受的赋形剂包括，例如，在本领域中熟知的生理学上可容许的表面活性剂、溶剂、软化剂、着色剂、香料等。优选组合物具有约
3.5 —约7的pH值，更优选约4 — 4.5的pH值。
[0062]本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将有效治疗量的硼酸给予有需要的患者。
[0063]本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的方法，该方法包括将有效治疗量的硼酸和EDTA给予有需要的患者。
[0064]不结合任何具体的理论，认为硼酸可通过以下而起作用:与致病性生物被膜基质的碳水化合物组分优先结合并刺激蛋白酶的合成，因此破坏生物被膜的结构完整性及其阴道粘膜粘附。硼酸也可在BV生物被膜中提供附加的优点，因为其通过形成硼酸铵而化学〃俘获〃氨的能力(Thiex NJ等.2002)。该关联性涉及对于阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)所述的BV生物被膜的初级细菌成分与二路普雷沃氏菌(P.bivia) —续发BV病原体的共生关系(Pybusl997)。体外研究支持:阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)利用二路普雷沃氏菌(P.bivia)代谢的氨副产物而茁壮成长，同时二路普雷沃氏菌(P.bivia)利用阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的氨基酸副产物而茁壮成长。图1以图的形式显示该共生关系。因此，硼酸的阴道给药可通过俘获氨并耗尽细菌生长和生物被膜形成与存活所需的BV必需营养素的阴道微环境，而中断该共生关系。[0065]本发明也涉及治疗和/或预防阴道感染的方法，该方法包括将有效治疗量的包含硼酸和EDTA的药物组合物给予患者。
[0066]在本发明的药物组合物中，硼酸的量优选为约0.01mg —约10g，更优选为约0.1mg 一约Ig,且甚至更优选为约Img —约250mg。
[0067]在本发明药物组合物中，EDTA的量优选为约0.0Olmg —约lg，且更优选约0.01mg —约 250mg。
[0068]在一个实施方案中，硼酸对EDTA的相对量以重量计为约1:1 一约1000:1。
[0069]在另一实施方案中，EDTA与硼酸的相对量为约2:1 — 100:1。
[0070]在一个实施方案中，本发明的方法包括将药物组合物每日一次至每日三次应用至阴道和/或女阴。
[0071]在另一实施方案中，本发明的方法包括将药物组合物间歇地例如每周两次应用至阴道和/或女阴，作为 预防。
[0072]将本发明的药物组合物局部应用至患者的阴道和/或女阴。
[0073]药物组合物可以以下面的形式应用:栓剂、软膏剂、霜剂、固体(例如，片剂、胶囊、ovule、和栓剂)、溶液、悬浮液、凝胶剂、泡沫剂、薄膜、或脂质体组合物。软膏剂和霜剂可，例如，用水性或油性基质且添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。应用本发明组合物的一种技术是利用含预期的单个单位剂量的单人使用的口袋(例如小信封样结构等)。口袋最初密封，但在使用的时间，通过撕裂、切割等，在口袋中预期的位置或计划好的位置打开，此后如所标记的可直接服用内容物。
[0074]药物组合物也可包含于阴道环、棉塞、栓剂、海绵、垫座、粉扑、或渗透泵系统内。
[0075]本发明的药物组合物可以与其它药物组合物例如与甲硝唑联合给药。
[0076]也可利用各种聚合物、纤维、树脂、蜡、油、或药物化学领域的那些技术人员所使用的其它药用赋形剂，将药物组合物的剂型配制成缓释剂型，以产生药物组合物活性组分的延长释放。
[0077]在一个实施方案中，阴道感染是细菌感染。
[0078]在另一实施方案中，阴道感染是女阴阴道念珠菌病。
[0079]在还另一实施方案中，阴道感染是滴虫病。
[0080]在还另一实施方案中，阴道感染是病毒感染。
[0081]假如不适当治疗的话，阴道感染可导致泌尿道感染。因此，在另一实施方案中，本发明涉及泌尿道感染的治疗和预防。
[0082]在还另一实施方案中，阴道感染由选自细菌、真菌、寄生虫、和病毒的两种或多种病原体引起。
[0083]当用于治疗与生物被膜形成相关的阴道感染时，该类方法和药物组合物可以与其它抗微生物疗法包括抗细菌药、抗真菌药、抗寄生虫药或抗病毒药联合使用，以赋予其抗微生物效能和/或减少其剂量需求。
[0084]此外，也可将本发明的方法和药物组合物用作其它药物例如抗生素、抗真菌药、抗寄生虫药和抗炎药的载体材料，因此还增宽组合物的医疗效能。
[0085]给予人或低等动物的本发明组合物的每日总剂量可以为约IOOmg/天一约15g/天。更优选的剂量可以为约500mg/天一约5g/天。假如期望的话，为了给药的目的，可以将每日有效剂量分成多个剂量；因此，单剂量组合物可包含该量或其约数，以凑足每日剂量。
[0086]本发明也涉及包含包装材料和包装材料内的本发明药物组合物的制品。药物组合物占足以治疗患者阴道感染和/或破坏患者致病性阴道生物被膜的量，优选占等于至少一个单位剂量的量。包装材料包含标签，该标签指示药物组合物可以用于治疗阴道感染和/或分裂致病性阴道生物被膜。优选，标签包括其它印刷标记例如成分列表、制造商的名称和地址等。优选，包装材料也包括内置的印刷物包括负责药品管理的政府机构可以要求的组合物详细信息、其用于治疗致病性阴道生物被膜的阴道感染的给药方法、副作用、禁忌症等
[0087]如实施例所示，提供的组合物和方法证明本发明方法和药物组合物的意外优良的性质。实施例仅用作例证性的目的，并无意限制本发明，除非在权利要求书中另有说明。
[0088]实施例1
[0089]通讨硼酸和EDTA而分裂白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氐菌(G.vaginalis)牛.物被膜
[0090]A)实验方法:
[0091]使用CDC 生物被膜反应器(Biosurface Technologies Corporation),在体外研究各种试验浓度的硼酸和EDTA，单独和组合，对白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的生物被膜破坏效应。在 Center for Biofilm Engineering inBozeman, Montana进行实验。基于其重现性和能力来选择⑶C生物被膜反应器方法，以提供抗微生物剂评估所需的一致的生物被膜样品和生长条件。作为生物被膜实验的前奏，利用标准MIC方法，建立硼酸和EDTA对两种试验有机体的浮游生物的(即，自由浮游的对相关生物被膜的)MIC值。与白色念珠菌(C.albicans)相反，以前还没有报导硼酸和EDTA对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值。
[0092]⑶C反应器由悬挂于汽门盖的8个聚碳酸酯取样管支架组成。各支架调节3支分开的取样管。将有取样管支架和取样管的盖子(lid)，共24个，装入有侧壁排卸孔的I升玻璃容器内。通过使液体生长培养基循环经过容器，同时由通过磁性搅拌平板旋转的磁性搅拌棒/叶片产生混合和剪切力，来形成生物被膜。
[0093]在涉及本发明的生物被膜实验的配制中，通过将ImL冷冻的储用液添加至9mL生长培养基(阴道加德纳氏菌(G.vaginalis) ATCC#14018在50%BHI肉汤+1%淀粉中，或白色念珠菌(C.albicans) ATCC#96113在50%SD肉汤+1%蔗糖中)，并在37°C温育24小时，来配制白色念珠菌(C.albicans)和阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的过夜培养物。白色念珠菌(C.albicans)在大气条件下生长,而阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)在添加5%C02时生长。
[0094]一旦准备好过夜培养物，就将24支聚碳酸酯取样管置于⑶C生物被膜反应器取样管支架内，并使用螺丝起子将该取样管固定。然后将流入/流出的管端阻止并夹住，且使整个容器高压灭菌20分钟。将合适的培养基直接添加入反应器内直到流出的侧臂(约350mL)。然后用4mL的过夜培养物温育反应器。为了易于最佳的生物被膜生长，使白色念珠菌(C.albicans)反应器在大气条件下在37°C温育，且按最低的设置连续搅拌24小时。将阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)反应器置于5%C02温育箱中，且按最低的设置连续搅拌120小时。将该生物被膜形成期称为〃分批模式〃。在完成分批模式之后，生长培养基流开始按lmL/min流动,经螺动泵持续流动另外24小时。
[0095]其次，将24个生物被膜覆盖的取样管从⑶C反应器中无菌地移除，并置于24孔平板内，且各孔含2mL的试验溶液。使试验溶液按一式三份进行试验并包括不同浓度的硼酸(BA)和EDTA或其组合。也包括基于目前治疗标准的用于各自感染的生长对照和活性对照。选择8 μ g/mL的氟康唑作为用于白色念珠菌(C.albicans)的治疗对照。这表示在生物流体和组织包括阴道分泌物和组织中达到的药物水平范围的高限(4.12 - 8.08 μ g/mL)，接着氟康唑的口服剂量在400mg的最大日剂量(多于FDA目前批准用于阴道念珠菌病的剂量的双倍)。用于阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的活性对照是192 μ g/mL的甲硝唑。该浓度部分地基于甲硝唑对在该研究中发现的阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值(128 μ g/mL)，并表示落在由其它研究者所报导的MIC值的高限的保守水平。也记录到:该水平比用批准的750mg BV用药法(Flagyl ERk )所达到的甲硝唑的峰全身水平更高大于8倍。
[0096]将各试验溶液溶于适当的介质并在使用前过滤灭菌。然后使平板在适当的生长条件下温育24小时。在24小时治疗期之后，通过除去孔内的溶液并添加2mL的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)，来冲洗所有的取样管。重复该程序，总共冲洗两次。然后将取样管无菌地转移至含IOmL无菌PBS的15mL无菌锥形瓶。将管旋涡振荡30秒，声处理2分钟，并然后再旋涡振荡30秒。将细胞悬液连续稀释并倒在琼脂平板上(SD琼脂用于白色念珠菌(C.albicans)而BHI+1%淀粉用于阴道加德纳氏菌(G.vaginalis))。平板温育24-48小时并菌落计数。结果报导为每cm2菌落形成单位(cfu)数和相对于未治疗的生物被膜对照的生物被膜负荷的平均减少量的对数。
[0097]B)生物被膜破坏:
[0098]在这些实验中，硼酸和EDTA显示对已建立的生物被膜有极深的影响，良好地超过对活性对照所观察的结果，并始终在有效杀死所需阈值(即，杀菌活性与抑菌活性比较)的对数的3倍之上。在事实上，活性对照一两种FDA批准的抗微生物剂一对各自的致病性生物被膜均没有可感知的影响。
[0099]对于白色念珠菌(C.albicans)，观察硼酸和EDTA组合的协同效应，如图2所示。
[0100]图2是描绘硼酸和EDTA对白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的效应的图。如图2所示，当硼酸和EDTA按其浮游生物MIC值(分别为1.56mg/mL和0.78mg/mL)组合时，与各个试剂单独的较高浓度相比，达到3.67cfu/cm2的生物被膜负荷的最大减少量的对数。这表示与未治疗的生物被膜对照相比，生物被膜负荷减少99.8%，并显示:硼酸，尤其是当与EDTA组合时，给予抗白色念珠菌(C.albicans)生物被膜的杀真菌活性。这些发现是值得注意的，且是根据硼酸抗浮游生物细胞的弱抑制真菌活性完全料想不到的，且对FDA批准的抗微生物剂抗敏感性浮游生物病原体所报导的杀灭数量的对数一一般为减少量的约2-4对数的细胞系令人惊讶。
[0101]用因硼酸与EDTA的组合而达到的抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜协同效应，证明甚至更加给人深刻印象的结果。图3是描绘该效应如生物被膜负荷中对数减少的数据图。40mg/mL的硼酸与10mg/mL的EDTA组合导致阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜的完全根除，然而这些试剂按其低浮游生物MIC值一分别为3.125mg/mL和0.19mg/mL—的组合与未治疗的生物被膜对照比较，致使生物被膜负荷降低99.7%。形成鲜明的对比，甲硝唑活性对照对阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜具有很小的影响，且与硼酸和EDTA组合物相比的差异相当显著。此外，这些发现是无先例的并无法基于硼酸的弱抗微生物性质和为该研究确定的这些试剂抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的浮游生物MIC值来预报的。
[0102]当认为:杀菌剂(例如β —内酰胺类抗生素)需要直至比其浮游生物的MICs更高1000倍(或更多)的浓度，以有效抑制按生物被膜生长模式的敏感有机体时，用浮游生物MIC值的本发明试剂同时抗假丝酵母(Candida)和加德纳菌(Gardnerella)生物被膜而达到的料想不到的协同作用值得注意。这些发现支持所提出的硼酸作为生物被膜分裂剂的作用机制。
[0103]按照以下事实结果相当值得注意:将还没有基于这些试剂的相对弱的抗微生物活性和在该抗阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)的研究中首次确定的浮游生物MIC值预报生物被膜破坏。
[0104]这些数据的治疗相关性在于三个方面:1)与可利用的疗法相比的抗生物被膜相关性阴道感染的优越临床效能；2)因极低浓度活性物和急剧降低局部和全身暴露风险而改善的患者安全性；和3)发展常使阴道炎治疗复杂化的继发性感染(尤其是女阴阴道念珠菌病)的低可能性。
[0105]比较实施例
[0106]为了比较的目的，参考以下研究，Swidsinski等，在口服甲硝唑标准治疗之后粘附的阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)生物被膜持续在阴道上皮上。Am J ObstetGyneCO12008; 198(1):97.el-6，该研究在标准口服甲硝唑治疗后的阴道活组织检查上评估BV生物被膜特征。在该研究中，18个BV患者每次500mg每日两次口服甲硝唑，治疗7天，并使用标准临床和微生物学方法评估以证实诊断和评价临床反应。要求各患者返回她们经过阴道活组织检查的单个跟踪，这允许使用荧光原位杂交技术的阴道生物被膜的直接目测。随机指定妇女在治疗的第3天或在完成治疗后的第7、14、21、28或35天，在这6个可能的时间点之一返回跟踪。
[0107]结果证明在各时间点基于标准的临床和微生物学方法的BV消退。然而，阴道活组织检查结果显示了不同的图像，显示核心致病性细菌，尤其是阴道加德纳氏菌(Gvaginalis)和阿托波氏菌(Atopobium),在粘附的生物被膜中的持续累积，随着时间的过去变得更加显著。显著地，从这些妇女获得的所有阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)分离株用常规的浮游生物的MIC试验显示对甲硝唑的良好易感性。这可良好地解释所报导的标准BV治疗的低治愈率，并进一步将这些结果与这些介入不能有效地分裂潜在的致病性生物被膜联系起来。在该比较实施例中获得的结果与在实施例中所证明的结果形成鲜明的对比，显示用硼酸和EDTA的组合完全根除阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)生物被膜并确认甲硝唑的最低影响。
[0108]实施例2
[0109]通过使用硼酸治疗高度顽固性复发性BV患者
[0110] 在复发性BV患者组中使用硼酸进行回顾性病例调查。硼酸用作抗微生物剂，作为6个月连续治疗协议的一部分。为了取得协议治疗的资格，所有妇女以前均失败于甲硝唑阴道凝胶剂的诱导和长期维持用药，并因此具有高度耐药性感染。[0111]除硼酸之外，所使用的所有其它抗微生物剂也均被FDA批准用于BV。6个月的协议如下:
[0112]1.诱导:毎日两次口服甲硝啤或替硝啤，持续7 — 10天
[0113]2.硼酸治疗:每日将600mg明胶胶囊插入阴道，持续21天
[0114]3.维持:每周两次甲硝唑阴道凝胶剂，持续5个月
[0115]在6个月结束时结果显示:临床治愈77%(24/31)的患者一即，对于用于BV的Amsel氏临床标准来说无症状或阴性。在9个月(即，在维持之后3个月)67%保持治愈。缓解的持续时间中位数是8.7个月。值得注意的是，在硼酸治疗期间没发生治疗失败且无患者经历继发酵母菌感染或因为不良事件或不耐受任何分量的用药法而中断。
[0116]为了进一步验证这些发现，在高度难治愈BV妇女中进行使用硼酸的预期计划的临床研究。与回顾的病例组相似，硼酸用作抗微生物剂作为连续治疗协议的一部分；然而，加入该研究的妇女不同于以下病例组中的那些妇女，在该病例组中她们的感染甚至对治疗更加耐受一在加入之前的12个月内所有的妇女均在至少三种以前的抑制性方案中失败。同样，所有患者均具有鲜明的感染症状，有恶臭排出物并存在所有四种临床诊断标准(Amsel氏)，包括在阴道湿涂片检查中有>20%的线索细胞。
[0117]总共58个患者每日两次，持续7天采用标准口服剂量硝基咪唑治疗(甲硝唑或替硝唑)，接着每日将600mg硼酸明胶胶囊插入阴道，持续21天，进行〃标签公开〃治疗。然后每周两次将被确定临床治愈的患者置于甲硝唑阴道凝胶剂的维持用药法，一直到另外5个月。
[0118]在硝基咪唑/硼酸诱导之后，8%的低临床失败率早证明给人深刻印象的结果。类似地，在甲硝唑凝胶维持时，突破性感染格外低，仅12%。如图4所示，在12、16和28周之后，在这些难治愈的病例中治愈的累积比例令人惊讶地高一分别是87%、78%和65%。同样，缓解的持续时间中位数是9个月，这与在初始病例组中所记录的(8.7个月)相似。
[0119]当与以下情况并列时，这些发现最给人深刻的印象:对用标准疗法治疗的原发性、非并发性BV妇女所报告的30% - 70%短期治愈率、和在9个月内复发的高度可能性一直至80%。
[0120]比较实施例
[0121]为了比较的目的，参考Sobel JD等，用0.75%甲硝唑阴道凝胶剂抑制治疗以预防再发生细菌性阴道病，Am J Obstet Gynecol2006; 194:1283-1290，该文献报导了使用描述以上实施例但无硼酸的相似治疗协议，在复发BV的妇女中更严格的甲硝唑阴道凝胶剂对照临床研究的结果。
[0122]研究包括10天甲硝唑阴道凝胶剂诱导期，接着4个月每周两次的维持用药法和3个月无治疗的跟踪期。在结束4个月的维持期时，临床上治愈了 74.5%(38/51)的患者。然而，在维持之后的3个月，保持治愈的概率仅为34%，而缓解的持续时间中位数为4 一 5个月(相对于在实施例中8.7 — 9个月)。在维持期发生的突破性感染比率是25%。这与在实施例中所报导的低于一般的比率12%形成了鲜明的对比。此外，在需要在研究期间的某一点对VVC抗真菌治疗的比较实施例中，59.3%的妇女继发酵母菌感染，然而在病例组中无妇女继发酵母菌感染、
[0123]实施例与比较实施例之间的差异是显著的，尤其认为:补充许多这些患者，因为甲硝唑阴道凝胶剂的更严格的对照维持研究失败。在实施例中硼酸的相对贡献及其作用机制仍然未知，但给以下体外发现提供了临床支持:硼酸具有与治疗有关的生物被膜破坏性质，添加EDTA增强了该性质。在实施例中记录到的没有并发VVC可能涉及硼酸的抗真菌活性，并表示硼酸超过当前所批准的BV疗法的另一重要优点。
[0124]1表明:在 实施例的预期部分中将一些患者置于预防性抗真菌治疗中，这预先排除该并发症的准确评估。
【权利要求】
1.一种用于治疗和/或预防阴道感染和/或致病性阴道生物被膜的药用组合物，所述药用组合物包含治疗有效量的硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)，其中所述药用组合物还包含适用于阴道和/或外阴给药的药学上可接受的载体。
2.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含生物活性剂，所述生物活性剂选自香柠檬油、茶树油或其它精油和锌离子。
3.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含添加剂，所述添加剂选自胶凝剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、去污剂、油、醇、乳化剂、增溶剂、湿润剂和生物粘附剂。
4.权利要求1的药用组合物，所述药用组合物还包含另外的治疗活性物质。
5.权利要求4的药用组合物，其中所述另外的治疗活性物质为甲硝唑或替硝唑。
6.一种制品，所述制品包括包装材料和在所述包装材料内的权利要求1的药用组合物。
【文档编号】A61P31/02GK103933063SQ201410034920
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2008年11月26日 优先权日:2007年11月30日
【发明者】S.戈顿, D.弗林 申请人:托尔特克制药有限责任公司