一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法
【专利摘要】一种兽用卵泡刺激素类似物及其制备方法，根据α和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列，其连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：5、SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8、SEQ?ID?NO：9、SEQ?ID?NO：10、SEQ?ID?NO：11、SEQ?ID?NO：12、SEQ?ID?NO：13、SEQ?ID?NO：14、SEQ?ID?NO：15、SEQ?ID?NO：16、SEQ?ID?NO：17、SEQ?ID?NO：18、SEQ?ID?NO：19、SEQ?ID?NO：20中的任一种，通过研究比较其各自的表达量和生物活性。本发明所制得的兽用卵巢刺激素类似物的融合蛋白与已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多个融合蛋白的表达量明显提高，对于天然卵巢刺激素具有替代作用，有重大的商业价值，值得大范围推广。
【专利说明】一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种兽用卵泡刺激素类似物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone, FSH)是由动物脑垂体前叶嗜碱性 细胞合成和分泌的一种糖蛋白激素，由α和β两条多肽链（或称亚基）以非共价键联结 而成。可以促进雌激素的分泌、诱导动物发情、促进卵泡卵子成熟、超数排卵和刺激精子生 成。
[0003] 目前兽用FSH均为动物脑组织提取物，不但参杂不同含量的促黄体素致使超排效 果不稳定，还有携带生物源性传染物的潜在危险。通过基因工程研发兽用FSH，是当前的研 究热点。迄今已见诸于报道的有关基因重组FSH的基因工程策略主要有两种。一种是α 和β两条多肽链分别表达后，再通过非共价键联结形成异源二聚体。这种方法受该两条多 肽链彼此联结的效率所限，因而许多研究者转而研究如何把α和β两条多肽链在基因水 平连接在一起，从而编码为单一肽链的融合蛋白。其中在α和β两条多肽链之间起连接 作用的氨基酸序列称为连接序列（Linker)。Weenen等（J Clin Endocrinol Metab，2004， 89:5204-5212.)以及美国专利申请公告US 2008/0234186 A1通过人FSH的α和β两条 多肽链与不同的连接序列重组，比较所形成的融合蛋白的活性。在连接序列内分别引进含 1、2和4个Ν-连接糖基化位点序列，或采用人绒毛膜促性腺激素 β亚基的羧端肽（CTP) 作为连接序列。所得到的融合蛋白FSH-NUFSH-N2和FSH-Μ、和FSH-CTP的糖基化程度和 体内半衰期均较野生型FSH明显增加，但体内半衰期与糖基化程度的增加并不呈简单的线 性关系。该发明强调了糖基化对长效的作用，但未充分考虑到连接序列本身对于融合蛋白 表达的影响。结果表明其表达量都仅在1.3-14pmol/ml的范围之内（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212 和美国专利申请公告 US2008/0234186 A1)。
[0004] 连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应等特性与融合蛋白中的α和β肽 链在彼此联结之前能否各自折叠成为正确的空间结构密切相关。两条肽链以及其间的连接 序列，这三者空间三维结构的相互关系直接影响融合蛋白的生物活性，也影响融合蛋白的 产量。所以适应于α和β肽链的连接序列碱基的选择及其排列顺序至关重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种兽用卵泡刺激素类似物及其制备方法。针对上述现有 技术存在的问题，根据α和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计 连接序列从而得到不同的兽用卵泡刺激素类似物。对由不同连接序列融合而成的不同的卵 泡刺激素类似物的产量和生物活性进行比较与筛选，从中选出高表达量的最佳序列。
[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] -种兽用卵泡刺激素类似物，所述兽用卵泡刺激素类似物中，根据α和β肽链 间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列，其连接序列对应的核苷 酸序列为：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20 中的任一种。
[0008] 进一步的，所述连接序列对应的核苷酸序列为：SEQ ID N013、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18 中的任一种。
[0009] 进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法包括如下步骤：
[0010] 步骤一、将Genbank上记载的天然羊卵泡刺激素两个亚基β和α基因并在其间 插入已知连接序列（两端含酶切点），进行全序列合成（SEQ ID NO :1)，再用pcDNA3. 1 (+) 质粒进行分子克隆。分别
[0011] 步骤一、将Genbank上记载的天然羊卵泡刺激素β和α亚基的基因通过两端分 别含BamHI、SpeI酶切点的已知连接序列连接起来，进行全序列合成，其序列为SEQ ID Ν0: 1，两端分别函Nhe I和EcoR I酶切点，再用pcDNA3. 1 (+)质粒进行分子克隆；经过双酶切， 依次用下列19个序列取代上述的已知连接序列，SEQ ID N0 :2、SEQ ID N0 :3、SEQ ID N0 : 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO :11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20,以制备 19 种不同的新的 表达质粒；将所得表达质粒转染DH5大肠杆菌，经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质 粒DNA，酶切鉴定后进行测序；
[0012] 步骤二、重组质粒DNA序列经确认之后，进行单酶切，使之线性化，线性化后转染 CH0细胞，经G418抗性筛选，单克隆化，通过western blotting挑选高表达克隆；
[0013] 步骤三、进行逐级放大传代培养扩增，western blotting检测培养液，证实重组 FSH高表达，细胞加防冻剂，分装液态氮冻存；
[0014] 步骤四、复苏，经含血清培养基培养，无血清培养驯化，逐级放大传代培养扩增，证 实重组FSH高表达，作为种子细胞加防冻剂，分装液态氮冻存。
[0015] 进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤一中，双酶切的内切酶为：限 制性内切酶Nhe I和EcoR I。
[0016] 进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤二中，单酶切的限制性内切 酶为 Pspl406I。
[0017] 进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤二中，所述G418抗性筛选的 浓度为800 μ g/ml。
[0018] 进一步的，所述兽用卵泡刺激素类似物制备方法步骤三中，分别选取25cm2、75cm 2、 175cm2、225cm2的细胞培养瓶进行逐级放大传代培养扩增。
[0019] 进一步的，包含上述任一连接序列的兽用卵巢刺激素类似物及含有该兽用卵巢刺 激素类似物的药物在促进卵泡发育方面的应用。
[0020] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明根据α和β肽链间连接序列的长 度、可折叠性、疏水性、电荷效应设计了一组不同的连接序列，从而得到一组不同的兽用卵 巢刺激素类似物，通过研究比较其各自的表达量和生物活性。本发明所制得的兽用卵巢刺 激素类似物的融合蛋白与已知的融合蛋白具有相似的生物功能，且其中多个融合蛋白的表 达量明显提高，对于天然卵巢刺激素具有很好的替代作用，具有重大的商业价值，值得大范 围推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1 :为采用western blotting半定量监测重组FSH的表达图，将重组FSH进行 工程细胞的单克隆挑选。1 :蛋白分子量标准；2 :未转染的CH0细胞培养液（阴性对照），加 样量为20 μ 1 ;3-8 ;六个克隆已转染的CH0细胞培养液，加样量分别为15 μ 1。根据条带显 影的强度判断表达量。主带上方的条带是重组蛋白的二聚体，主带下方的条带为降解产物。
[0022] 图2 :为比较卵泡刺激素类似物的卵巢增重功能图。标准品和7份受试品均 体现量效关系，基本呈直线关系。其中由已知的连接序列（Linkerl)和本发明设计 的连接序列（Linkerl6)与标准品三者的斜率基本一致（k分别为21.782(Linkerl)， 21. 785 (Linkerl6)，和 21. 783 (标准品）。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图及具体实施例对本发明方案做进一步详细说明：
[0024] 实施例1 :表达质粒的构建和工程细胞的建立
[0025] 1.根据Genbank上记载的天然羊FSH的氨基酸序列和核苷酸序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez ? cmd = Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 57619323,和 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez ? cmd =Retrieve&db = nucleotide&dopt = GenBank&list uids = 1365)，设计并进行全基 因SEQIDNO:l合成，含已知连接序列（Linkerl):ggatccggctccaacgccaccggctccggc tccaacgcca cctccggctc cactag 序列（J Clin Endocrinol Metab，2004,89:5204-5212)。
[0026] 2.构建表达质粒：将双链SEQ ID NO 1和pcDNA3. 1(+)质粒经过分别经过双 酶切（Nhel和EcoRI)，l%琼脂电泳分离，萃取。将经过双酶切处理过的SEQ ID NO 1和 pcDNA3. 1(+)质粒通过连接酶ligase连接。按标准CaCl2法转染DH5a大肠杆菌，经氨 节青霉素抗性筛选，37°C培养。按质粒提取试剂盒（Quiagen)的说明书提取单克隆菌落 质粒DNA，命名为pcDNA3. 1-FSH1。酶切鉴定后进行测序确认、备用。将pcDNA3. 1-FSH1 经过BamHI+Spel双酶切，经过1 %琼脂电泳分离，弃除Linker 1，萃取获得线性化的 pcDNA3.1-FSH，备用。双链的 SEQ ID N0:2(Linker2)、SEQ ID N0:3(Linker3)、SEQ ID N0: 4(Linker4)、SEQ ID N0:5(Linker5)、SEQ ID N0:6(Linker6)、SEQ ID N0:7(Linker7)、SEQ ID NO :8(Linker8)、
[0027] SEQ ID NO :9 (Linker9)、SEQ ID NO :10 (Linker 10)、SEQ ID NO :11 (Linker 11)、 SEQ ID NO ：12(Linkerl2), SEQ ID NO ： 13 (Linkerl3), SEQ ID NO ： 14 (Linker 14), SEQ ID NO ：15(Linkerl5), SEQ ID NO ： 16(Linkerl6), SEQ ID NO ： 17(Linkerl7), SEQ ID NO： 18(Linkerl8)、SEQ ID N0:19(Linkerl9)、SEQ ID N0:20(Linker20)(以下简称 Linker2 ? 20)，分别经过BamHI+Spel双酶切，分别经过1%琼脂电泳分离、萃取。将经过双酶切 的Linker2?20分别与pcDNA3. 1-FSH连接，获得19份重组质粒（pcDNA3. 1-FSH2? pcDNA3. 1-FSH20)，用于转染DH5 α大肠杆菌。经氨苄青霉素抗性筛选，分别提取单克隆菌 落质粒DNA，获得相应的19份重组质粒pcDNA3. 1-FSH2?pcDNA3. 1-FSH20。酶切鉴定后进 行测序确认。
[0028] 3.建立工程细胞：
[0029] 3. 1. CH0细胞贴壁生长：转染的前一天，以3?4xl05/ml的细胞密度接种6孔培养 板，培养基含10%牛血清全培养剂DMEM。共设21孔。
[0030] 3. 2.质粒的线性化和脂质体包裹：重组质粒序列经测序确认之后，采用限制性内 切酶Pspl4061分别进行酶切线性化。将2 μ 1 (1 μ g/ μ 1)经线性化了的重组质粒DNA溶入 200 μ 1无血清培养基中，混勻；另外将20 μ 1脂质体Lipofectin (Invitrogen)溶入200 μ 1 无血清培养基中，轻轻混匀，再将制备好的DNA与脂质体轻轻混合均匀，室温放置25? 30min，待用。依照同样方法制备21份混合溶液，其中1份省略了质粒，作为阴性对照。
[0031] 3. 3.细胞的转染：CH0细胞在6孔培养板里含小牛血清的培养基贴壁培养至 85-95%，用无血清培养基冲洗两遍后，加入2ml无血清培养基。将上述21份混合溶液分别 加入21个孔中，轻轻摇匀。在37°C，5%的C0 2，饱和湿度中孵育12h，更换含10%牛血清的 全培养基继续培养48?72h。
[0032] 3. 4.抗性细胞的筛选：将转染细胞进行传代生长24h后，更换为选择性培养基 (5%小牛血清并含有600 μ 1 G418)继续培养。间隔2?3d换液一次，待阴性对照细胞全 部死亡时，收集G418抗性的CH0细胞系。0. 25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37°C条 件下，消化1-2分钟。并用培养液吹散，准确计数。分别以2xl(T6/ml密度接种细胞贴壁培 养，三天后采用已知的放射免疫法（J Clin Endocrinol Metab，2004,89 :5204-5212.)检测 各培养液上清液中卵泡刺激素类似物的浓度结果如表1 (pRIA，表1)。
[0033] 表1.各培养液上清液中卵泡刺激素类似物的浓度
[0034]
[0035]
【权利要求】
1. 一种兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类似物中，根据α 和β肽链间连接序列的长度、可折叠性、疏水性、电荷效应来设计连接序列，其连接序列对 应的核苷酸序列为：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO ： 12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20 中的任一种。
2. 根据权利要求1所述的兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述连接序列对应的 核苷酸序列为：SEQ ID N013、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO :18中的任一种。
3. 根据权利要求1或2任一权利要求所述的兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述 兽用卵泡刺激素类似物制备方法包括如下步骤： 步骤一、将Genbank上记载的天然羊卵泡刺激素 β和α亚基的基因通过两端分别含 BamHI、SpeI酶切点的已知连接序列连接起来，进行全序列合成，其序列为SEQ ID Ν0:1，两 端分别函Nhe I和EcoR I酶切点，再用pcDNA3. 1 (+)质粒进行分子克隆；经过双酶切，依次 用下列19个序列取代上述的已知连接序列，SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20,以制备 19 种不同的新的表达质 粒；将所得表达质粒转染DH5大肠杆菌，经氨苄青霉素抗性筛选，提取单克隆菌落质粒DNA, 酶切鉴定后进行测序； 步骤二、重组质粒DNA序列经确认之后，进行单酶切，使之线性化，线性化后转染CH0细 胞，经G418抗性筛选，单克隆化，通过western blotting挑选高表达克隆； 步骤三、进行逐级放大传代培养扩增，western blotting检测培养液，证实重组FSH高 表达，细胞加防冻剂，分装液态氮冻存； 步骤四、复苏，经含血清培养基培养，无血清培养驯化，逐级放大传代培养扩增，证实重 组FSH高表达，作为种子细胞加防冻剂，分装液态氮冻存。
4. 根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类 似物制备方法步骤一中，目的基因全序列插入pcDNA3. 1所需的双酶切的内切酶为：限制性 内切酶Nhe I和EcoR I ;置换连接序列所需的内切酶为：BamHI和Spel。
5. 根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类 似物制备方法步骤二中，单酶切的限制性内切酶为Pspl406I。
6. 根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类 似物制备方法步骤二中，所述G418抗性筛选的浓度为800 μ g/ml。
7. 根据权利要求3所述兽用卵泡刺激素类似物，其特征在于，所述兽用卵泡刺激素类 似物制备方法步骤三中，分别选取25cm2、75cm 2、175cm2、225cm2的细胞培养瓶进行逐级放大 传代培养扩增。
8. 包含权利要求1或2任一连接序列的兽用卵巢刺激素类似物及含有该兽用卵巢刺激 素类似物的药物在促进卵泡发育方面的应用。
【文档编号】A61P15/08GK104152457SQ201410331313
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】林俊生, 刁勇 申请人:林静静, 刁勇