一种h3n8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。本发明的疫苗中含有由SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所述核苷酸序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的重组病毒样颗粒蛋白和药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。本发明的重组病毒样颗粒与天然病毒粒子的形态结构类似，具有良好的免疫原性，由其制备得到的疫苗免疫小鼠后能够诱导小鼠产生良好的保护性免疫反应，且没有活病毒的任何危险，同时还能够区分自然感染者和免疫者，不干扰流行病学调查，因此，本发明的一种H3N8亚型马流感病毒样颗粒疫苗可以作为预防和治疗马流感的候选疫苗。
【专利说明】一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种马流感疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，本发明属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马流感(Equine influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒属A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的马属动物一种严重的上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播迅速而且广泛，给养马业及赛马业造成严重的经济损失。OIE规定马流感为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。
[0003]近几年来EI在全世界频繁暴发，我国也不例外，在2007-2008年间我国多个省市均暴发了 EI疫情，时值临近奥运会的举办，我国从国外进口 EI疫苗进行紧急接种。EIV不仅可以感染马和驴等马属动物，甚至可以感染犬，EIV的跨种传播，因此也给公共卫生带来极大的安全隐患。目前，EIV在各种压力下正加速变异，危害严重。2012年8月在我国贵州省又暴发了 EI疫情，对赛事造成了很大的影响。因此对EI进行监测和防控是本病的重点工作。而我国目前还没有具有自主知识产权的并针对我国EI流行株的用于防控EI的有效疫苗。而疫苗接种被认为是防控EI的有效策略，EI疫苗的广泛应用使EI疫情在全球得到了有效地控制，而我国绝大多数马匹未接种过EI疫苗，因此极易受到EIV的危害。
[0004]疫苗免疫在一定情况下也不能避免EI的暴发，这是由于EIV呈多元化进化，导致HA蛋白抗原性不同的多 个谱系病毒株的出现，当疫苗株与流行株属于不同谱系时就不能产生完全的免疫保护。
[0005]对我国EIV的分子流行病学调查研究表明:我国EIV和国外进口疫苗株在进化上分属于Florida分支2和Kentucky分支两个不同的谱系,这给我们提出一个警示:进口疫苗能否对我国EI疫情提供有效防控？尚有待于实践检验。而研制符合我国国情的EI疫苗则是解决问题的根本。本研究将我国EI代表流行株的HA和Ml基因重组到杆状病毒载体中，在昆虫细胞中进行HA和Ml蛋白的表达，并对蛋白生物学特性进行了检测，为EI亚单位疫苗的研制提供了技术储备。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一种能够用于预防和治疗由H3N8亚型马流感病毒引起的EI的重组病毒样颗粒疫苗；
[0007]本发明的目的之二是提供一种制备所述重组病毒样颗粒疫苗的方法；
[0008]本发明的目的之三是提供所述的重组病毒样颗粒疫苗在制备防治H3N8亚型马流感药物中的应用。
[0009]为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为:
[0010]本发明的一种用于预防和治疗由H3N8亚型马流感病毒引起的EI的重组病毒样颗粒疫苗，含有由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白和药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，是将EIVA/Equine/xinjiang/3/2007 (H3N8)(简写为XJ3)(该毒株已记载在文献:H3N8亚型EIV HA基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析，刘春国等，《中国预防兽医学报》2013年11期中，现由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。)的囊膜糖蛋白HA和基质蛋白Ml基因共插入到杆状病毒双表达载体中，构建的重组杆状病毒表达的HA和Ml在细胞中组装成病毒样颗粒，作为保护性抗原。插入的EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，插入的EIV基质蛋白Ml基因具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，以及与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。
[0011]具体的，本发明所述的一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到:将SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列或与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核苷酸序列克隆到杆状病毒转移载体中，所得的重组杆状病毒转移载体转化DHlOBac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，并使其表达H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，纯化，即得。
[0012]在本发明中，优选的，所述的杆状病毒转移载体为杆状病毒双表达载体，更优选的，所述的杆状病毒转移载体为pFastBac Dual。
[0013]在本发明中，优选的，所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，通过以下方法制备得到:
[0014](I)将SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列克隆入杆状病毒转移载体pFastBac Dual的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到重组载体pFBD-XJ3_HA ；
[0015](2)将SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列克隆入步骤(1)得到的重组载体PFBD-XJ3-HA的Xhol I和Nhe I酶切位点之间，得到重组载体pFBD-XJ3_HA+Ml ；
[0016](3)将重组载体pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书转化DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重组，得到重组杆粒rBac-XJ3_HA+Ml ；
[0017](4)将重组杆粒rBac-XJ3_HA+Ml转染Sf9细胞，待细胞病变达到80%后收集上清，连续传代1-5次后得到重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml ；
[0018](5)将得到的重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml接种Sf9细胞，使其表达H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，纯化，即得。
[0019]在本发明中，优选的，步骤(5)是按照以下步骤进行:将得到的重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml接种Sf9细胞，27°C培养72h后收获细胞，反复冻融3次后，3000r/min离心IOmin去除细胞碎片，将上清进行超速离心，38000r/min离心2h，然后用20%、30%和60%蔗糖垫进行密度梯度离心，将30%和60%蔗糖垫之间的蛋白收集后进行脱糖，沉淀用TNE重悬，即为纯化的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒。
[0020]研究发现，本发明制备得到的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒与H3N8亚型马流感病毒的天然病毒粒子的形态结构类似，具有良好的免疫原性，本发明的EI重组病毒样颗粒的基本特征:1、透射电镜观察到所得的病毒样颗粒具有与真正的流感病毒相似的形态结构；2、所得的病毒样颗粒具有良好的血凝活性；3、细胞免疫组化和Western blot实验表明表达的HA蛋白和Ml蛋白可被小鼠抗EIV血清所特异性识别，具有良好的免疫活性。
[0021]因此，进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒在制备预防或治疗H3N8亚型马流感药物中的应用。优选的，所述的药物为H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗。
[0022]本发明的一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗，含有以上任一项所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
[0023]将制备的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗经后肢肌肉免疫小鼠后，能够诱导机体产生较高的HI抗体和中和抗体，产生良好的保护性免疫反应，并能够对亲本强毒株XJ3的攻击提供100%的临床和病毒学保护，且没有活病毒的任何危险，并能够区分自然感染者和免疫者，不干扰流行病学调查，由此可见，本发明的一种H3N8亚型马流感病毒样颗粒疫苗可以作为预防和治疗马流感的候选疫苗。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例1中表达EIV HA和Ml重组杆状病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制备流程图；
[0025]图2是本发明实施例2中EIV HA和Ml蛋白表达的细胞免疫组化检测图；
[0026]图2A为未感染的Sf9细 胞；图2B为rBV-XJ3_HA+Ml感染的Sf9细胞；图2C为wtBV感染的Sf9细胞；
[0027]图3是本发明实施例2中EIV HA和Ml蛋白表达的Western blot检测图；
[0028]1.预染蛋白分子量标准；2和3.rBV-XJ3-HA-Ml感染的Sf9细胞；4.wtBV感染的Sf9细胞对照；
[0029]图4是本发明实施例3中H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后的HI抗体图；
[0030]图5是本发明实施例3中H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后的中和抗体图；
[0031]图6是本发明实施例3中H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗免疫小鼠攻毒后的体重变化图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033]实施例1本发明表达EIV HA和Ml蛋白的重组杆状病毒rBV-XJ3_HA+Ml的构建
[0034]表达EIV HA和Ml重组杆状病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制备流程图如图1所示。
[0035]1、EIV XJ3HA 和 Ml 基因的 RT-PCR 扩增
[0036]使用华舜柱式病毒RNA提取试剂盒提取EIV XJ3(该毒株已记载在文献:H3N8亚型EIV HA基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析，刘春国等，《中国预防兽医学报》2013年11期中，现由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。)的RNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以A型流感病毒反转录通用引物Un1-12:5’ -AGCAAAAGCAGG-3’为反转录引物制备 XJ3cDNA,反转录体系如下:DEPC Η2019.0 μ L、XJ3RNA5.0 μ L、AMV RT buffer8.0 μ L、
2.5mmol/L dNTP mixture4.0 μ L、Un1-12 通用引物 2.0 μ L、RNase Inhibitorl.0 μ L 和AMV Reverse Transcriptasel.0yL,总体积40.0 μ L。将上述反转录体系混匀，室温静置IOmin后，放于42°C水浴锅中反转录lh，然后将反转录产物立即冰浴静置2min，随后使用或置于-20°C保存。以XJ3cDNA为模板，分别采用HA基因的特异性引物以及Ml基因的特异性引物进行PCR扩增。
[0037]HA基因的特异性引物为:
[0038]XJ3-HAF:5， -CCGGATCCATGAAGACAACC-3’
[0039]XJ3-HAR:5’ -CCCAAGCTTCTATCAGTTTAC-3’
[0040]Ml基因的特异性引物为:
[0041]XJ3-M1F:5， -CCCTCGAGATGAGCCTTCTTAC-3，
[0042]XJ3-M1R:5， -ATTGCTAGCTCACTTGAACCGCT-3’
[0043]PCR 反应体系为:10 XPCR buffer 10.0 μ L、Ex Taq 酶 0.5 μ L、2.5mmol/L dNTPmixture2.0yL, IOpmoI/L HA 基因上、下游引物各 1.0 μ L、cDNA 模板 2.0 μ L 和 ddH2083.5 μ L，总体积100.0 μ L。PCR反应程序如下:94°C预变性5min、94°C变性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共计30个循环。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。结果可见大小为1.7kb左右的HA基因片段和0.Skb的Ml基因片段，与预期的相符。
[0044]2、重组杆状病毒转移载体pFBD-XJ3-HA+Ml的构建
[0045]HA和Ml基因的纯化:将EIV1.7kb的HA基因片段和0.8kb的Ml基因片段从琼脂糖凝胶上切下来，置于离心管中进行纯化，具体试验方法参见试剂盒说明书进行。
[0046]HA基因以及pFastBac Dual载体的酶切:将纯化后的HA基因和杆状病毒转移载体pFastBac Dual 分别用 BamH I 和 Hind III进行双酶切。体系如下:ddH2013.0 μ L/33.0 μ L、HA/pFastBac Dual30.0 μ L/10.0 μ L、10 X K Buffer5.0 μ L、BamH I 和 Hind III各 1.0 μ L 和石蜡油50.0 μ L，总体积100.0 μ L。37°C水浴2h后，HA基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化；PFastBaC Dual质粒酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定完全切开后，用胶回收试剂盒进行纯化。
[0047]HA与载体的连接和转化:在T4DNA连接酶作用下，将经限制性内切酶处理的HA基因与线性化的pFastBac Dual进行连接，体系如下HA (Hind III +BamH I Δ) 10.0 μ L>pFastBac Dual (Hind III +BamH I Δ)5.0 μ LU0XT4DNA 连接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 连接酶1.0 μ L和dd H202.0 μ L，总体积20.0 μ L。上述连接反应混合物置于16°C水浴锅中连接过夜。将连接产物加入到TOPlO感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min，42°C热激90sec，立即冰浴2min，加入800 μ LSOC培养基，于37°C摇床内，震荡培养45min ;取出后于4000r/min离心2min ;弃去大部分上清，留200 μ L重悬培养物,涂布于含氨节青霉素的LB琼脂平板上，37 °C温箱过夜培养。
[0048]HA基因重组质粒的鉴定:将菌落PCR初步鉴定为阳性的菌液分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C摇床振荡培养过夜。每个样品分别取1.5mL菌液提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并设有PFastBac Dual质粒作为阴性对照。将进一步鉴定为阳性的重组质粒送往北京华大基因公司测序鉴定。利用DNASTAR软件中Seqman程序进行序列拼接比对，结果表明重组质粒PFBD-XJ3-HA构建成功，HA基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0049]Ml基因以及pFBD-XJ3-HA质粒的酶切:将纯化后的Ml基因和重组质粒PFBD-XJ3-HA 分别用 Xhol I 和 Nhe I 进行双酶切。体系如下:ddH2013.0 μ L/33.0 μ L、M1/PFBD-XJ3-HA30.Ομ L/10.Ομ LUOXM Buffer5.0 μ L.Xhol I 和 Nhe I 各 1.Ομ L和石蜡油50.0 μ L，总体积100.0 μ L。37°C水浴2h后，Ml基因酶切产物用PCR纯化试剂盒进行纯化；PFBD-XJ3-HA质粒酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定完全切开后，用胶回收试剂盒进行纯化。
[0050]Ml基因与载体的连接和转化:在T4DNA连接酶作用下，将经限制性内切酶处理的Ml基因与线性化的pFBD-XJ3-HA进行连接，体系如下HA (Xhol I +Nhe I Λ) 10.0 μ L、PFBD-XJ3-HA (Xhol I +Nhe I Δ) 5.Ομ LU0XT4DNA 连接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 连接酶
1.0 μ L和dd Η202.0 μ L，总体积20.0 μ L。连接转化方法与HA基因的类似。
[0051]Ml基因重组质粒的鉴定:见上述HA基因的鉴定方法。结果表明重组质粒PFBD-XJ3-HA+M1构建成功，Ml基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0052]3、重组转座子rBac-XJ3_HA+Ml的构建
[0053]将pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书转化DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重组。筛选重组杆粒rBac-XJ3-HA+Ml，并利用M13通用引物进行PCR鉴定。结果可分别 扩增出约5.0kb (阳性)和300bp (阴性)的片段，与预期的相符。
[0054]4、重组杆状病毒rBV-XJ3_HA+Ml的制备
[0055]将rBac-XJ3_HA+Ml和Bacmid按照转染试剂操作说明分别转染Sf9细胞。待细胞病变达到约80%后收集上清作为第I代种毒，经过4次连续传代后获得含有HA基因的重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml的第4代以及第5代毒和野生型杆状病毒(wtBV)。
[0056]实施例2本发明重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml表达EIV HA和Ml蛋白的鉴定
[0057]1、细胞免疫组化法检测蛋白的表达:
[0058]将实施例1获得的第4代rBV-XJ3_HA+Ml和wtBV分别接种培养于6孔板中的Sf9细胞进行免疫组织化学实验检测(刘春国等，自然科学进展，2009，19 (8):812-818.)。主要步骤如下，病毒接种后3d弃去上清，用预冷的PBS洗涤细胞3次，然后用4%的福尔马林固定lOmin。以小鼠抗H3N8亚型EIV特异性多克隆血清(1:200)作为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)为二抗，DAB显色后，显微镜下观察结果可见rBV-XJ3-HA+Ml感染的Sf9细胞呈现阳性棕黄色染色，而wtBV接种的Sf9细胞未见染色，结果如图2所示。
[0059]2> Western blot 分析:
[0060]将第4代rBV-XJ3-HA+Ml和wtBV分别接种Sf9细胞，27°C培养72h后收获细胞，将细胞裂解物进行SDS-PAGE，随后将蛋白转印于NC膜上。经5%脱脂乳封闭，以小鼠抗H3N8亚型EIV多克隆血清为一抗,羊抗鼠IgG-HRP为二抗,按常规方法进行western blot鉴定(刘春国等，中国生物工程杂志，2009，29 (10):38-43)。结果可见rBV-XJ3_HA+Ml表达的72kuHA蛋白和24ku Ml蛋白可被抗H3N8亚型EIV的小鼠血清识别，而wtBV感染的Sf9细胞未呈现反应条带，结果如图3所示。
[0061 ] 3、重组蛋白的血凝活性检测[0062]分别取实施例1获得的第5代rBV-XJ3_HA+Ml和wtBV感染Sf9细胞，培养72h后分别收获细胞和细胞培养上清，细胞经PBS洗涤3次后超声裂解，然后用0.5%的鸡红细胞对细胞培养上清和裂解的细胞进行红细胞凝集试验。结果表明rBV-XJ3-HA+Ml感染的Sf9细胞的上清以及细胞裂解物均具有血凝活性，效价分别达到51og2和91og2，而wtBV感染的Sf9细胞的上清以及细胞裂解物均不具有血凝活性。
[0063]4、病毒样颗粒的电镜观察
[0064]将第5代rBV-XJ3-HA+Ml和wtBV分别感染Sf9细胞，27°C培养72h后收获细胞，反复冻融3次后，3000r/min离心30min后，取上清10000r/min离心30min,弃去上清，沉淀用IOOyL PBS重悬，2%磷钨酸负染后，采用透射电镜观察病毒样颗粒形态。结果表明rBV-XJ3-HA+Ml感染Sf9细胞获得的重组蛋白可以观察到表面具有纤突的囊膜状病毒样颗粒，与完整的病毒粒子相似，而wtBV感染的Sf9细胞裂解蛋白中未见病毒样颗粒形成。
[0065]实施例3本发明的重组病毒样颗粒疫苗的制备及对小鼠的免疫保护实验
[0066]1、病毒样颗粒的纯化
[0067]将实施例1获得的第4代重组杆状病毒rBV-XJ3_HA+Ml接种Sf9细胞，27°C培养72h后收获细胞，反复冻融3次后，3000r/min离心10min去除细胞碎片，将上清进行超速离心，38000r/min (100000 Xg)离心2h，然后用20%、30%和60%蔗糖垫进行密度梯度离心，将30%和60%蔗糖垫之间的蛋白收集后进行脱糖，沉淀用TNE重悬即为纯化的病毒样颗粒。
[0068]2、病毒 样颗粒的定量
[0069]采用Bradford法测定总蛋白的浓度，具体方法见说明书。然后用SDS-PAGE和Western blot法计算出HA和Ml蛋白含量。方法如下:将纯化的病毒样颗粒稀释至浓度分别为1500、500和167 μ g/mL，按照糖苷酶PNGase F说明书处理，18 μ L样品中加入10 X Glycoprotein Denaturing Buffer2 μ L,混匀，10CTC水浴 IOmin进行还原处理，冷却至室温后，加入 10XG7Reaction Buffer2.5 μ L，10%ΝΡ_402.5 μ L，分别按 1:50、1:100 和 I:500的体积比加入糖苷酶PNGase F各1、0.5和0.1 μ L，37°C处理18h。样品经处理后加入8.5yL4X蛋白电泳上样缓冲液。配制12% SDS-PAGE胶，取20 μ L样品加入每孔中，进行电泳，电泳结束后，一块胶以考马斯亮蓝染色，脱色后，通过薄层扫描仪根据图片中各条带灰度值计算每条蛋白带所占比例；另一块胶进行Western blot检测,鉴定出HA和Ml蛋白所在的位置。再根据对应考马斯亮蓝染色胶的薄层扫描结果确定HA和Ml蛋白条带所占总蛋白的比例，计算出HA和Ml蛋白的总含量，即为病毒样颗粒的蛋白浓度。
[0070]3、病毒样颗粒疫苗的制备及对小鼠的免疫学研究
[0071]将病毒样颗粒用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照抗原比佐剂体积比为1:2的比例分别进行乳化，然后免疫6w雌性Balb/c小鼠。将40只6w雌性Balb/c小鼠随机分成4组，每组10只。第一、第二和第三组分别经腹腔免疫含20 μ g、50 μ g和100 μ g弗氏完全佐剂乳化的病毒样颗粒的疫苗。第四组作为阴性对照腹腔接种200 μ L弗氏完全佐剂乳化的PBS。一免3w (周)后以相同方式和剂量加强免疫弗氏不完全佐剂乳化的病毒样颗粒疫苗，并于二免2w后用XJ3亲本毒株以IO7EID5tl的剂量通过呼吸道进行攻毒,攻毒后每天观察临床症状，并定时测量体重，连续监测14d。并于攻毒后第2d每组各剖杀2只小鼠检测脏器中病毒复制情况。免疫前Id、一免Iw和3w后、二免2w和4w后以及攻毒2w后分别采血，分离血清，测定HI抗体和中和抗体效价。[0072]病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后诱导的HI抗体反应:一免Iw后20 μ @和50口 g免疫组产生41og2左右的HI抗体，而100 μ g免疫组没有产生可检测的HI抗体；一免后3w20y g和50 μ g免疫组抗体升高至5.21og2和6.21og2,100 μ g免疫组HI抗体迅速升高至8.21og2 ；二免2w后三组抗体水平均持续升高，100 μ g组抗体升至91og2 ;攻毒2w后三组抗体水平均升高至101og2左右，对照组攻毒前未产生可检测的HI抗体，攻毒2w后HI抗体达到
5.21og2，结果如图4所示。
[0073]病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后诱导的中和抗体反应:一免Iw后20 μ g和50 μ g免疫组产生的中和抗体效价分别为1:25和1:22.25，100 μ g免疫组未检测到中和抗体；一免3w后20 μ g和50 μ g免疫组产生的中和抗体效价分别达到为1:78,1:89.2，100 μ g免疫组中和抗体升高至1:178 ;二免2w后20 μ g组、50 μ g组和100 μ g组的中和抗体效价分别为1:355、1:178和1:237 ;攻毒2w后三组中和抗体分别达到1:443.75、1:532.5和1:591.68，结果如图5所示。
[0074]病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后对强毒株攻击的保护:病毒样颗粒疫苗二免4w后用IO7EID5tl的XJ3亲本毒株进行攻毒,攻毒后仅第ld50y g和100 μ g免疫组小鼠体重下降，随后50 μ g组小鼠开始上升，而100 μ g组小鼠体重持续保持在低水平未见显著增长，对照组小鼠体重在攻毒后第2d开始持续下降，第6d降到与100 μ g组相似的水平，结果如图6所示。攻毒后第2d免疫组小鼠脏器中均未检测到病毒复制，而对照组2只小鼠肺中均能检测到病毒。
[0075]实验结论:本发明制备得到的H3N8亚型马流感病毒样颗粒疫苗不含有病毒的核酸，不存在感染动物的风险，具有良好的安全性；其中，所含有的H3N8亚型马流感病毒样颗粒具有与天然病毒粒子类似的形态结构，能够模拟天然病毒粒子诱导机体产生免疫反应；而且其制备疫苗免疫动物 后能够区分自然感染者和免疫者，不干扰流行病学调查。小鼠免疫试验结果表明20μ g病毒样颗粒疫苗对小鼠具有良好的免疫保护效果。因此，本发明制备的EI重组病毒样颗粒疫苗可以作为预防和治疗马流感的候选疫苗。
【权利要求】
1.一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到:将SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列或与SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核苷酸序列克隆到杆状病毒转移载体中，所得的重组杆状病毒转移载体转化DHlOBac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，并使其表达H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，纯化，即得。
2.如权利要求1所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于所述的杆状病毒转移载体为pFastBac Dual。
3.如权利要求2所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到: (1)将SEQID N0.1所示的核苷酸序列克隆入杆状病毒转移载体pFastBac Dual的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到重组载体pFBD-XJ3_HA ； (2)将SEQID N0.2所示的核苷酸序列克隆入步骤(1)得到的重组载体pFBD-XJ3_HA的Xhol I和Nhe I酶切位点之间，得到重组载体PFBD-XJ3-HA+M1 ； (3 )将重组载体pFBD-XJ3-HA+Ml按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书转化DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重组，得到重组杆粒rBac-XJ3_HA+Ml ； (4)将重组杆粒rBac-XJ3-HA+Ml转染Sf9细胞，待细胞病变达到80%后收集上清，连续传代1-5次后得到重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml ； (5)将得到的重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml接种Sf9细胞，使其分泌表达H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，纯化，即得。
4.如权利要求3所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于步骤(5)中将得到的重组杆状病毒rBV-XJ3-HA+Ml接种Sf9细胞，27°C培养72h后收获细胞，反复冻融3次后，3000r/min离心10min去除细胞碎片，将上清进行超速离心,38000r/min离心2h,然后用20%、30%和60%蔗糖垫进行密度梯度离心，将30%和60%蔗糖垫之间的蛋白收集后进行脱糖，沉淀用TNE重悬，即为纯化的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白。
5.权利要求1-4任一项所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒在制备预防或治疗H3N8亚型马流感药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的药物为H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗。
7.—种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗，其特征在于含有权利要求1-4任一项所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒以及药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。
8.权利要求7所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗在制备预防或治疗H3N8亚型马流感药物中的应用。
【文档编号】A61K39/145GK103898070SQ201410076834
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月4日 优先权日:2014年3月4日
【发明者】刘明, 刘春国, 相文华 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所