包含黄连、黄柏以及栀子并且用于治疗神经变性疾病的组合物的制作方法

包含黄连、黄柏以及栀子并且用于治疗神经变性疾病的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明属于药物、健康营养补充剂以及化学工业的领域。具体来说，本发明涉及一种草药组合物，所述草药组合物消除了现有治疗的Aβ增加作用，并且作用于淀粉样蛋白-β蛋白前体(APP)的调节性加工，因此提供了一种与任何β-淀粉样蛋白增加作用无关的显著更有效用于神经变性疾病的治疗。
【专利说明】包含黄连、黄柏W及扼子并且用于治疗神经变性疾病的组 合物
[0001] 相关申请的交互引用
[0002] 本申请要求2013年6月13日提交的美国临时专利申请61/834,437和2013年6 月17日提交的美国临时专利申请61/836, 118的优先权，所述美国临时专利申请的公开内 容通过援引纳入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明属于药物、健康营养补充剂W及化学工业的领域。具体来说，本发明提供了 一种对于治疗神经变性疾病具有显著有效的治疗作用的草药组合物，所述草药组合物与由 现有治疗所展现出的任何目-淀粉样蛋白增加作用无关。

【背景技术】
[0004] 细胞外老年斑和磯酸化T蛋白相关的神经元内神经原纤维缠结（NFT)是阿尔茨 海默氏病（Alzheimer' S disease,AD)的两个典型的微观病变。老年斑包含由营养不良性神 经突包围的由淀粉样蛋白-目（A目）形成的致密核也（参见Se化OeDJ(2004)Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer'S and Parkinson's diseases. Nat CellBiol6:1054 - 1061)。A目是较大的淀粉样蛋白前体蛋白（AP巧的具有39-43个氨 基酸的蛋白水解产物。APP是一种膜内在蛋白，被蛋白酶a-分泌酶或目-分泌酶加工而 分别产生a-C端片段（CTF-Q)或目-C端片段（CTF-目）。该些片段随后被a-分泌酶 切割而分别产生P3或A目，W及细胞质尾区修剪型（巧toplasmic tail化化ed)APP-细胞 内结构域（AICD)。APP发生蛋白水解还会释放可溶形式的APP(sAPPa和sAPP目），并且 该些可溶性APP目前也可W被认为是AD的生物标记（P Lewczuk et al. , Soluble amyloid precursor proteins in the cerebrospinal fluid as novel potential biomarkers of Alzheimer' S disease:a multicenter study Mol Psychiatry. 2010 ; 15:138-45)。 另一 方面，单体A目（4. 3kDa分子量）自行组装成低聚物（Se化oe DJ(2004)Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer' S and Parkinson' S diseases. Nat Cell Biol6:1054 - 1061and Hardy J, Se]_koe DJ (2002) Hie amyloid hypothesis of Alzheimer' S disease:progress and problems on the road to therapeutics. Science297:353 - 356)。该 些低聚物最终W较大原纤维的形式沉积在细胞外间隙中，该些原纤维组装成为淀粉样蛋白 斑块。但是A目诱导神经毒性的确切机制仍是未知的，多项研究掲示其可能的机制包括巧 内流、产生活性氧簇（RO巧、产生一氧化氮（NO) W及T蛋白的磯酸化增加。
[0005] 美国食品和药物管理局扣S化Od and化Ug A血inistration)已经批准五种药 物（即他克林（tacrine)、多奈脈齐（donepezil)、利斯的明（rivastigmine)、加兰他敏 (galantamine) W及美金刚胺（memantine))用于治疗 AD(Lle6A, GreenbergSM, Growdon JH(2006) Current pharmacotherapy for Alzheimer' S disease. Ann Rev Med57:513 - 533), 但是它们仅产生轻度的症状减轻作用并且不能够制止痴呆进展。因此，需要用于治疗AD的 替代性药物。植物治疗剂的一个来源是黄连解毒湯OlLJDT)--一种在治疗方面应用广泛 的传统中药（TCM)。
[0006] 化JDT是一种被广泛用于治疗中风和痴呆的著名的TCM配方。它由四种草药 构成，目P :黄连（Rhizoma coptidis，民C) (Coptis chinensis Franch/Huang Lian)、黄琴 (民adix Scutellariae，民S) (Scutellaria baicalensis Georgi/Huang Qin)、黄才白（Cortex phelIodendri，CP) (PhelIodendron amurense/Huang Bai) 及極子（Fructus gardeniae， FG) (Gardenia jasminoides Ellis/Zhi Zi)，它们的干重比是3:2:2:3。如在传统中医药典 籍《外台秘要〉〉中所记载，RC、RS W及CP是化JDT的主要成分，并且FG充当辅助成分W支 持主要成分的作用。所有的传统中国文献迄今为止均记载化JDT配方必须由所有的这四种 草药组成。
[0007] 化JDT在中国已经被用于治疗老年痴呆、炎症、消化系统寨乱W及脑血管疾病 (Chen GH, Shan P, Qiu X(2007)The clinical study on Huanglianjiedu decoction on for patients with senile dementia, the type of hyperactivity of heart-fire and liver fire in TCM. Zhongguo aiongyi Jizhengl6:386 - 387)。HLJDT 在日本已经被用于治疗 与中风和血管性痴呆相关的各种临床症状（Otomo E，Togi H，Kogure K(1991)Clinical usefulness of TSUMURA Orengedokuto for the treatment of cerebrovascular disease:a well-controlled study comparing TSUMURA Orengedokuto versus Ca hopantenate，using sealed envelopes for allocation. Geriatric Medicine29:121 - island Ito E, Takahashi A, Kazuya F(1991)Clinical effectiveness of TSUMURA Orengedokuto in the treatment of cerebral infarction. Geriatric Medicine29:303 - 313)。在一项日本的临床研究 (Okamoto et al. , (2013) Orengedoku-to augmentation in cases showing partial response to yokukan-san treatment:a case report and literature review of the evidence for use of these Kampo herbal formulae. Neuropsychiatr Dis Treat. 2013 ;9:151-155)中，将 化JDT添加至抑肝散（yokukan-san)(日本传统草药）中能够在控制阿尔茨海默氏病型痴呆 患者的攻击性方面发挥与阿立脈嗤（aripiprazole)(抗精神病药）相同的功效而没有任何 的副作用。
[0008] W下文献中的临床前报道提供证据表明化JDT可W改善脑血流量=Kondo Y，Kondo F, Asanuma M, Tanaka K, Ogawa N (2000) ,Protective effect of oren-gedoku-to against induction of neuronal death by transient cerebral ischemia in the C57BL/6mouse ( 连解毒湯针对巧7BL/6小鼠由短暂性脑缺血所诱导的神经元死亡的保护作用），Neurochem 民es25:205-209 ;Wang S, Jiang 化化OU WX,化ang YY (2007)，Effect of Huanglian Jiedutang on expression of hippocampus proteomics in senescence accelerated mouse(黄连 解毒湯对快速老化模型小鼠海马蛋白表达的影响），Zhongguo化ong Yao Za化i(《中国 中药杂志〉〉），32:2289-2294 ; W 及 Qiu X，Chen GH，Wang T 口 OU) ,Effects Of huanglian jiedu decoction on free radicals metabolism and pathomorphism of the hippocampus in App/PSl double transgenic mice (黄连解毒湯对App/PSl双转基因阿尔茨海默病小 鼠自由基代谢及海马区病理形态学影响），化ongguo化ong Xi Yi Jie He Za化i (《中国 中西医结合杂志〉〉），31:1379-1382 ;它有效地抑制脑中的脂质过氧化并且因此保持脑中 的能量代谢。化JDT的乙醇提取物和水提取物均可W改善动物模型中由脑缺血和中枢 胆碱能功能障碍所引起的认知障碍。最近，Durairajan SSK，Liu LF，Lu JH，Chen化，化过打 Q，Chung SK，Huang L，Li XS，Huang JD, Li M(2012), Berberine ameliorates P-amyloid pathology,gliosis,and cognitive impairment in an Alzheimer' S disease transgenic mouse model (小築碱改善阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型的目-淀粉样蛋白病变、神经 胶质增生W及认知障碍），Neurobiol Aging33:2903-2919显示，小築碱（HLJDT中的一种 化合物）可W通过调节APP加工而显著地降低阿尔茨海默氏病转基因模型中的A目负荷。 然而，化JDT改善认知的确切机制尚不清楚。在AD的情况下，Qiu X，化en GH，Mei G，Wang YG. (2011), Effects of huanglian jiedu decoction on free radicals metabolism and pathomorphism of the hippocampus in App/PSldouble transgenic mice (黄连角军毒汤对 App/PSl双转基因阿尔茨海默病小鼠自由基代谢及海马区病理形态学影响），化ongguo Zhong Xi Yi Jie He Za化1 (《中国中西医结合杂志》），31:1379-1382在AD小鼠中对HLJDT 进行了研究。Qiu等报道化JDT减少了 APP/PS-1小鼠的A目斑块并且改善了所述小鼠的记 忆力，但是该文献的作者并未提及对A目负荷的定量。Qiu等还报道化JDT降低了 APPmRNA 水平，但是并未测量化JDT对全长（Fl) APP、A目W及可溶形式的APP (即sAPP a和sAPP目） 的蛋白质水平的影响。
[0009] 在本申请的该一部分或任何其它部分中对任何参考文献的引用或标识均不应当 被视为承认所述参考文献可用作本申请的现有技术。


【发明内容】

[0010] 本发明的一个目的在于提供一种草药组合物，所述草药组合物改善了淀粉样蛋 白-目蛋白前体（AP巧的调节性加工，并且与显著有效用于神经变性疾病的治疗相关，而 与由现有治疗所展现出的任何目-淀粉样蛋白增加作用无关。具体来说，已显示现有治疗 化JDT展现出目-淀粉样蛋白增加作用。
[0011] 根据本发明的第一方面，提供了一种用于治疗神经变性疾病的草药组合物（下 文称作化JDT的改进配方化LJDT-M))，所述组合物包含黄连（Coptis chinensis化anch/ Huang Lian)、黄柏（Phellodendron amurense/Huang Bai) W及檐子（Gardenia jasminoides Ellis/Zhi Zi)，或主要由W上草药组成，但不包含黄辜（Scutellaria baicalensis Georgi/Huang Qin)。
[0012] 在一个实施方案中，所述黄连、黄柏、檐子和黄辜可W是草药自身、其提取物、活性 成分或其组合。在一个实施方案中，所述提取物是水提取物、己醇提取物或己醇-水混合物 提取物。在一个实施方案中，所述黄连的活性成分包括己马亭和/或小築碱、所述黄柏的活 性成分包括己马亭和/或小築碱，所述檐子的活性成分包括檐子巧，所述黄茂的活性成分 是黄辜素或汉黄辜素。
[001引在一个实施方案中，所述黄连、黄柏W及檐子的重量比可W 为（3. 5-4. 5) : (1. 5-2. 5) : (3. 5-4. 5)、（3. 8-4. 2) : (1. 8-2. 2) : (3. 8-4. 2)、 (3. 9-4. 1) : (1.9-2. 1) : (3.9-4. 1)、或更具体地 4:2:4。
[0014] 在一个实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种原小築碱生物碱和至少一种 环帰離聰巧。在一个实施方案中，所述至少一种原小築碱生物碱选自小築碱、己马亭、小築 红碱、黄柏碱、非洲防己碱、黄连碱W及表小築碱；并且所述至少一种环帰離聰巧是檐子巧。
[0015] 在一个实施方案中，所述组合物不包含用于治疗神经变性疾病的活性化合物黄辜 素化aicalein)。
[0016] 根据本发明的第二方面，提供了一种用于预防或治疗神经疾病的方法，所述方法 包括向哺乳动物施用一种组合物，所述组合物包含黄连化Unag Lian)、黄柏化Uang Bai) W 及檐子狂hi Zi),或主要由W上草药组成，其中所述组合物不包含黄辜化Uang Qin)。
[0017] 在一个实施方案中，在本发明的方法中，所述组合物W每天至少25mg/kg例如 25-35、27-32 或 29-31mg/kg 口服至少 3 个月诸如 4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 个月。
[0018] 在一个实施方案中，所述黄连、黄柏、檐子和黄辜可独立地选自草药自身、其提 取物、活性成分或其组合。在一个实施方案中，所述提取物是水提取物、己醇提取物或己 醇-水混合物提取物。在一个实施方案中，所述黄连的活性成分包括己马亭和/或小築碱、 所述黄柏的活性成分包括己马亭和/或小築碱，所述檐子的活性成分包括檐子巧，所述黄 茂的活性成分是黄辜素或汉黄辜素。
[0019] 在一个实施方案中，所述黄连、黄柏W及檐子的重量比可W 为（3. 5-4. 5) : (1. 5-2. 5) : (3. 5-4. 5)、（3. 8-4. 2) : (1. 8-2. 2) : (3. 8-4. 2)、 (3. 9-4. 1) : (1. 9-2. 1) : (3. 9-4. 1)、或更具体地 4:2:4。
[0020] 根据本发明的第H方面，提供了一种用于预防或治疗神经疾病的 方法，所述方法包括向哺乳动物施用一种组合物，所述组合物主要由干重比 为（3. 5-4. 5):(1. 5-2. 5):(3. 5-4. 5)、（3. 8-4. 2):(1. 8-2. 2):(3. 8-4. 2)、 (3. 9-4. 1) : (1. 9-2. 1) : (3. 9-4. 1)、或更具体地4:2:4的黄连、黄柏W及檐子组成，但是不 包括黄辜。
[002。 根据第H方面的第一个实施方案，组合物中黄连化unag Lian)、黄柏 化Uan浊ai) W 及檐子狂hi Zi)的干重比可 W 是（3. 5-4. 5) : (1. 5-2. 5) : (3. 5-4. 5)、 (3. 8-4. 2) : (1. 8-2. 2) : (3. 8-4. 2)、化 9-4. 1) : (1. 9-2. 1) : (3. 9-4. 1)、或更具体地 4:2:4。
[0022] 根据第H方面的第二个实施方案，所述组合物进一步包含黄连或黄柏或檐子的提 取物，而不包含黄辜的提取物。
[0023] 根据本发明的第H个实施方案，所述组合物进一步包含至少一种原小築碱生 物碱和至少一种环帰離聰巧。优选地，所述至少原小築碱生物碱包括小築碱、己马亭 (palmatine)、小築红碱、黄柏碱、非洲防己碱、黄连碱、表小築碱、药根碱或其组合；所述环 帰離聰巧是檐子巧（geniposie)。
[0024] 根据第H方面的第四个实施方案，所述组合物包含使用水或己醇-水混合物所提 取的黄连、黄柏W及檐子的提取物。
[00巧]根据第H方面的第五个实施方案，有待通过本发明的组合物治疗或预防的神经疾 病包括神经变性疾病。
[0026] 根据第H方面的第六个实施方案，所述神经疾病是与神经系统中的异常蛋白质聚 集或沉积相关的疾病，其中异常蛋白质聚集或沉积包括淀粉样蛋白-目肤（A目）的产生和 积聚、T蛋白过度磯酸化和/或神经胶质增生。
[0027] 根据第H方面的第八个实施方案，通过经由向有需要的哺乳动物受试者施用本发 明的组合物来抑制可溶性APP、APP的C端片段的产生或APP的磯酸化，减少淀粉样蛋白-目 肤的产生。
[002引根据第H方面的第九个实施方案，所述神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病、T蛋 白病、脑淀粉样血管病、痴呆、神经性情绪障碍、双相型障碍、精神分裂症、抑郁症、妥瑞氏综 合征（Tourette syn化ome)、AD皿W及相关的神经精神病状。
[0029] 根据第H方面的第十个实施方案，所述哺乳动物是人类。
[0030] 根据本发明的第四方面，提供了一种制备用于预防或治疗神经变性疾病的组合物 的方法，所述方法包括：
[0031] 将黄连、黄柏、檐子研磨成粉末形式；
[0032] 使粉末形式的黄连、黄柏W及檐子单独地穿过滤网至少立次，继而在己醇 或己醇-水混合物中进行超声处理W获得黄连提取物、黄柏提取物W及檐子提取 物；根据（3. 5-4. 5):(1.5-2. 5):(3. 5-4. 5)、（3. 8-4. 2):(1.8-2. 2):(3. 8-4. 2)、 (3. 9-4. 1) : (1. 9-2. 1) : (3. 9-4. 1)、或4:2:4的干重比将黄连提取物、黄柏提取物W及檐子 提取物组合；去除提取物中的己醇；W及将提取物冷冻干燥W形成组合物。
[0033] 本领域技术人员将了解，本文所述的本发明容许除所具体描述的那些变化方案和 修改方案W外的变化方案和修改方案。
[0034] 本发明包括所有该些变化方案和修改方案。本发明还包括本说明书中单独或共同 提及或指示的所有步骤和特征W及任何两个或者更多个的该些步骤或特征的任何和所有 组合。
[003引在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语"包含（comprise)"或诸如 "包含（comprises)"或"包含（comprising)"之类的变化形式将被理解成意味着包括所 述整数或整数组，但并不排除任何其它整数或整数组。还应指出的是，在本公开中并且特 别是在权利要求书和/或段落中，诸如"包含（comprises)"、"包含（comprised)"、"包含 (comprising)"等的术语可W具有在美国专利法扣.S. Patent law)中归属于它的含义； 例如，它们可W意指"包括（includes)"、"包括（included)"、"包括（including)"等；并 且诸如"主要由......组成（consisting essentially of)"和"主要由......组成（consists essentially of)"的术语具有在美国专利法中归属于它们的含义，例如，它们允许未明确叙 述的要素，但是不包括在现有技术中已存在的或影响本发明的基本特征或新颖性特征的要 素。
[0036] 此外，在整个本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语"包 括（include)"或诸如"包括（includes)"或"包括（including)"之类的变化形式将被理 解成意味着包括所述整数或整数组，但并不排除任何其它整数或整数组。
[0037] 本文所用的所选术语的其它定义可W参见【具体实施方式】并且适用于全篇。除非另 外定义，否则本文所用的所有其它技术术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人 员通常所了解的含义相同。
[0038] 通过审阅随后的描述，本发明的其它方面和优势对于本领域技术人员来说将是显 而易见的。

【专利附图】

【附图说明】
[0039] 根据本发明的W下描述，在结合附图一起考虑时，本发明的上述和其它目的和特 征将变得显而易见，在所述附图中：
[0040] 图I示出了在本发明中要求保护的组合物（即黄连解毒汤化JDT)的改进配方） 中所存在的活性化合物的化学结构（图1A) ; W及对W下各项的定性分析；改进的化JDT 配方（在245nm下）（A);檐子（FG)(在245nm下）做；黄连脱）（在275nm下）似；黄辜 (RS)(在275nm下）（D);黄柏仰）（在275nm下）似（图1B)。第1-6号峰表示；1.檐子 巧；2.小築碱；3.己马亭；4.黄辜素；5.黄辜巧化aicalin) ;6.汉黄辜素（Wogonin)。
[00川图2示出了化JDT提取物的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱 扣HPLC-Q-TOF-M巧的典型基峰色谱图（图2A)和提取离子色谱图（图2B)。1.檐子巧； 2.黄柏碱；3.非洲防己碱；4.黄连碱；5.表小築碱；6.药根碱；7.黄辜巧；8.己马亭；9.小 築碱；10.汉黄辜巧（Wogonoside) ;11.黄辜素；W及12.汉黄辜素。
[0042] 图3示出了化JDT、化JDT-M、组成草药W及组成化合物在对N2a-SwedAPP细胞的毒 性方面的作用。使用RC、CP、FG (图3A)或RS (图3B)的己醇提取物巧LJDT或化JDT-M (图 3C) 及小築碱或黄辜素（图3D)对N2a-SwedAPP细胞进行处理。通过MTT测定法来测定 细胞活力。值表示H次实验的结果并且显示为平均值+S.E.M。
[004引 图4示出了化JDT的草药提取物在改变N2a-SwedAPP细胞中的APP加工方面的作 用。自经过如所指示的不同剂量的RC(图4A)、CP(图4B)、FG(图4C)或RS(图4D)处理 48小时的N2a-SwedAPP细胞制备条件培养基和细胞溶解产物。使用蛋白质印迹法对条件 培养基中的sAPP a和sAPP目-SW进行检测，并且对细胞溶解产物中的Fl-APP、pAPP化r668 W及目-肌动蛋白进行检测。条柱表示H次实验的平均值+S.E.M.。
[0044] 图5示出了化JDT和化JDT-M在N2a-SwedAPP细胞中对APP加工的调节作用。自 经过如所指示的不同剂量的fflJDT (图5A)或HLJDT-M(图地）处理48小时的N2a-SwedAPP 细胞制备条件培养基和细胞溶解产物。条柱表示H次实验的平均值+S.E.M.。
[0045] 图6示出了小築碱和黄辜素在N2a-SwedAPP细胞中对APP加工的调节作用。自经 过不同剂量的小築碱（图6A)或黄辜素（图她）处理48小时的N2a-SwedAPP细胞制备条 件培养基和细胞溶解产物。条柱表示H次实验的平均值+S.E.M.。
[0046] 图7示出了化JDT、化JDT-M W及化JDT草药组分的提取物在所培养的 N2a-SwedAPP细胞中对细胞内A目水平的调节作用。在添加RC或CP (图7A) ;RS (图7B); 化JDT或化JDT-M (图7C) ; W及小築碱或黄辜素（图7D)之后48小时，通过酶联免疫吸附 巧Ij定法巧LISA)对N2a-SwedAPP细胞溶解产物中的A目1-40和A目1-42肤进行分析。条柱 表示相对于DMSO对照组（未处理组）H次实验中细胞内A目1-40或A目1-42肤的水平的 平均值+S.E.M.。
[0047] 图8示出了黄辜素使TgCRNDS小鼠的皮质-海马区A目斑块病变增加。经过媒介 物（图8A，i)或黄辜素（图8A，ii)(每天25mg/kg)处理并且在处理3个月后处死、继而使 用4G8抗体针对A目进行免疫组织化学染色的TgCRNDS小鼠的冠状切片。比例尺；100 y m。 由A目免疫反应性所占的冠状脑面积的百分比（图8B)。条柱表示每组五只小鼠的平均值 ±S. E.M.。
[0048] 图9示出了黄辜素处理使得TgCRNDS小鼠体内的促淀粉样变加工（amyloidogenic processing)增加。通过夹也化ISA对来自五只经过媒介物处理或五只经过黄辜素处理（每 天25mg/kg)的TgCRNDS小鼠的大脑半球的TBS-可溶性（图9A，i)、TBSX-可溶性（图9A， U) W及FA-可溶性A目1-40和AP 1-42(图9A，iU)的系列提取物进行测量。免疫印迹表 明来自上述小鼠的由TBS提取的脑溶解产物（图9B，i)和由TBSX提取的脑溶解产物（图 98，11)中34口口^1-4口口、口4口口1'虹668、口^^及目-肌动蛋白的水平。使用11113肖6 1对该些 免疫印迹进行光密度分析，其中将信号针对目-肌动蛋白的信号归一化。条柱表示每组五 只小鼠的平均值+S.E.M.。斯图登氏t-检验（S化dent'st-test)掲示出由于处理所造成 的显著性差异；*P<〇. 05, **p<0. 01。

【具体实施方式】
[0049] 本发明的范围不受本文所述的任何具体实施方案的限制。仅出于举例说明的目的 提供W下实施方案。
[0050] 本发明的一个目的在于提供一种改进的疗法，所述疗法通过减少患者的A目斑 块并且从而改善记忆力来治疗神经变性疾病。本发明的发明人发现常规的HLJDT会诱导 Fl-APP、sAPPa、sAPP目W及细胞内A目升高（目-淀粉样蛋白增加作用），从而降低治疗功 效。本发明与常规的化JDT相比不会诱导Fl-APP、sAPPa、sAPP目W及细胞内A目升高。 不包含RS的本发明还在治疗神经变性疾病方面显示出有效的治疗作用。本申请发现RS会 通过提高APP的蛋白质水平来增强A目（淀粉样蛋白目-肤）产生，该进而会降低常规的 化JDT在痴呆疗法中的功效。在体外模型（例如稳定表达瑞典型APP的鼠类N2a细胞）中 比较常规的化JDT配方与不包含RS的本发明要求保护的组合物对APP加工和细胞内A目 产生的作用。本申请细致地评价了町LDT的每一种单独的草药组分对不同的神经变性疾病 标记（例如APP、sAP化W及sAPP目）的水平的作用，W配制与改进的治疗神经变性疾病的 功效相关的本发明的组合物。
[0051] 材料与方法 [00的]化学品巧试剂
[005引 用于细胞培养的杜氏改良伊格氏培养基值U化ecco' S modified Eagle' S medium, DMEM)、胎牛血清（FB巧、青霉素（penicillin)、链霉素（streptomycin) W及G418购自英杰 公司（Invitrogen)(美国加利福尼亚州卡尔斯己德（Carlsbad, CA, USA))。聚偏二氣己帰 (PVD巧膜获自GE医疗集团生命科学部口佑E化althcare BioSciences)(美国新泽西州皮 斯卡培韦（Piscataway，NJ，USA))的Hybond-P。增强型化学发光巧化）试剂购自赛默科技 公司（Thermo Scientific)(美国伊利诺伊州罗克福德（Rock化rd，比，USA))。除非另外指 明，否则四甲基联苯胺（TMB)购自抓生物科学公司炬D Biosciences)(美国马里兰州斯帕 克斯（Sparks, MD, USA))，而分析级试剂（包括己醇和甲醇）来自于西格玛-奧德里奇公司 (Sigma-Al化ich)(美国密苏里州圣路易斯（St. Louis, MO, USA))。小築碱、黄辜巧W及黄辜 素购自西格玛-奧德里奇公司。己马亭和檐子巧购自健腾生物技术公司（Aktin化emicals) (中国成都（化eng化,化ina))。
[0054] 单克隆目-肌动蛋白抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（Santa化UZ Biotechnology)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯（Santa Cruz, CA, USA))。针对APP的C端的兔 多克隆CT15抗体由Edward Koo教授（美国加利福尼亚州圣地亚哥市拉霍亚的加利福尼亚 大学（University of 化Iifornia, SanDiego, LaJolla, CA, USA))馈赠。氨基端抗 A 目 1-17 单克隆抗体化E10)和生物素化的A目17-24 (4G8)单克隆抗体定购自科文斯公司（Covance) (美国新泽西州普林斯顿（Princeton, NJ, USA))。人类抗sAPP目瑞典型（sAPP目-SW)单克 隆抗体（克隆6A1)由I化公司（日本）提供。抗pAPPT虹668多克隆抗体来自于赛信通公 司（Cell Signaling)(美国马萨诸塞州丹弗斯值anvers，M，USA))。駿基端生物素化的抗 淀粉样蛋白bG4 (1-40) -5C3 (对相应于A目40的肤具有特异性）和bA4 (1-42) -8G7 (对相应 于A目42的肤具有特异性）抗体购自Nanotools (德国特宁根（Teningen, Germany))。与抗 生物素蛋白链菌素缀合的辣根过氧化物酶（HR巧购自DAKO公司（美国加利福尼亚州卡平 特里亚（Ca巧interia，CA, USA))。A目40和A目42肤分别由英杰公司（美国加利福尼亚州 卡尔斯己德）和加利福尼亚州肤研究公司（California化ptide)(美国加利福尼亚州纳帕 (Napa, CA, USA))提供。
[00巧]枯物据取
[005引 RC、RS、CP W及FG购自香港浸会大学陈汉贤伉佩中医专科诊所暨临床规范研究 中也化ong Kong Baptist University Mr. &Mrs. Chan Hon Yin Chinese Medicine Specialty Clinic and Good Clinical Practice Centre)和当地中药房。所有草药均由来自香港的香港 浸会大学中医药学院（School of Qiinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Hong Kong)的化ong-化en化ao (赵中振）教授鉴定和验证。将植物的干燥物质研磨成粉末。将 约IOg的每一种草药组分的粉末W及化JDT(干重比为3:2:2:3的RC、RS、CP W及FG)的 粉末和本发明的草药组合物（干重比为4:2:4的RC、CP W及FG)的粉末在IOOmL的80 % 己醇中浸泡1小时，同时在120曲Z的频率进行超声处理（香港的H和超声波工程有限公 司（SANH0 叫trasonic !Engineering Ltd. ,Hong Kong));然后将提取的溶液过滤。将该一 程序重复H次。使用该种溶剂W使提取标准化并且集中在筛选。收集约300mL的每一种 所提取的溶液，然后通过在真空下在6(TC水浴中旋转蒸发巧YELA，日本东京理化器械公司 (Tokyo RAaldkai Co. , Ltd. , Japan))浓缩。最终在-40°C下在105微己的真空下将所有 提取物进行冻干（LABC0NC0,美国密苏里州的实验室建设公司（L油oratory Construction Company, MO, USA))。使植物的每一种产物成粉末并且混合直到均匀为止，然后储存在4°C 下W供随后使用。使用二甲亚讽（DMSO)作为溶剂使提取物溶解，并且将它加载W作为所 有细胞培养物的媒介物对照。虽然在一些研究中已使用过化JDT的水提取物，但是已发 现在与水提取物相比，己醇提取物是理想的，能够W更高的量从化JDT中分离出大部分的 生物活性化合物。据 Wang GX，Zhou Z，Jiang DX，化n J，Wang JF，Zhao LW，Li J. (2010)，In vivo anthelmintic activity of five alkaloids from Macleaya microcarpa(Maxim) Fedde. Against Dactylogyrus intermedius in Carassius auratus(来自小果博落回的 五种生物碱对抗侧鱼的中型指环虫的体内驱虫活性），Vet Paras i to 1171:305-313 ; W及 Khoddami A, Wilkes MA, Roberts TH. (2013), Techniques for analysis of plant phenolic compounds (用于对植物酷类化合物进行分析的技术），MoleculeslS :2328-2375中报道，与 水提取物相比，己醇可W提取出更高浓度的类黄丽、多酷W及更多的生物碱化合物。因此， 在本发明中使用己醇W使提取标准化并且集中在筛选。然而，应了解，草药组分的水提取物 和水-己醇提取物在本发明中也适用。
[00W] 朽谱条件
[005引在具有G1315A二极管阵列检测器的AgilentllOO系列（美国加利福尼亚州）上 进行 HPLC。使用 AlltimaTMClS 柱（250X4. 60mm，粒度；5ym) W 进行分离。HPLC 条件 如下；洗脱剂A ;含0. 1 %甲酸的&0;洗脱剂B ;甲醇，W 1毫升/分钟的流速进行线性梯 度洗脱（0分钟，15%6;0-15分钟，15%-38%6;15-30分钟，38%-90%6;30-30.1 分 钟，90% - 100% B ;30. 1-33 分钟，100% B ;33-33. I 分钟，100% - 15% B ;33. 1-36 分钟， 15% B)。通过将峰的保留时间与使用相同的流动相并行洗脱的每一种参考化合物的保留 时间相匹配来对所述峰进行归属。根据代表性的校准曲线来确定分析物的浓度（表1)。 从化JDT和它的单独的草药的己醇提取物的HPLC图谱发现，在将己醇提取物中可能存在 的六种已知组分（檐子巧、小築碱、己马亭、黄辜素、黄辜巧W及汉黄辜素）的浓度进行比 较时，小築碱的含量最丰富化02%)，其次是檐子巧（4. 01%)、黄辜巧化67%)、黄辜素 (1.31%)、己马亭（0.867%) W及汉黄辜素（0.615%)(图1B、表1)。基于HLJDT的四种草 药组分，檐子巧是由FG提供的；小築碱和己马亭主要分别存在于RC和CP中；并且黄辜巧、 黄辜素W及汉黄辜素是由RS提供的。最近在Durairajan SSK，Liu LF，Lu JH，Chen化，化an Q, Chung SK, Huang L, Li XS, Huang JD, Li M(2012), Berberine ameliorates目-amyloid pathology, gliosis, and cognitive impairment in an Alzheimer's disease transgenic mouse model(小築碱改善阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型的目-淀粉样蛋白病变、神经 胶质增生 W 及认知障碍），Neurobiol Aging33:2903-2919 ;Lu JH, Ard址 MT, Durairajan SSK，Liu LF，Xie LX，Fong WF，Hasan MY，Huang JD, El-A即af OM, Li M (2011) ,Baicalein inhibits formation of a-synuclein oligomers within living cells and prevents A目peptide fibrillation and oligomerisation(黄辜素抑制活细胞内a -突触核蛋白低 聚物形成并且防止A目肤原纤维化和低聚化），化embiocheml2:615-624;W及WangL,Yan S 和 Zhang WS(2012), Effects of an early-and late-stage treatment with Geniposide on cognitive dysfunction in a transgenic mouse model relevant to Alzheimer' S disease (使用檐子巧进行早期处理和晚期处理对与阿尔茨海默氏病有关的转基因小鼠模 型的认知功能障碍的影响），Mol Neurodegene^:S4中的研究已经显示，小築碱、黄辜素W 及檐子巧在阿尔茨海默氏病模型中具有神经保护作用。因此，使用该H种化合物（图1A) 对化JDT的己醇提取物进行定量分析。
[0059] 表1示出了通过HPLC分析定量的化JDT的每一种草药提取物中檐子巧、小築碱、 己马亭、黄辜巧、黄辜素W及汉黄辜素的含量（％)。
[0060] 含量（％ )
[0061] 组分 RC RS CP FG HLJDT
[0062]

【权利要求】
1. 一种草药组合物，包含黄连（Rhizoma coptidis)、黄柏（Cortex phellodendri)以及 桅子（Fructus gardenia)，并且其中所述组合物不包含黄苳（Radix Scutellariae)。
2. 根据权利要求1所述的草药组合物，其中所述黄连、黄柏、桅子和黄芩独立地选自草 药自身、其提取物、活性成分和其组合。
3. 根据权利要求2所述的草药组合物，其中所述提取物是水提取物、乙醇提取物或乙 醇-水混合物提取物。
4. 根据权利要求2所述的草药组合物，其中所述黄连的活性成分包括巴马亭和/或小 檗碱、所述黄柏的活性成分包括巴马亭和/或小檗碱，所述桅子的活性成分包括桅子苷，所 述黄芪的活性成分是黄芩素或汉黄芩素。
5. 根据权利要求1或2所述的草药组合物，其中所述黄连、黄柏以及桅子的重量比为 (3. 5-4. 5) : (1. 5-2. 5) : (3. 5-4. 5)。
6. 根据权利要求5所述的草药组合物，其中所述黄连、黄柏以及桅子的重量比为 (3. 8-4. 2) : (1. 8-2. 2) : (3. 8-4. 2)。
7. 根据权利要求6所述的草药组合物，其中黄连、黄柏以及桅子的重量比为4:2:4。
8. 根据权利要求1所述的草药组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种原小檗碱 生物碱和至少一种环烯醚萜苷。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种原小檗碱生物碱选自小檗碱、巴马 亭、小檗红碱、黄柏碱、非洲防己碱、黄连碱以及表小檗碱；并且所述至少一种环烯醚萜苷是 桅子苷。
10. -种用于预防或治疗神经疾病的方法，所述方法包括向哺乳动物施用组合物，所述 组合物包含黄连、黄柏以及桅子，其中所述组合物不包含黄芩。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述黄连、黄柏、桅子和黄芩独立地选自草药自 身、其提取物、活性成分和其组合。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述提取物是水提取物、乙醇提取物或乙醇-水 混合物提取物。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述黄连的活性成分包括巴马亭和/或小檗碱、 所述黄柏的活性成分包括巴马亭和/或小檗碱，所述桅子的活性成分包括桅子苷，所述黄 芪的活性成分是黄芩素或汉黄芩素。
14. 根据权利要求10或11所述的方法，其中所述黄连、黄柏以及桅子的重量比为 (3. 5-4. 5: (1. 5-2. 5) : (3. 5-4. 5)。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述黄连、黄柏以及桅子的重量比为 (3. 8-4. 2) : (1. 8-2. 2) : (3. 8-4. 2)。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中黄连、黄柏以及桅子的重量比为4:2:4。
17. 根据权利要求10所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种原小檗碱生物 碱和至少一种环烯醚萜苷。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一种原小檗碱生物碱选自小檗碱、巴 马亭、小檗红碱、黄柏碱、非洲防己碱、黄连碱以及表小檗碱；并且所述至少一种环烯醚萜苷 是桅子苷。
19. 根据权利要求10所述的方法，其中所述神经疾病包括神经变性疾病。
20. 根据权利要求10所述的方法，其中所述神经疾病是与神经系统中的异常蛋白质聚 集或沉积相关的疾病，其中所述异常沉积包括淀粉样蛋白_β肽（Αβ)的产生和积聚、τ蛋 白过度磷酸化和/或神经胶质增生。
21. 根据权利要求10所述的方法，其中所述组合物通过抑制可溶性ΑΡΡ、ΑΡΡ的C端片 段的产生或ΑΡΡ的磷酸化来减少所述哺乳动物体内淀粉样蛋白-β肽的产生、聚集或沉积， 从而预防和治疗所述神经疾病。
22. 根据权利要求19所述的方法，其中所述神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病、τ蛋 白病、脑淀粉样血管病、痴呆、神经性情绪障碍、双相型障碍、精神分裂症、抑郁症、妥瑞氏综 合征、ADHD以及相关的神经精神病状。
23. 根据权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
24. 根据权利要求10所述的方法，其中所述组合物以每天25-35mg/kg 口服至少3个 月。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述组合物以每天25mg/kg 口服至少3个月。
【文档编号】A61P25/18GK104225023SQ201410265207
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】李敏, S·S·K·都莱拉詹, 陈蕾蕾, 刘亮锋, 宋聚先 申请人:香港浸会大学