靶向adgb的抑制性rna及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药与基因治疗领域，本发明提供了一种可以特异性抑制ADGB蛋白表达的siRNA或shRNA，并且提供了siRNA或shRNA在制备ADGB靶蛋白表达抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
【专利说明】靶向ADGB的抑制性RNA及其在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药及基因治疗领域，特别是设计靶向ADGB(Androglobin，ADGB)的抑制性多核苷酸及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]Androglobin (ADGB)是一种新发现的珠蛋白。ADGB的mRNA参考序列(genebankaccession:NM_024694.3)有5300bp，是一个包含1667个氨基酸残基的蛋白。它包括一个calpain-7蛋白大亚基的催化结构域II样结构域、一个globin结构域、一个可供钙调蛋白结合的IQ样结构域。IQ样结构域位于globin结构域之内，把globin结构域分为了C-H段和A-B段两部分。虽然重组表达人ADGB的珠蛋白结构域表现出血红素铁原子的六配位的吸收光谱特性，但ADGB对组织缺氧并不敏感(David Hoogewijs等，AndroglobiniAChimeric Globin in Metazoans That Is Preferentially Expressed in MammalianTestes, Molecular Biology and Evolution,2012, April, 29 (4):1105 - 1114)0
[0003]当前有关ADGB的研究报道极为有限，在肿瘤中的作用未见报道。
[0004]Small interfering RNA(siRNA)是一种小 RNA 分子(~21-25 核苷酸)，由 Dicer(RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。
[0005]小发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)是一种形成急转弯结构的RNA序列,可以经由RNA干扰使基因沉默。
[0006]肿瘤是威胁人类健康的疾病之一，至今缺少理想的治疗手段和药物，开发新的药物迫在眉睫。基因治疗是非常`有前景的，在不久的将来或许会成为肿瘤治疗的一个有效手段。RNA干扰技术是一种沉默基因表达的技术，两名美国科学家Andrew Z.Fire和CraigC.Mello因对此项技术的贡献于2006年被授予诺贝尔生理学奖。RNA干扰技术的原理是较长双链RNA被特异核酸酶Dicer切割加工成21_23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA。小干扰RNA随后形成沉默复合体(RNA-1nduced silencing complex, RISC)解旋成单链。反义链引导该沉默复合体通过碱基配对特异性结合到目标mRNA上，使mRNA分解。
[0007]胶质瘤是一种发生于脑或脊髓的肿瘤，最常发生部位为脑，因其来源神经胶质细胞而被称为胶质瘤。胶质瘤占脑和中枢神经系统肿瘤的30%、占脑恶性脑肿瘤的80%，是人类健康的严重威胁。脑胶质瘤的治疗通常采用手术，放疗和化疗相结合。胶质瘤常发生于脑，手术需要开颅，手术时间长。胶质瘤和正常神经组织交错生长，边界不清，瘤组织不易清理干净，胶质瘤易复发。对于化疗，由于血脑屏障的存在，使普通的抗肿瘤药物疗效不佳。对于放疗，也存在定位困难和对神经损伤的担心。目前胶质瘤仍是医学界的一个难题。因此寻求新的治疗方法和药物迫在眉睫。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供了一种可以特异性抑制ADGB的表达siRNA或shRNA，本发明的另一目的在于，提供siRNA或shRNA在制备ADGB靶蛋白表达抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
[0009]本发明人在前期研究发现ADGB可影响细胞凋亡信号，进一步研究发现干扰ADGB的表达能抑制胶质瘤细胞系的增殖，是治疗胶质瘤潜在的靶点。
[0010]发明结合ADGB分子在瘤细胞中的功能，利用RNA干扰技术开发新的治疗药物。
[0011]本发明首先设计了靶向ADGB的siRNA，之后再设计成shRNA分子，特异性抑制ADGB的表达，从而抑制胶质瘤的增殖。该siRNA和shRNA分子可能会成为治疗胶质瘤的药物。
[0012]本发明的第一方面，是提供一种可以特异性抑制ADGB的表达siRNA或shRNA，
[0013]本发明提供了一种特异性抑制Androglobin表达的siRNA,包括正义链和反义链，此siRNA序列为:
[0014]正义链:5’-GCAUUUACAGGCGACACAUAU-3’ (SEQ ID N0.1)
[0015]反义链:5，-AUAUGUGUCGCCUGUAAAUGC-3，(SEQID N0.2)
[0016]本发明还提供了一种特异性抑制Androglobin表达的shRNA,该shRNA包含上述的siRNA序列，也包括正义链和反义链，此shRNA序列为:
[0017]正义链:
[0018]5，-CCGGGCAUUUACAGGCGACACAUAUUUCAAGAGAAUAUGUGUCGCCUGUAAAUGCUUUU-3，(SEQID N0.3)
[0019]反义链:
[0020]5，-AAUUCAAAAAAGCAUUUACAGGCGACACAUAUUCUCUUGAAAUAUGUGUCGCCUGUAAAUGC-3，(SEQ ID N0.4)
[0021]本发明还提供了一种转录上述的shRNA的DNA序列，此DNA序列为:转录正义链的DNA:
[0022]5，-CCGGGCATTTACAGGCGACACATATTTCAAGAGAATATGTGTCGCCTGTAAATGCTTTT-3，(SEQID N0.5)
[0023]转录反义链的DNA:
[0024]5，-AATTCAAAAAAGCATTTACAGGCGACACATATTCTCTTGAAATATGTGTCGCCTGTAAATGC-3，(SEQ ID N0.6)
[0025]本发明的第二方面，是提供上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备Androglobin蛋白表达抑制剂中的应用。
[0026]进一步地，本发明还提供了上述的siRNA、shRNA，或DNA序列在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
[0027]本发明的主要技术方案包括:
[0028]1.siRNA的设计和干扰载体的制备；
[0029]2.干扰慢病毒颗粒的包装；
[0030]3.干扰效率在mRNA水平的验证；
[0031]4.MTT法检测干扰ADGB后对胶质瘤细胞系U373、U87、U251增殖的影响；
[0032]5.克隆形成法检测干扰ADGB后对U87、U252细胞系的影响
[0033]本发明经细胞实验证明，本发明提供的siRNA、shRNA，或DNA序列可以有效地抑制人ADGB基因的表达，治疗胶质瘤疾病，减少病人由于放疗、化疗带来的痛苦以及疾病的复发。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是定量PCR法检测U373细胞系的ADGB mRNA水平情况；
[0035]图2是MTT法检测干扰ADGB抑制U251 (图2A)、U87 (图2B)、U373 (图2C)细胞系生长情况；
[0036]图3克隆形成法检测干扰ADGB抑制U251和U87细胞形成克隆；
[0037]图1-3中含有空载体的病毒(control)和干扰ADGB的病毒(shADGB)。
【具体实施方式】
[0038]下面结合附图对本发明进一步说明。以下实施方式只是较佳的实施方式中的一种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。
[0039]本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆:实验室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0040]实施例1:siRNA的设计和干扰载体的制备
[0041]从NCBI 网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)下载 ADGB mRNA (GenebankAccession:NM_024694.3)的互补 DNA(Complementary DNA, cDNA)序列信息。使用 LifeTechnologies 的 BLOCK-1T?RNAi Designer 设计针对 ADGB 的 shRNA,得到 10 条祀点序列。
[0042]在NCBI的同源序列比对分析nucleotide blast中输入祀点序列进行比对分析，要求靶点序列和人的其它mRNA基因没有高度同源性，可作特异性干扰ADGB的干扰靶点。再根据这些序列按Sense-1oop-Antisense的顺序人工设计shRNA, sense是指祀点序列的正义链，antisense是指祀点序列的反义链,loop是指形成环的序列,这里使用UUCAAGAGA。再在两端加上限制性内切酶AgeI和EcoRI识别的序列，得到如下所示针对一个靶点的两条shRNA序列:
[0043]正义链:5’-CCGG-sense-UUCAAGAGA-antisense-UUUU-3’
[0044]反义链:5’-AAUUCAAAAAA-sense-UCUCUUGAA-antisense-3，
[0045]把上面的RNA序列对应的DNA序列委托invitrogen公司合成得到DNA01 igo。
[0046]DNA Oligo 加入 ddH20 溶解，浓度 10mM。各别取 22.5ul 的 DNA Oligo 与 5ul 的IOX 退火缓冲液(成分为 IOOmM Tris-HCl (pH7.5), IOmM EDTA, ImM NaCl)混合，95°C水浴12min后拿出，在室温下冷却至室温。25°C下，用T4连接酶(日本TAKARA公司生产)将互补双链与Age1、EcoRI酶切的pLKD-CMV-GFP-U6_shRNA载体连接30min，体系按说明书配制(DNA4 μ I,载体 2 μ 1，PEG40002 μ I, IOXT4buffer2 μ I, Τ4 连接酶 I μ I, ddH209 μ I)。
[0047]取连接产物加入装有大肠杆菌DH5 α感受态细胞的1.5ml规格离心管使其混合，置于冰上30分钟,然后放入42°C水浴90秒,再放回冰上2分钟后加入800 μ I不含抗生素的培养基，置37°C细菌培养箱中摇I小时。4500转/分离心收集得到的细菌后涂固体LB培养基平板，37°C细菌培养箱过夜培养至长出菌落。挑取单克隆置1.5ml规格离心管进行培养，用PCR方法鉴定是否转化成功，鉴定所用的引物为:
[0048]PLKD-F: CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA ；
[0049]PLKD-R:GAAATACGGTTATCCACGCG ；
[0050]转化成功的取样送测序(华大基因有限公司提供测序服务)，测序使用的引物是:PLKD-F: CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA。
[0051]取测序正确的细菌和5ml添加抗生素的培养基加入50ml规格离心管培养6小时，然后与200ml添加了抗生素的培养基一起倒入IL规格的培养瓶中扩大培养，使用QIAGENPlasmid Maxi Kit大抽试剂盒(德国凯杰生物技术有限公司生产)抽提出质粒,质粒抽提按QIAGEN Plasmid Maxi Kit说明书进行操作。通过以上操作得到pLKD_CMV-GFP-U6_shRNA质粒。
[0052]实施例2:干扰慢病毒颗粒的包装
[0053]在37 °C 5%C02的细胞培养箱中培养HEK293T细胞(下简称293T，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，培养基使用添加了 10%胎牛血清(美国纽约Gibco公司生产)的DMEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基。传代培养293T细胞于直径为IOcm的培养皿中，当细胞长到汇合度为50%左右，用无血清的培养基培养4小时。按Lipofectamine2000 (美国Invitrogen公司生产)说明书操作,准备好22.5 μ g上面得到的pLKD-CMV-GFP-U6-shRNA质粒(或不含shRNA的空载体质粒)、7.9 μ g病毒外壳质粒psPAX2(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)、14.6 μ g包装质粒pMD2.G(中国上海纽恩生物科技有限公司提供)的转染混合物。
[0054]把混合物添加到已经饥饿培养过的细胞中进行转染，4-6小时后更换为正常的培养基。分别在换液培养24和48小时后收集培养基，经0.22 μ m孔径的膜过滤后，再用CP80MX离心机(日本日立公司生产)经4°C、100000g超速离心2小时，得到病毒沉积块。用OPT1-MEM(美国纽约Gibco公司生产)培养基重悬收集得到干扰ADGB的慢病毒(shADGB)和含有空载体的慢病毒(control)。
[0055]慢病毒的滴度测定采用稀释计数法，把293T细胞铺96孔板，每孔约5000个细胞，过夜培养。准备好用培养基10倍梯度稀释的病毒共10份，即最低、最高浓度分别为原液的1/10-10、1/10-1，每份100 μ I换掉对应孔的培养基培养过夜后更换正常培养基。换掉新鲜培养基再培养两天后，置荧光显微镜下观察最后两个有荧光的孔的荧光细胞的克隆数，用以下公式计算病毒滴度:滴度(TU/ml)= (X+Y*10)*10/ (2*Ζ)其中X是指倒数第二个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Y是指倒数第一个有荧光的孔的荧光细胞克隆数，Z是指X对应孔所加病毒的稀释率。
[0056]实施例3:干扰效率在mRNA水平的验证
[0057]胶质瘤细胞系U373 (购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞培养在370C 5%C02的细胞培养箱中，培养基为添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基。在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度，分别加入对照慢病毒感染颗粒和干扰ADGB的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。用PBS漂洗两次细胞，每次用PBS3ml，然后用2ml0.25%(w/v)胰蛋白酶消化细胞，1000转/分离心收集细胞。之后用试剂Trizol (美国Invitrogen公司生产)提取总RNA,按说明书进行操作。利用RT M-MLV (美国Promega公司生产)反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA，按说明书进行操作。荧光定量PCR使用SYBRPremix Ex Taq试剂盒(日本Takara公司生产),操作按SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书进行，用到的仪器为CFX96型定量PCR仪(美国Bio-Rad公司生产)。
[0058]使用的引物序列:
[0059]ADGB:5’ -AGACCCTCATCAGAAGTGCAG-3’ ；5’ -GCTACCAGAGGACAAG ACCTA CT-3’。
[0060]GAPDH:5，-AAGGTGAAGGTCGGA GTCAAC-3，；5，-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3，。
[0061]经过筛选，结果如图1所示,表明使用本发明的干扰RNA后，胶质瘤细胞系U373的ADGB mRNA水平明显降低。
[0062]实施例4 =MTT法检测干扰ADGB后对胶质瘤细胞系U373、U87、U251增殖的影响；
[0063]MTT法是检测细胞增殖的一种经典实验方法(Tim Mosmann, Rapid colorimetricassay for cellular growth and survival:Application to proliferation andcytotoxicity assays, Journal of Immunological Methods，，1983，65(1- 2):55 - 6，3)。胶质瘤细胞系U373、U87、U251 (购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞培养在37°C 5%C02的细胞培养箱中，培养基为添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基。在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度，分别加入实施例2得到的对照慢病毒感染颗粒和干扰ADGB的病毒感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。后用96孔板(美国Corning公司生产)培养，每孔约1500个细胞，每孔培养基150 μ I。
[0064]分别在如图2所示的时间点，每孔加入15 μ I浓度为5mg/ml的MTT (上海生工生物工程公司生产)继续孵育4小时。然后吸掉培养物，每孔加入150 μ 1DMS0，在酶标仪(美国Bio-Rad公司生产，iMarkl68-1130型)的490nm波长下测定吸光度。
[0065]结果如图2所示，表明干扰AD`GB能明显抑制U373、U87、U251的生长。
[0066]实施例5:克隆形成法检测干扰ADGB后对U87、U252细胞系的影响
[0067]胶质瘤细胞系U87、U251 (购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞培养在37°C 5%C02的细胞培养箱中，培养基为添加了 10%胎牛血清的DMEM培养基。在直径6cm培养皿中培养细胞至大约30%汇合度，分别加入实施例2得到的对照慢病毒(control)感染颗粒和干扰ADGB的慢病毒(shADGB)感染颗粒(感染复数为10)，继续培养细胞4天。后吹散为单个细胞，用6孔板培养(美国Corning公司生产)，每孔约500个细胞。培养14天，中途按需要换培养基。之后弃掉培养基，用乙醇固定30分钟，后用0.5%的结晶紫染色。
[0068]克隆形成实验结果如图3所示，表明干扰ADGB能明显抑制U251和U87细胞克隆的形成。
[0069]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种特异性抑制Androglobin蛋白表达的siRNA,包括正义链和反义链,其特征在于，siRNA序列为: 正义链如SEQ ID N0.1所示； 反义链如SEQ ID N0.2所示。
2.—种特异性抑制Androglobin蛋白表达的shRNA,包括正义链和反义链,其特征在于，shRNA序列为: 正义链如SEQ ID N0.3所示； 反义链如SEQ ID N0.4所示。
3.一种转录如权利要求2所述的shRNA的DNA序列，其特征在于，DNA序列为: 转录正义链的DNA如SEQ ID N0.5所示； 转录反义链的DNA如SEQ ID N0.6所示。
4.一种如权利要求1所述的siRNA在制备Androglobin蛋白表达抑制剂中的应用。
5.—种如权利要求2所述的shRNA在制备Androglobin蛋白表达抑制剂中的应用。
6.—种如权利要求3所述的DNA序列在制备Androglobin蛋白表达抑制剂中的应用。
7.—种如权利要求1所述的siRNA在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
8.—种如权利要求2所述的shRNA在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
9.一种如权利要求3所述的DNA序列在制备预防或治疗胶质瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103773767SQ201410034855
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】胡泽岚, 刘霁纬, 朱志川, 李奎, 郑静, 熊志奇, 刘永杰, 杨艳红, 王红涛, 祖勇, 张鑫 申请人:华东理工大学