细胞及组织的冷冻保存用组合物的制作方法

细胞及组织的冷冻保存用组合物的制作方法
【专利摘要】提供可不使用二甲基亚砜等的有害的冷冻保存剂地安全地冷冻保存包括人的动物或植物的细胞或组织的冷冻保存用组合物。另外，提供向食品或药品的冷冻保存或冷冻干燥制品的应用。使ε-聚-L-赖氨酸与无水琥珀酸反应使而阻断ε-聚-L-赖氨酸的氨基的60%以上。将如此得到的高分子化合物以7.5w/w%溶解于市售的培养液之一的Dulbecco-改良的Eagle培养基（DMEM）中而作为冷冻保存液。另外，向食品或药品添加0.5～10%ε-聚-L-赖氨酸琥珀酸衍生物而防止冷冻浓缩。
【专利说明】细胞及组织的冷冻保存用组合物
[0001]本申请是分案申请，母案的申请号为200980130709.0 (国际申请号PCT/JP2009/002941),申请日为2009年6月26日，发明名称为“细胞及组织的冷冻保存用组合物”。
【【技术领域】】
[0002]本发明涉及人及动物细胞及组织的冷冻保存用试剂，其能减轻在冷冻及解冻细胞及组织时对细胞及组织的损伤或伤害。此冷冻保存技术预期在需要冷冻保存活的组织(例如皮肤，角膜，胰岛及心脏瓣膜)的移植医学中，及在需要冷冻保存细胞(例如造血干细胞，间叶干细胞，胚胎干细胞，iPS细胞(诱导的多能干细胞)等)的再生医学中高度需求。
【【背景技术】】
[0003]在0°C或以下温度的冷冻保存技术常规用于长-时间保存带水的或含水物质(例如植物及动物的细胞及组织以及食品)。已知冷冻这些物质时，冰晶形成，得到不均匀浓度的被水分子排除的溶质及混入物，称为‘冷冻浓缩’。
[0004]为阻止冷冻浓缩，可将各低分子量化合物加入冷冻保存介质。例如，加入二甲基亚砜(DMS0)，甘油等作为冷冻-保护剂，以最小化由冷冻保存过程中细胞中的结晶化的水导致的对细胞及组织的损伤。
[0005]因此，细胞通常悬浮于冷冻管中的含5~20%冷冻保存剂(例如DMS0，甘油，乙二醇及丙二醇)的生理溶液，培养基中，及于低温，_80°C或_196°C保存。
[0006]这些试剂中，DMSO是最有效的及常采用的，但其在生理学上有毒，及已知当将细胞输注到受者时导致高血压，恶心及呕吐。而且，DMSO毒性倾向于衰减解冻的细胞培养或输注到受者身体后细胞的存活率和/或功能。
[0007]这些试剂中，甘油具有更低冷冻保存效果，及要求仅于室温或非冷冻低温保持细胞悬浮液后冷冻，或通过使用程序冷冻器等精确控制降低的温度。而且，因为它们对细胞生存及功能的低保护效果，所述冷冻保存剂对解冻的细胞有害。
[0008]冷冻保存干细胞(例如胚胎干细胞或iPS细胞)或生殖细胞(例如精子，未受精的或受精卵)中，用高浓度的冷冻保护剂(例如DMS0，乙酰胺，丙二醇及聚乙二醇)进行快速冷冻或玻璃化。玻璃化快速致使细胞内水成为玻璃化状态，以避免冰晶形成所致的对细胞的伤害或损伤。还是，细胞或组织被浓的冷冻保存剂的高毒性损伤非常可能；因此，此技术仅在一些有限情况中采用。
[0009]制备药学产品，食品及用于展示目的的冰雕中，使用例如氯化钠或糖，葡萄糖及海藻糖的添加剂。也使用其他由生 物(例如植物，鱼及昆虫)制得的例如抗冷冻蛋白或抗冷冻糖蛋白的添加剂(特开2005-126533及特开2003-250506)。
[0010]燃料电池中，水通过电化学反应在任何一个电极产生。例如，在质子-交换膜燃料电池中，水在阴极电极产生；及产生的一部分水通过电解质膜向阳极侧移动。水也将从进入电池的气体中的蒸汽冷凝产生。这些水潜在地阻碍气流，耗竭气体本身的供给及最终降低电池表现。这些错杂可通过用亲水包被材料(例如蛋白)处理气体分隔物表面，由此限制水冷凝来防止，但液体水甚至在所述条件下于低温偶尔冷冻导致其他错杂。为防止此问题，将有抗冷冻蛋白的聚合物电解质加入树脂层，其然后包被聚合物电解质膜表面(下列Adler等人)，但此方法具有高成本的问题。
[0011]【现有技术文献】
[0012]【专利文献】
[0013]【专利文献I】特表平10-511402
[0014]【专利文献2】专利第3694730号
[0015]【专利文献3】特开2005-126533
[0016]【专利文献4】特开2003-250506
[0017]【专利文献5】特开2008-041596
[0018]【非专利文献】
[0019]【非专利文献I】 Lovelock JE and Bishop MWH, Nature 183:1394-1395,1959
[0020]【非专利文献2】Polge C，Smith AU, Parkes AS, Nature 164:666-666,1949
[0021]【非专利文献3】Miszta_Lane H,Gill P,Mirbolooki M,Lakey JRT.Cell PreservTechnol5, 16-24，2007
[0022]【非专利文献4】H·a SY, Jee BC, Suh CS, Kim HS, Oh SK, Kim SH, Moon SY.HumanReproduction20, 1779-1786,2005
[0023]【非专利文献5】Yu HN, Lee YR, Noh EM, et al.1NT JHEMAT0L = 87: 189-194; 2008
[0024]【非专利文献6】Adler S, Pellozzer C, Paparella M, Hartung T, Bremer
S.Toxicol in Vitro20:265-271 ；2006
【
【发明内容】
】
[0025]【发明要解决的技术课题】
[0026]常规冷冻保存方法(包括快速冷冻技术)在冷冻及解冻后不可保存细胞或组织的完全结构完整性；因此，非常需要有低毒性的新冷冻保存物质。而且，已知DMSO诱导细胞(例如HL-60细胞)分化；因此，其不适于某些类型的细胞。抗冷冻蛋白及糖蛋白具有优良的保存能力，但用于食物成本太高(JPYl，300，000YEN/g),更别提用于细胞及组织。
[0027]本发明旨在提供具有优良的保护效果及对于细胞或组织的低毒性的冷冻保存剂，从而取代DMSO。本发明也旨在提供廉价的及安全的具有类似于抗冷冻蛋白及糖蛋白的阻止冷凝的性质的冷冻保存剂，从而以使冷冻保存及冷冻干燥物质(例如食品及药学产品)。
[0028]【解决课题的技术方案】
[0029]本发明的冷冻保存液包括:基本上I~50%的具有侧链氨基的聚胺；及生理溶液(例如盐水或培养基)。
[0030]【发明效果】
[0031]通过将各动物细胞(包括人细胞)及植物细胞浸入冷冻保存液然后于_80°C冷冻保存或用液体或蒸汽氮冷却下，而能不使用高度毒性DMSO或其他常规冷冻保存剂而保持它们的存活率及生物活性地保存。因为未使用常规冷冻保存剂(例如DMS0，甘油，乙二醇)等，对细胞的毒性保持低，及能不降低细胞的生物活性地长时间冷冻保存细胞。而且，冷冻保存液无蛋白成分(例如胎牛血清及白蛋白)，因此，无感染疾病的担忧，及不受偶尔见于由生物材料制成的药学产品的巨大变化的影响。
[0032]具有侧链氨基的聚胺(例如ε -聚-L-赖氨酸及聚烯丙胺)由于侧链氨基而具有与细胞膜的亲和力，因此，认为具有细胞保护效果。具有丰富的羧基的聚合物化合物也具有与水的高亲和性，因此，将在冷冻过程中，将细胞内水辅助移出到周围的培养基，由此预期具有冷冻保存效果。以足够的比例兼有氨基及羧基的聚合物化合物预期在冷冻时具有对细胞的进一步改善的冷冻保存效果。因此，本发明以提供具有高有效性及高安全性的冷冻保存液为目标，锐意研究了具有阳离子基团(例如侧链氨基)的聚合物化合物(例如聚氨基酸)，或具有阴离子基团(例如羧酸基)的聚合物化合物、以及兼有阳离子及阴离子基团的聚合物化合物的条件或要求。
[0033]本发明的冷冻保存剂相比DMSO毒性小，及不要求细胞或组织解冻后洗涤。然后可将解冻的细胞或组织直接悬浮于培养基中，以立即开始培养处理。
[0034]可根据本发明稳定地进行实验用培养细胞的冷冻保存；及而且期望能通过保持功能细胞(例如胰岛及干细胞(例如ES细胞，间叶干细胞及iPS细胞))的细胞功能来保存。因此，预期改善这些细胞的移植效率。
[0035]通过使用本发明的非冷冻聚-氨基酸，能阻止具有生理物质的带水物质的冷冻过程中的生理物质的钝化。而且，通过使用非冷冻聚-氨基酸，可在通过带水或含水物质的冷冻或冷冻干燥来获得冷冻的产品或冷冻干燥的产品的过程中达到不同于水分子的成分的均匀扩散。冷冻的产物可为冰淇淋，果汁牛奶冻，其他冷冻甜食，展览用冰，速冻汤等；及冷冻干燥产品可为冷冻干燥的粉末形式的食品或药学产品。
[0036]本发明的非冷冻试剂也可应用于工业用燃料电池，以阻止它们的由于液体冷冻的起始表现的劣化。
【【专利附图】

【附图说明】】
`[0037]图1是显示ε -聚-L-赖氨酸中阻断的氨基的百分率与通过使用氨基通过琥珀酸酐部分阻断的ε -聚-L-赖氨酸冷冻保存的有活力的L929细胞的百分率之间的关系的坐标图；
[0038]图2是显示部分阻断的聚-L-赖氨酸的浓度与通过使用已以相当于ε -聚-L-赖氨酸的氨基的63%的摩尔量加入琥珀酸酐的ε -聚-L-赖氨酸(PLL琥珀酸酐63%)冷冻保存的有活力的L929细胞的百分率之间的关系的坐标图；
[0039]图3-1是显示已在10%DMS0/胎牛血清中冷冻，然后解冻及不洗涤或稀释地立即培养于平板24小时的L929细胞的培养物的显微镜图像；
[0040]图3-2是显示已在含63%琥珀酸酐的7.5%PLL溶液中冷冻，然后解冻及不洗涤或稀释地立即转移到平板24小时的L929细胞的培养物的显微镜图像；
[0041]图4是显示在含63%琥珀酸酐和10%DMS0/胎牛血清的7.5%PLL溶液中冷冻的大鼠间叶干细胞(RMSC)，及就它们的分化为骨，脂肪体，及软骨的多能性进行评估的一组坐标图。包括未冷冻的及未分化的细胞用于比较。
[0042]图5是显示通过在30%蔗糖水溶液中加入0.1~15%PLL( ε -聚-L-赖氨酸)(PLL琥珀酸酐63%)防止冰重结晶的一系列显微镜图像。[0043]图6是显示冷冻的不含琥珀酸酐的5%PLL溶液(ε -聚-L-赖氨酸)及含63%琥珀酸酐的5%PLL溶液(PLL琥珀酸酐63%)中的晶体结构的显微镜图像。
[0044]图7是冷冻干燥的琼脂凝胶的照片(I )。左边的凝胶是无添加剂，及右边的具有含63%琥珀酸酐的5%PLL。
[0045]图8是冷冻的-解冻的琼脂凝胶的照片(2)。含63%琥珀酸酐的PLL浓度是0%(左)，1% (中)及3% (右)。
[0046]【实施方式】
[0047]通过在生理溶液中溶解I~50w/w% ;优选2~20w/w%,特别优选3~15w/w%,及更优选5~10w/w%的聚合物(例如聚-赖氨酸)来得到本发明的冷冻保存液。待使用的生理溶液是生理盐水以及用于培养各细胞及组织的培养基。例如，Dulbecco-改良的eagleMEM培养基(DMEM)可为优选的培养基之一。代之以，或除了聚-赖氨酸之外，可使用聚烯丙胺。代替这些，或除了这些之至少一种之外，待使用的化合物选自:其他聚胺(例如导入氨基的多糖类)及聚-氨基酸(例如聚-精氨酸，聚-谷氨酸及聚-天冬氨酸)；也选自葡聚糖，糊精，支链淀粉及脱乙酰壳多糖的多糖化合物，以及聚羧酸(例如聚丙烯酸)。这些聚合物中，优选的是具有可通过在相同单体分子中兼有阳离子及阴离子取代基的单体化合物的聚合获得的结构的聚合物；及尤其优选的是聚-氨基酸。更特别是，尤其优选的是具有兼有氨基及羧基的重复单元的聚合物。
[0048]待使用的聚-赖氨酸可为ε -聚-L-赖氨酸或ε -聚-D-赖氨酸或α -聚-L-赖氨酸。冷冻保护剂聚合物具有100与100，000之间的分子量。最优选的聚合物落入常规用作食品添加剂的一组ε-聚-L-赖氨酸。这些或者是通过酶合成的或通过链霉菌属真菌产生的，及具有1000~20，0 00的平均分子量，及特别具有1000~10，000的平均分子量(http://www.chiss0.c0.jp/fine/jp/polylisin/index, html)，尝试产生有变动于 15 ~35之间的聚合度，及有20或更低聚合度(例如，特开2003-171463及特开2005-318815)。平均分子量或平均聚合度可容易通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过例如使用由Atto有限公司提供的电泳设备及密度计(AE-6920V型)测量。标准蛋白标记物用于测量。可热处理聚-赖氨酸，以增加其分子量大于30，000及用作聚合物化合物。但是，以上提及的分子量范围由于随着分子量的增加的粘度而优选。因为具有游离末端羧基的聚-赖氨酸具有侧链伯氨基，它们的如下文所述的通过二羧酸酐的部分酰胺化大大给出优良的混合性及增溶表现。也可根据本发明采用的其他特别有利的聚合物化合物是平均分子量1000~1，000, 000，优选1000~20，000的聚烯丙胺。例如，所述可采用的聚合物是:向烯丙胺聚合物(日东纺织有限公司的PAA-03)的水溶液加入乙酸酐或乙酸；及部分-甲氧基-羰基化的烯丙胺聚合物(日东纺织有限公司的PAA-U5000)。烯丙胺聚合物，如同聚-赖氨酸，仅具有侧链基团伯氨基，但每单位分子量的伯氨基密度相比在聚-赖氨酸中，在烯丙胺聚合物中更大。而且，当烯丙胺部分羧化时，得到的聚合物化合物认为如同后述部分-羧化的聚-赖氨酸发挥作用。
[0049]优选地，聚胺的氨基通过用羧酸酐羧基化或乙酰化来部分阻断。此阻断通过氨基的羧化或乙酰化至优选50-99mol%，特别50~93mol%，更优选50~90mol%，再更优选为55~80mol%,及最优选58~76mol%的程度来进行。约50%的氨基将通过与52~53mol%的无水羧酸(相对于聚胺中氨基的摩尔量)反应来阻断。正常反应条件下，当与100mol%无水羧酸反应时，将阻断90~95%的氨基。以上提及的范围以上或以下的阻断率将降低冷冻保存效果。本文中可采用的羧酸酐包括:乙酸酐，柠檬酸酐，琥珀酸酐，戊二酸酐，苹果酸酐，富马酸酐及苹果酸酐。这些中，特别优选琥珀酸酐及乙酸酐。
[0050]但是，也可使用氨基未阻断而处于游离状态的聚胺；因此可采用的羧化及乙酰化程度跨O~100mOl/mOl%的范围。本发明中，可使用部分羧基胺化的聚羧酸。更特别是，聚羧酸可通过使其羧基与化合物(例如二胺，三胺及聚胺)反应来部分胺化。可采用的二胺是乙二胺及酰肼，例如己二酸二酰肼。这些氨基化合物与羧酸的反应以与碳二亚胺的加成反应方式进行。这种情况下，可采用在O~100mOl/mOl%范围内的胺化作用程度。如同氨基阻断，残留羧基的百分率优选在50~99mol%范围内，更优选在60~97mol%范围内，其中，残留百分率是胺化的羧酸基的残留百分比。例如，使用具有平均分子量1000~3，000，000,或尤其是1000~10，000的聚丙烯酸；及I~50mol%的，优选3~40mol%的聚丙烯酸的羧基用胺类及碳二亚胺(例如乙二胺二酰肼等)阻断。本发明的冷冻保存液也可含0.3~15w/w%,或尤其是0.1~50w/w%的常规冷冻保存物质，例如DMS0，甘油，乙二醇，海藻糖或蔗糖。因为细胞在冷冻及解冻期间经受氧化应激所致的损伤，将抗氧化剂添加到冷冻保护剂预期提高其保存效果。例如，可使用抗氧化剂，例如过氧化氢酶，过氧化物酶，超氧化物歧化酶，维生素E，维生素C，多酚(例如表没食子儿茶酚没食子酸酯)或谷胱甘肽。
[0051 ] 本发明的冷冻保存剂的渗透压是200~1000m0sm/kg，更优选为300~700m0sm/kg,及还优选400~600m0sm/kg。本发明的冷冻保存剂可应用于保存不仅细胞，而且组织。所述待用冷冻保存剂冷冻保存的细胞及组织之例是培养的细胞系，动物及人来源的受精卵。进一步例为:精子细胞，胚胎干细胞，iPS细胞，间叶干细胞，造血干细胞，神经元干细胞，脐带血干细胞，肝细胞，神经细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，血管平滑肌细胞及血细胞。不仅可包括动物或人细胞，而且包括植物细胞。能通过根据本发明的冷冻保存剂保存的组织及器官是皮肤，神经，血管，软骨，角膜，肝，肾，心脏及胰岛。
[0052]而且，以上提及的聚合物化合物也可应用于通过将聚合物化合物加入食品或药物用含水或带水物质，以避免冷冻浓缩及由此获得成分均匀扩散的冷冻的或冷冻干燥的产品来产生冷冻的或冷冻干燥的`食品或药物。特别可采用通过与琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反应来用羧化或乙酰化阻断氨基的选自下列的化合物:ε -聚-L-赖氨酸，α -聚-L-赖氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖类及聚烯丙胺。没必要使用生理溶液溶解聚合物化合物。例如，将具有部分阻断的氨基的聚-赖氨酸，其他聚-氨基酸或胺化的聚-糖加入前述用于冰淇淋或冷冻干燥的食品的带水的或含水物质，从而聚合物化合物的浓度成I~15%。用此方式，冷冻浓缩被阻止。如果将琥珀酸酐用于阻断聚合物基团，则当相当于氨基的50~85mol%的摩尔量的琥珀酸酐与聚合物反应时(其中实际氨基-阻断率在约48~80mol%的范围内)，得到阻止冷冻浓缩的优良效果。
[0053]上述聚合物化合物可在工业用燃料电池中应用，从而将聚合物化合物加入燃料电池，以阻止它们的起始表现的劣化(可在起始时以别的方式液体冷冻所致)。更特别是，可采用具有氨基的单元形成的聚合物化合物，其选自:ε-聚-L-赖氨酸，α-聚-L-赖氨酸，聚精氨酸，其他聚氨基酸，胺化的多糖类及聚烯丙胺；其中聚合物化合物的氨基通过羧化或乙酰化，通过与琥珀酸酐，乙酸酐或其他羧酸酐反应来阻断；及聚合物化合物可加入暴露于燃料电池内侧的表面层材料。例如，聚合物化合物可以I~15w/w%掺入形成分隔物或固体电解质膜表面的涂层材料，或尤其是UV固化性树脂液体。
[0054]【实施例】
[0055]以下示本发明的实施例以及比较例，但本发明不限于以下实施例。
[0056]【实施例1:冷冻保存溶液的制备】
[0057]使用ε-聚-L-赖氨酸(由Chisso公司制造；分子量:4000)的25%水溶液；及使用聚烯丙胺(Nittobo，分子量 5000 [PAA-05L]，15000 [PAA-L], 60000 [PAA-H])的 20% 水溶液。相对于聚胺聚合物的氨基，向各溶液均加入O~100mol%琥珀酸酐(和光纯药工业制)，以获得有具有不同氨基-阻断率的阻断的氨基的聚-胺类。将各聚-胺溶液加入Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma Aldrich)至O~10w/w%。此时，将培养基pH用IN盐酸或氢氧化钠溶液调至7.0~8.0。而且，用蒸汽压渗透压计(5型520，Wescor)测量培养基渗透压及用10%氯化钠水溶液调节。
[0058]【实施例2:培养的细胞的冷冻保存】
[0059]在冷冻瓶(SimportPlastics)中，将 IX IO6 细胞的 L929, MG63, Caco-2 (大日本住友制药)，Colon26，HT1080, B16F1及KB细胞(ATCC)的各细胞种均悬浮于Iml的各冷冻液；然后在_80°C冷冻器中冷冻。一周后，将细胞在37°C水浴中快速解冻，在DMEM中洗涤及用锥虫蓝染料进行细胞死亡率测试。然后将解冻的细胞以I X IO5细胞/孔接种于6孔培养板，及在培养6及24小时后用锥虫蓝染料评价细胞存活率。将作为通常使用的冷冻保存剂的胎牛血清(FBS)中的10%DMS0用作比较例的冷冻保存液。
[0060]如图1中所示，当在冷冻保存L929细胞中用作冷冻保存液的是已通过相对于氨基加入50%或更多摩尔量的琥珀酸酐来修饰的聚-赖氨酸(PLL)的各7.5%溶液时，则达到几乎相同或高于使用DMSO溶 液的比较例的细胞活力。作为通过茚三酮及TNBS方法定量测量残留氨基的结果，已通过加入100%摩尔量的琥珀酸酐修饰的羧化的聚-赖氨酸(PLL)显示具有93%氨基-阻断百分率。已通过相对于聚-赖氨酸的氨基加入10mol%，27mol%, 45mol%,52mol%,63mol%及79mol%摩尔量的琥珀酸酐修饰的聚-赖氨酸(PLL)分别显示具有10%，25%，43%，50%, 60%及76%的氨基-阻断百分率。如图1中所示，具有在50~93%范围内的氨基-阻断百分率的聚-赖氨酸溶液显示具有冷冻保存效果；及通过具有60%的阻断百分率(已加入63mol%的琥珀酸酐)及76%阻断百分率(已加入79mol%的琥珀酸酐)的聚-赖氨酸溶液达到特别高冷冻保存效果。当使用具有部分阻断的氨基的聚烯丙胺(其为分子量5000的烯丙胺聚合物，已与相当于烯丙胺聚合物中的氨基摩尔量的45~90mol%的琥珀酸酐反应)水溶液时也如同上述显示，随着氨基-阻断百分率增加的细胞存活率改善。
[0061]图2显示冷冻保存过程中，L929细胞的细胞存活率与通过相对于氨基加入63%摩尔量的琥珀酸酐来修饰的部分阻断的ε -聚-L-赖氨酸(其在图中被表示为"PLL (0.63)"及在下文说明书通篇称为"PLL琥珀酸酐63%")的浓度之间的关系。如图2中所示，当部分阻断的聚-L-赖氨酸或PLL琥珀酸酐63%浓度是7.0%或更高时，则细胞存活率几乎相同于或高于使用DMSO溶液得到的细胞存活率。当使用具有部分阻断的氨基的聚烯丙胺(其为分子量5000的烯丙胺聚合物，已与相当于氨基的摩尔量的63~85mol%的琥珀酸酐反应)水溶液时也显示如同上述的趋势。
[0062]在图1~2中，呈现最佳结果的范围如在得到保存液的渗透压时显示，对应于在400~600m0sm/kg范围内的渗透压。更特别地，当渗透压在400~600m0sm/kg范围内时得到最佳保存效果。
[0063]表1显示当将细胞冷冻保存于PLL琥珀酸酐63%的7.5%溶液时的其他细胞种的冷冻保存效果。如表1所示，全部细胞种达到几乎相同于或高于由DMSO溶液(10%DMS0/胎牛血清)得到的细胞存活率。尽管未显示数据，有部分阻断的氨基的聚烯丙胺产生类似结果。
[0064]【表1】7.5%PLL (0.63)对各细胞的冷冻保存效果
[0065]
【权利要求】
1.细胞及组织的冷冻保存用组合物， 其包括: ?聚合物化合物， 其包括具有氨基的单元的聚合物，及 其选自:ε -聚-L-赖氨酸，α -聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，导入氨基的多糖类及聚烯丙胺；及?生理溶液；及 将所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至I~50w/w%。
2.权利要求1的组合物,其中所述聚合物化合物的50~99mol%的氨基通过与羧酸酐反应而具有羧酸基或乙酰基来阻断。
3.细胞及组织的冷冻保存用组合物， 其包括: ?聚合物化合物， 其包括具有羧基的单元的聚合物，及 其选自:聚丙烯酸，CL-聚-谷氨酸，Y-聚-谷氨酸，聚-谷氨酸，聚-天冬氨酸，其他聚-氨基酸及羧化的多糖类；及?生理溶液；及 将所述聚合物化合物溶于所述生理溶液至I~50w/w%。
4.权利要求3的组合物，其中所述聚合物化合物的I~50mol%的羧基通过与具有多个氨基的化合物反应来阻断，所述具有多个氨基的化合物例如二胺，三胺及聚胺。
5.权利要求1~4中任一项的组合物，其中所述生理溶液是盐水，Dulbecco-改良的eagle MEM培养基(DMEM)，或者细胞或组织用培养基。
6.权利要求1~5中任一项的组合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000~20，000范围内的数平均分子量的ε -聚-L-赖氨酸。
7.权利要求1~5中任一项的组合物，其中所述聚合物化合物是具有在1000~3，000, 000范围内的数平均分子量的聚丙烯酸。
8.食品或药物的冷冻保存或冷冻干燥用添加剂组合物， 其包括聚合物化合物， ?其包括具有氨基的单元的聚合物，及 ?其选自:ε -聚-L-赖氨酸，α -聚-L-赖氨酸，聚-精氨酸，其他聚-氨基酸，导入氨基的多糖类及聚烯丙胺；且 其中所述聚合物化合物的氨基通过与羧酸酐反应而具有羧酸基或乙酰基来阻断。
9.制备食品，药物或燃料电池的方法，包括:将权利要求1中所述的添加剂加入: ?用于产生食品或药物的带水物质、或 ?工业产品元件，例如燃料电池的内部结构元件， 至所述添加剂的浓度成为在I~15?/?%范围内。
【文档编号】A61K47/36GK103858859SQ201410040415
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2009年6月26日 优先权日:2008年6月27日
【发明者】松村和明, 须贺井一, 玄丞烋 申请人:博傲沃德株式会社