重组型马科动物促卵泡激素的活性的制作方法

专利名称：重组型马科动物促卵泡激素的活性的制作方法
重组型马科动物促卵泡激素的活性相关专利申请的交叉引用本申请要求以2007年11月30日提交的美国临时申请60/991，297为优先权基础， 该临时申请通过引用的方式全文纳入本文至不与本公开文本矛盾的程度。
背景技术：
孕酮为维持妊娠所需，且低孕酮浓度与不孕有关。血液孕酮浓度受分泌和代 谢/清除速度的影响。有证据表明，现代乳牛中维持的血液孕酮浓度低于在数十年前 的牛中测量的血液孕酮浓度(Lucy et al. (1998) "Reproductive endocrinology of lactating dairy cows selected for increased milk production, " J. Anim. Sci., 76(Suppl. 1) :296)。较大黄体分泌更多孕酮，并且对妊娠识别和妊娠率有积极效果，但 有证据表明在一些情况下乳牛具有小于预期的黄体(Lucy 2001，supra ；Vasconcelos et al. (2001)"Reduction in size of the ovulatory follicle reduces subsequent luteal size and pregnancy rate,，，Theriogenology，56 :307_314)。月干是孕丽代 的主要部位。 最近的研究表明，饲料摄取的增多会增加肝血流并增加孕酮清除的速率，从而降低血清孕 酮浓度(Sangsritavong et al. (2000)"Liver blood flow and steroid metabolism are increased by both acute feeding and hypertrophy of the digestive tract,"J. Anim. Sci.，78(Suppl 1)221 ；and WiltbankiM. C. et al. (2001) "Novel effects of nutrition on reproduction in lactating dairy cows，，，J· Dairy Sci. , 84 (Suppl. 1) :84)。动情周期的黄体期期间中的低血清孕酮与较低的初次配种受孕率有关。低 孕酮浓度可由不充分的分泌或者由高水平的代谢/清除引起，甚至在授精已产生可能 存活的胚胎时也这样。低孕酮将使得子宫内膜在牛族动物动情周期大约16天时生成 前列腺素，导致黄体解体和产生排卵，从而导致胚胎死亡和妊娠维持失败(Binelli， Μ. et al. (2001) “Antiluteolytic strategies to improve fertility in cattle, ”Theriogenology，56 :1451-1463)。在受精动物中，血清孕酮增加或血清孕酮保持 在合适水平是一种有希望的治疗方法，用于维持妊娠和避免流产。如今，多种激素疗法被用于提高生育率或者用于维持妊娠。Thatcher等人 (2001Theriogenology 55:75-89)描述了激素治疗对牛生殖能力的效应。激素治疗包括给 予牛族动物生长激素(bST)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)。D' Occhio等人(2000Anim. Reprod. Sci. 60-61 :433_442)描述了多种用于肉牛管理的方法，使用了促性腺激素释放激 素(GnRH)激动剂植入物。De Rensis 等人(2002Theriogenology58 (9) 1675-1687)描述了 在人工授精之前给予GnRH或hCG对乳牛的效应。Martinez等人(1999Anim. Reprod. Sci. 57 23-33)描述了猪黄体生成素(LH)和GnRH在小母肉牛排卵(第O天)后但未授精的动 情周期第3、6和9天时诱导卵泡波发生的能力。Santos等人(2001J. Animal Science 79: 2881-2894)描述了向人工授精后第5天的高产乳牛肌内给予3，300IU的hCG对生殖能力 的效应。Lee等人(1983Am. J. Vet. Res. 44(11) =2160-2163)描述了在人工授精时给予GnRH 对乳牛的效应。美国专利5，792，785 (1998年8月11日授权)和6，403，631 (2002年6月11日授权)描述了用于在授精前后给予褪黑激素以在动物中提高成功妊娠的方法和组合 物。Chagas e Silva 等人(2002Theriogenology58 (1) :51_59)描述了乳牛中胚胎移植后 白勺个青;51。 Weems 等)κ (1998Prostaglandins and other Lipid Mediators) 了激素对来自未怀孕和怀孕母牛的黄体(CL)分泌孕酮的效应。美国专利4，780，451 (1988 年10月25日授权)描述了使用LH和促卵泡激素在牛中产生超排卵的组合物和方法； Farin等人(1988Biol. R印rod. 38 :413_421)描述了在未授精的动情周期第5和7. 5天静 脉内给予300IU的hCG对羊黄体重量的效应。Hoyer和Niswender (1985Can. J. Physiol. Pharmacol. 63 (3) 240-248)描述了对羊黄体细胞中类固醇生成的调节。Juengel和 Niswender (1999 J. Reprod. Fertil. Suppl. 54 193-205)描述了驯养反刍动物中黄体孕酮 的分子调节。美国专利5，589，457 (1996年12月31日授权)描述了使用GnRH、LH和/或 hCG和PGF2a在牛中同步排卵的方法。这些治疗中许多使用来自糖蛋白激素家族的激素或激素类似物，糖蛋白激素家 族包括垂体蛋白黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和绒毛膜促性 腺激素(CG)。包括CG、FSH和LH在内的促性腺激素对生殖功能是必要的。它们是由两 个非共价连接的α和β亚基组成的异二聚体。两亚基都是糖基化的，含天冬酰胺(N) 连接的寡糖，并且在CG β亚基的情况下，0联糖还存在于氨基酸串的羧基端。单个的人 β亚基由不同的基因编码，LH β和CG β蛋白在结构上和功能上类似；具有超过80% 的氨基酸同一性(Pierce JG, Parsons (1981) "Glycoprotein hormones structure and function, "Biochem. 50 =465-495) 0在一个物种中，α亚基氨基酸序列为所有四种激素所 共有(Pierce JG, Parsons (1981) Biochem. 50 :465_495)。所有哺乳动物都合成LH，而CG仅在灵长类和马科动物中被鉴定。与灵长类不同， 马科动物LHi3和马科动物CGi3蛋白由相同基因编码，并具有相同的蛋白序列。然而，马 科动物胎盘CG(eCG)中的N联寡糖含末端半乳糖和唾液酸，而GalNAc硫酸盐是马科动物 垂体LH(eLH)中主要的末端残基。eCG的糖含量超过其质量的40%，并且是整个糖蛋白 激素种类中糖基化程度最高的(Bousfield et al. (2001) "Identification of twelve 0-glycosylation sites in equine chorionic gonadotropin and equineluteinizing hormone β by solid-phase Edman degradation,，，Biol Reprod. 64 136-147 ；Moore and Ward(1980) "Pregnant mare serum gonadotropin. An in vitro biological characterization of the lutropin-folIitropin dual activity"J Biol Chem255 6923-6929)。这可归因于与灵长类CG相比丰度更高的0联糖单元。相反，eLH的糖含量为 25% (Bousfield et al. (2001)Biol R印rod. 64 136-147)。在母马和种马中，使用多种来自其他物种的激素是不令人满意的，这是因为 它们有可能激发强的免疫反应。一种这类诱导抗体反应的激素为hCG(R0Ser et al., 1979)。或者，GnRH、马科动物垂体提取物和马科动物绒毛膜促性腺激素(eCG;以前称为 孕马血清促性腺激素(PMSG))已被尝试。短效布舍瑞林(Buserelin) (GnRH激动剂)已 被成功地用于诱导排卵，但需要在48小时的时间内注射多于一次以诱导排卵。戈那瑞林 (Cystorelin)(天然GnRH)也是短效的，需要多于一次注射，并且未被许可用于马中。地洛 瑞林(Deslorelin) (GnRH类似物)对于在24-48小时中刺激排卵方面能起到很好的作用。 地洛瑞林(Deslorelin)已经被以两种形式投放市场缓释植入物或缓释注射物。植入物Ovuplant 被发现可在48小时内有效诱导排卵，但当如指示应用时在一些母马中阻碍它们 恢复发情达几周(Johnson et al.，2002)。Ovuplant 现已退市。注射形式的GnRH的作用 很好，某种程度上可作为“配方试剂”获得。垂体提取物可为有效的生殖治疗药物，但含有污染物，并且它们的LH和FSH量可 能不同。以垂体提取物或GnRH母马或种马导致性腺暴露于相对固定比例的LH和FSH，提 供的控制性腺的卵泡发育、排卵或精子发生的可能性有限。另外，马科动物垂体提取物仅包 含8-10% LH和6-8% FSH (GuiIlou and Combarnous，1983)，需要使用大治疗剂量以产生作 用。马科动物垂体提取物似乎可增加用于排卵的卵泡的数目，但排卵数目和获得的胚胎数 目似乎不总是与发育的卵泡数目相关(Scoggins et al.，2002)。马科动物CG已被证明在 母马中刺激动情周期过程中的卵泡发育和排卵的效应极小(如果有效应的话)，这可能是 由于它不能在动情周期过程中结合于卵巢组织(Stewart and Allen，1979)。为了在马科动物和其他物种中使用马科动物促性腺激素来提高生殖效率，获得纯 化的蛋白是必需的。现如今，马科动物促性腺激素的来源是血清(eCG-PMSG)和全垂体提取 物。获得足够量的这些天然激素用于这类工作是昂贵且困难的。无交叉污染的纯马科动物 垂体促性腺激素制品是不容易获得的。考虑到天然马科动物促性腺激素的动物间变异和N 联糖的电荷异质性的问题，生成相应重组型蛋白的能力将会产生组成更均质且可就质量和 生物活性进行标准化的促性腺激素。这类蛋白对于校准临床实验室测定是至关重要的，并 且对于交配繁殖管理(例如在用于自然交配繁殖和人工授精的过渡期和发情期母马中缩 短排卵时间)也是至关重要的。使用不同于从血清和垂体组织中提取的激素的重组体形式 可避免有引起朊病毒相关疾病倾向的病原体和试剂的共同污染。本领域需要安全性提高的治疗药物，用于增加马和牛的交配繁殖效率，这主要是 通过增加排卵，然后通过保持授精后母马和母牛的妊娠实现。

发明内容
本发明提供了一种促卵泡激素(FSH)类似物(特别是一种重组型马科动物FSH类 似物)，以及使用这类类似物提高马、牛和其他哺乳动物的生殖效率的方法。重组型马科动 物FSH(重组型eFSH或reFSH)可通过促进超数排卵、卵泡发育和胚胎产生不仅在马中而且 在其他物种中改善生殖。使用reFSH类似物来刺激卵泡发育和/或超数排卵提供了使用无 蛋白污染且无马科动物垂体提取物的不利LH活性的纯FSH产物的优势。本发明还提供了 一种产生生物学活性reFSH的可靠方法。重组型FSH类似物的亚基优选连接在一块以形成 单链FSH类似物。在一个实施方案中，本发明提供了一种在哺乳动物(优选有蹄类动物如马或牛) 中刺激卵泡发育或超数排卵的方法，包括给予所述动物有效剂量的重组型eFSH。在另一实 施方案中，以多次肌内注射给予所述重组型eFSH。优选地，所述重组型eFSH为单链重组型 eFSH。在一个实施方案中，本发明提供了一种单链重组型eFSH类似物，包含连接于马科动 物CTP连接体序列的eFSH β亚基，所述连接体序列又连接于eFSH α亚基。一种这类eFSH 类似物(FSHiBCTPa)的氨基酸和核苷酸序列显示于图1中。对于该类似物已经建立了基 于细胞的生物测定，并且已经开发了 ELISA。此外，已经实现了扩增表达和扩大表达。本发明提供了包含活性eFSH类似物(特别是单链重组型eFSH类似物)的生物活性组合物以及使用这类组合物的方法。这类活性重组型eFSH类似物产物有利于提高马科 动物和其他哺乳动物物种的生殖活性、超数排卵、卵泡发育和胚胎产生。重组型eFSH类似 物还可避免交叉感染问题，并且不会在处理动物中诱导强免疫反应。在一个实施方案中，eFSH类似物被用于增加有蹄类动物(特别是马和牛)的生殖 活性。具体而言，单链重组型eFSH类似物可用于刺激超数排卵，增加胚胎产生，并增加雌性 动物的生殖。给予eFSH以增加生殖，增加产生胚胎的数目或诱导超数排卵在许多物种中是 需要的，所述物种包括，但不限于，牛族动物(bovine)、绵羊、山羊、鹿、牦牛、水牛、野牛、羚 羊、瞪羚、麋鹿、驯鹿、麇、大角羊、长颈鹿、骆驼包括双峰驼和单峰骆、大羊驼、猪、马科动物、 羊驼和小羊驼。该方法可特别有效地增加马科动物和牛族动物的超数排卵、卵泡发育、胚胎 产生和妊娠。用于本发明的实施方案中的eFSH类似物纯度至少为95%，并优选为重组型多 肽。更优选地，所述eFSH类似物为生物学活性的单链重组型eFSH。本发明的一个实施方案提供了一种通过表达编码eFSH α和β亚基的DNA而制备 重组型eFSH类似物的方法。在一个实施方案中，一种单链重组型eFSH类似物被产生，其中 所述α亚基使用连接体肽共价连接于所述β亚基。天然FSH以分开的α和β亚基产生， 它们在动物体内非共价组装在一块。本发明的单链重组型eFSH具有高水平的表达和生物 活性；并且被认为体内效力和持续时间比天然eFSH有增加，这是因为所述α和β亚基不 必首先组装在一块且不会自由地相互解离。在一个实施方案中，重组型eFSH类似物(在本 文中命名为FSHi3 CTP α)为单链重组型eFSH类似物，其中将来自马科动物FSH的α和β 亚基使用马科动物绒毛膜促性腺激素羧端肽连接在一块。本文中使用的eFSH α和β亚基的氨基酸序列分别在SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中给出。编码这些氨基酸序列的DNA序列分别在SEQID NO 1和SEQ ID NO 2中给出，但 由于遗传密码的冗余另外的DNA序列也可编码相同的α和β亚基。应理解，只要不影响功 能，eFSH类似物与所提供的eFSH序列相比可以有小的氨基酸序列差异。另外，只要不影响 功能，eFSH类似物与所提供的eFSH序列相比可以有氨基酸插入或缺失。优选地，所述eFSH 类似物包含与SEQ ID NO 5和SEQID NO 6中提供的eFSH序列相差25或更少的氨基酸、更 优选10或更少的氨基酸、更优选5或更少的氨基酸的插入和缺失。在一个实施方案中，所述单链eFSH类似物具有的α和β亚基与SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO 6的马科动物FSH α和β亚基有至少80%的序列同一性。优选地，所述eFSH 类似物包含与SEQ ID NO 5有至少85%同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少85% 同源性的第二多肽。更优选地，所述第一多肽与SEQ ID NO 5有至少90%的同源性，且所 述第二多肽与SEQ ID NO 6有至少90%的同源性。甚至更优选地，所述第一多肽与SEQ ID NO 5有至少95%的同源性，且所述第二多肽与SEQ ID NO 6有至少95%的同源性。优选地，所述eFSH类似物为单链多肽，其中对应于所述α亚基的第一多肽和对应 于所述β亚基的第二多肽共价连接。共价连接是指，所述第一多肽直接或通过一个连接体 肽连接于所述第二多肽，其中所述连接体肽的一端连接于所述第一多肽，且所述连接体肽 的另一端连接于所述第二多肽。在重组型蛋白合成中能够连接于多肽的连接体肽在本领域 中是已知的，并且可以使用适宜于表达为所述eFSH类似物的一部分的任一连接体肽。优选 地，所述连接体肽具有大约10-50个氨基酸，更优选大约20-40个氨基酸。在一个实施方案 中，所述连接体序列为人CTP连接体序列，或者与所述马科动物CTP连接体具有至少90 %序列同源性的连接体序列。在另一实施方案中，所述肽连接体为马科动物绒毛膜促性腺激素 羧端肽(CTP)。应理解，所述α和β亚基的位置是可逆的，原因是所述eFSH类似物可以具 有构型(α亚基)_连接体亚基)或(β亚基)_连接体亚基)。在一个实施方 案中，编码所述eFSH类似物的核酸分子被整合进入表达载体中，所述表达载体被转染至能 够表达该载体的细胞或细胞系中。在一个实施方案中，eFSH类似物被用于产生超数排卵事件，这会导致活胚胎的回 收。在另一实施方案中，eFSH类似物被用于增加卵泡发育或胚胎产生。诱导超数排卵和增 加胚胎产生可用于胚胎移植和体外受精。在一个实施方案中，将有效量的eFSH类似物给予 一只或多只有蹄类动物(优选马科动物或牛族动物)，以增加生殖。在本发明中，对于每一 个动情周期，可以将所述单链重组型eFSH作为单剂量或多剂量持续数日给予所述动物。在 一个实施方案中，每日给予所述重组型eFSH持续大约2-10天，优选大约4_9天，更优选大 约5-8天。可每日将单剂量的所述重组型eFSH给予所述动物，或者每日给予两个或多个剂 量，例如以6小时、8小时或12小时的间隔。在一个实施方案中，将单个日剂量或多个日剂 量给予所述动物，但以与类似FSH类似物治疗更小的量。这可归因于所述单链FSH类似物 的活性提高和持续时间延长。在一个实施方案中，排卵后大约6-16天，优选排卵后约8-约14天将所述eFSH类 似物给予所述动物。所述eFSH类似物可作为每日单个肌内注射或者每日多个注射给予。对 动物进行发情迹象校验，然后通过自然授精或人工授精进行交配繁殖。在另一实施方案中， 授精发生在最后一次给予所述eFSH后大约2-8天，优选4_6天。在又一个实施方案中，在 发情后大约6-8天冲洗所述胚胎，供后续使用。除所述eFSH类似物外，还任选给予另外的激素例如黄体生成素、绒毛膜促性腺激 素和前列腺素。在一个实施方案中，除给予所述动物所述重组型eFSH类似物外，还给予前 列腺素。前列腺素任选地作为单剂量给予(一般通过注射)，或者作为多剂量间隔数个小时 给予。在一个实施方案中，在给予所述eFSH类似物后给予所述动物第一剂量的前列腺素， 然后将第二剂量的前列腺素在所述第一前列腺素剂量给药后大约6小时至1天给予所述动 物。在一个实施方案中，给予所述动物的每个剂量的eFSH类似物为约0. 01 μ g-约 5mg。优选将约1. 0 μ g-约0. 2mg的eFSH类似物给予所述动物，更优选约200 μ g-约0. Img， 甚至更优选约500 μ g-约850 μ g。可以使用本领域中已知的任一方式给予所述eFSH类似 物，所述方式包括但不限于肌内注射和静脉内注射。优选通过肌内注射给予所述eFSH类似 物。另一实施方案提供了一种用于在哺乳动物例如马科动物或牛族动物的单个动情 周期中诱导超数排卵、卵泡发育或者增加胚胎数目的试剂盒，包含至少一个剂量的包含有 效量的单链重组型eFSH类似物，所述单链重组型eFSH类似物包含与SEQ ID NO 5有至少 95%同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少95%同源性的第二多肽，其中所述第一和 第二多肽共价连接；用于给予一个剂量的eFSH类似物的装置；用于给予所述剂量的eFSH 类似物的说明书。在另一实施方案中，所述试剂盒包含两个或更多个剂量的包含有效量 的单链重组型eFSH。在一个实施方案中，每一剂量中eFSH类似物的有效量为约1 μ g_约 0. 2mg,更优选约200 μ g-约0. Img,甚至更优选约500 μ g-约850 μ g，并且可随试剂盒而不同。用于将所述剂量给予所述动物的装置可以是本领域中已知的任一装置，例如针头和注 射器。任选地，所述装置可以是适宜于送递单个剂量的eFSH类似物的注射装置。所述试剂 盒还可以包含诸如另外的激素(如前列腺素)的组分，以及用于送递另外的激素的注射装置。在一个实施方案中，本发明的组合物在一种药物制剂中含有本文描述的蛋白组合 物，例如eFSH组合物。在另一实施方案中，本发明提供了一种合成本发明的组合物或其 药物制剂的方法。所述药物制剂包含一种或多种赋形剂、载体和/或本领域中了解的其 他组分。优选地，所述组分符合美国国家处方集(the National Formulary) ( “NF”)、美 国药典(United States Pharmacopoeia) ( “USP”)或药物制造制剂手册(Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations)之标准。在一个实施方案中，本发明的组 合物的有效量可以为治疗有效量。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗医疗病 症的方法，包括给予需要其的受试者治疗有效量的本发明的组合物。在一个实施方案中， 本发明提供了一种药剂，所述药剂包含治疗有效量的一种或多种本发明的组合物。在一个 实施方案中，本发明提供了一种制备用于某一目的或者用于治疗本文所述病症的药剂的方 法。不希望拘囿于任何具体理论，本文对本发明相关基本原理或机制的意见或认识进 行了讨论。应认识到不管任何解释或假设最后是否正确，本发明的实施方案都是可实施的 和可用的。


图1示出本发明的单链重组型eFSH类似物(FSH β CTP α)的氨基酸和DNA序列， 其中所述β亚基和α亚基使用马科动物CTP (下划线)共价连接至一块。图2为图1的eFSH类似物的示意图，其中所述α和β亚基使用0联寡糖(交叉 阴影线框)连接在一块，所述亚基串联排列，使得所述β亚基位于所述α亚基的N末端， 从而形成单链eFSH分子。图3所示的SDS-Page示出使用本发明的方法产生的FSH β CTP α为单个45kDa斑点。图4的图为在CHO-hFSHR测定中比较FSH β CTP α (在图中标识为APNB eFSH) 和天然eFSH(纯化的垂体提取物，Bioniche Animal Health)的体外生物活性。如图4中 所示，所述单链重组型eFSH类似物具有约等于或大于所述天然eFSH的生物活性，特别是在 较低剂量时。图5的图为比较以多种剂量的天然eFSH(来自纯化的垂体提取物)和FSH β CTP α孵育马科动物生精小管的用过培养基(spent medium)中的雌二醇浓度。观察到重组型 eFSH类似物有显著的剂量反应。在50ng/ml时，FSH^CTPa的剂量反应大于天然eFSH的 剂量反应。
具体实施例方式本文中使用的“交配繁殖”是指本领域中已知的与使雌性动物怀孕有关的方法。这 类方法包括自然授精和人工授精。交配繁殖方法可包括在出现动情行为后或者在强加动情后的等待时间(waiting time)。本文使用的“动情”是指动物最可能受孕的时期。本文使用的“强加动情”是指本 领域中已知的用于加强发情的方法。如果适合，加强动情可包括等待期(waiting period) 0 本文使用的“动情行为”是指动物正处于发情中的行为表现，包括出现持续发情(standing heat)ο“母马”是指雌性马科动物，“种马”是指雄性马科动物。本文使用的“母牛”是指 雌性牛族动物，包括小母牛。本文使用的“增加生殖活性”和“增加生殖效率”是指增加雌性动物怀孕并最终产 生存活胚胎或活后代的可能性。这一点可通过增加授精雌性动物怀孕的可能性，增加怀孕 动物产生一个或多个存活胚胎的可能性，以及/或者增加妊娠维持的可能性来实现。本文使用的“排卵同步化”是指这样的方法，即通过该方法强制一组动物排卵，使 得每只动物都可能在2-4天的窗口期内排卵。本文使用的“动情同步化”是指这样的方法， 即通过该方法强制一组动物动情，使得每只动物可能在2-5天的窗口期内处于动情。本文 使用的“动情预同步化”或“排卵预同步化”是指这样的方法，即通过该方法使动情周期 (经常是对于一组动物)被阻断或被强制处于所述周期的一具体阶段，使得随后进行的动 情同步化步骤或排卵同步化步骤更加成功。本文使用的“怀孕哺乳动物”是指目前已孕哺乳动物，还包括已授精且有可能怀孕 的哺乳动物，或者指其中一些有可能怀孕的多只已授精哺乳动物。本文使用的“授精”是指 通过本领域中已知的任一方法导入精液，包括但不限于自然授精和人工授精。本文使用的“保持妊娠”是指增加已授精动物妊娠检测呈阳性或分娩活后代的可 能性，或者增加多只已授精动物妊娠检测呈阳性或分娩活后代的可能性。“妊娠被保持”是 指动物在当时保持怀孕，并且胚胎未失去。本文使用的“有效量”是指有效产生所需结果的eFSH类似物的量。本文使用的“给予”是指本领域中已知的将治疗药物给予动物的任一方法。给予 的实例包括但不限于，皮下、肌内和静脉内注射所述治疗药物。本文使用的“治疗药物”是指用于治疗、改变或改善生理状况的任何药物、激素、类 似物或化合物。在本发明中，所述生理状况是那些与生殖(如排卵和保持妊娠)有关的生 理状况。本文使用的“类似物”是指模拟天然化合物生理效应的化合物。类似物一般在结 构上类似于天然化合物，但可具有结构或化学差异，所述差异是由于生产方法所致，或者由 于这些差异赋予所述类似物有利活性。eFSH类似物为结构上类似于天然eFSH并且有天然 eFSH功能的组合物。本文使用的有关纯度的语句如“约95%的纯度”是指通过本领域中已知的任何方 法测量的纯度，所述方法包括但不限于蛋白质电泳。本文使用的有关氨基酸和DNA的序列 同源性的语句如“95%或更高的同源性”是指本领域中理解并实施的序列比较。本发明的一个实施方案涵盖一种单链重组型eFSH类似物，所述类似物具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO 8的氨基酸序列有90%或更高，优选95%或更高的 同源性的氨基酸序列。另一实施方案是一种编码这样的单链氨基酸的核酸或包含这类核酸的载体，该单链氨基酸与SEQ ID NO 8的氨基酸序列有90%或更高，优选95%或更高的同 源性。另一个实施方案为一种编码这样的单链氨基酸的核酸或包含这类核酸的载体，所述 单链氨基酸具有与SEQ ID NO 5有90%或更高同源性，优选95%或更高同源性的第一多 肽，以及与SEQ ID NO 6有90%或更高同源性，优选95%或更高同源性的第二多肽。还涵 盖由SEQ ID NO 8中提供的核苷酸序列片段所编码的功能性单链重组型eFSH类似物。实施例1-单链重组型eFSH的设计和体外活件为了构建单链重组型eFSH，通过使用重叠PCR诱变法将编码α亚基的核苷酸 序列插入至阅读框内eFSH β亚基的3’端。如图2中所示，将携带0联寡糖的羧端肽用 作连接体(交叉阴影线框)，所述亚基串联排列，使得所述β亚基位于所述α亚基的N 末端。设计重组型eFSH的这种方法类似于设计人绒毛膜促性腺激素(hCG)类似物的方 法(Sugahara et al. (1995)Proc Natl Acad Sci U S A 1995 ；92 2041-2045 ；Narayan et al. (1995) “Functional expression of yoked human chorionic gonadotropin in baculovirus-infected insect cells,"Mol Endocrinol 9:1720-1726)。将所述单链构建体插入至载体中，并转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，形成分 离且纯化的单链eFSH多肽。FSH β CTP α ——种具有SEQ ID NO 8的序列并由该方法产生 的单链重组型eFSH类似物——的SDS-Page在图3中显示为明显的45kDa斑点。在CHO-hFSHR测定中将FSH0 CTP α与天然eFSH(纯化的垂体提取物，Bioniche Animal Health)的体外生物活性相比较。如图4中所示，FSHβ CTP α (在图中标识为APNB eFSH)具有大约等于或高于天然eFSH的生物活性，特别是在较低剂量时(低于0. 25ng/ ml)。另外，图5比较了以多种剂量(η = 9)的天然eFSH和FSHi3 CTP α孵育的马科动物生 精小管的用过培养基中的雌二醇浓度。观察到FSHiBCTPa有显著的剂量反应，在50ng/ml 时，FSHi3 CTP α的剂量反应大于天然eFSH的剂量反应(ρ < 0. 05)。实施例2-单链重组型eFSH在处于动情周期中的母马中的有效性在处于动情周期中的母马中进一步测试了 FSHiBCTPa的体内有效性。将年 龄为6-16岁的15只母马圈养于室外围场中，并在排卵前数日给予孕酮，排卵日被记作 第0日。然后以孕酮和雌二醇处理所述母马，以抑制以后的促性腺激素和卵巢活性。在 不再给予孕酮和雌二醇处理后，所述母马的动情周期恢复。使用孕酮和雌二醇来控制 动情周期和排卵在本领域中是公知的(Loy et al. (1981) "Control of ovulation in cycling mares with ovarian steroids and prostaglandin ；，，Theriogenology 15: 191-200 ；Varner et al. (1988) "Estrogens, oxytocinand ergot alkaloids-Uses in reproductive management of mares ； "Proc.Am.Assoc. Equine. Pract. ,219-241 ； Lofstedt,R. Μ. (1988) “Control of the estrous cycle of the mare ； "The Veterinary Clinics of North America-Equine Practice，189—190)。将所述15只母马分成3个处理组，每组5只母马，一组给以500 μ g的reFSH类似 物(FSH β CTP α), 一组给以850 μ g的reFSH类似物(FSH β CTP α), 一组给以Iml盐水 溶液(对照组)。在排卵后第8-14天，每天两次(每日两次或BID)给予所述重组型eFSH 类似物或盐水溶液。在排卵后将所述动物交配繁殖大约16-22天(在最后一次重组型eFSH 给药后大约2-8天)，并检查妊娠情况。所述处理对卵泡生长的效应显示于表1中，对卵泡 数目、排卵和妊娠的效应显示于表2中。
表1-处理后卵泡的生长 a’b具有不同上标的行中数值有差异(ρ < 0. 05)表2-卵泡数目、排卵和妊娠情况 a从首次排卵前12小时到末次排卵后12小时的超声检查周期检测的数目。b’e具有不同上标的行中数值有差异(ρ < 0. 05)。如上表中所示，所述重组型eFSH类似物在两个剂量(850 μ g和500 μ g)下都呈现 体内活性，这表现为每只母马卵泡数目和排卵数目增加，以及在不再给予孕酮和雌二醇处 理后达到35mm卵泡大小所需时间减少。实施例3-单链重组型eFSH对超数排卵的有效件在该实验中，向年龄3-13岁的20只处于正常动情周期中的母马给予天然FSH(纯 化的垂体提取物)或单链重组型eFSH。在排卵后第5天经直肠超声检查术检查所述母马。 如果最大卵泡直径< 25mm，将这些母马随机分配于4个处理组的一个中，并给予eFSH类似 物(FSH β CTP α )A 组每天两次 12. 5mg Bioniche eFSH(阳性对照组，η = 5)B 组每天两次 500 μ g 重组型 eFSH (FSH β CTP α ) (η = 5)C 组每天一次 850 μ g 重组型 eFSH (FSH β CTP α ) (η = 5)
D 组每天两次 850 μ g 重组型 eFSH (FSH β CTP α ) (η = 5)在处理第二天的黄昏时对所有母马给以IOmg地诺前列素(前列腺素)，并继续处 理直至同组卵泡直径达到32-35mm。在最后一次FSH处理后约38小时，向所述母马给以 1. 5mg重组型eLH以诱导排卵。FSH处理的平均天数是6. 6 (A组)、7. 2 (B组)、8. 0 (C组)和6. 0 (D组)。在给予 reLH时直径> 35mm的卵泡数目分别为3. 2,3. 2,3. 0和4. 2。对同样这些组检测的排卵数 目为3. 8,3. 2、5. 4和3. 4。对于同样这些组，排卵时剩余的直径> 35mm的卵泡数目为0. 8、 1.6、0. 6和2. 6。这些结果总结于如下表3中。表 3 这些结果表明，reFSH在处于自然动情周期中的母马中具有体内生物活性，并且可 被用作刺激卵泡发育/超数排卵的工具。所有重组型eFSH(FSHi3 CTP α )组都刺激了卵泡 发育并产生了多个存活胚胎。对于测量的所有参数，所述reFSH处理组的值都至少与阳性 对照组(纯化的垂体eFSH) —样有效。每天给予两次(bid) 850 μ greFSH剂量造成了对卵泡发育的过度刺激。在多数排 卵被检测到后，对来自该组的母马继续进行数天卵泡刺激。尽管被过度刺激但仍可产生存 活胚胎，然而该效应被发现不及其他reFSH组中的程度。因此，在实际应用中可优选每天两 次给予500 μ g。每天两次注射和每天单次注射(sid)的混合方案也可能是有效的。出于清楚理解之目的，已经通过示例和实施例的方式全面地描述了本发明的一些 细节，本领域普通技术人员应清楚，在不影响本发明或其任一具体实施方案的情况下，通过 在一个宽且等价的范围内修改或改变本发明的条件、制剂和其他参数同样可实现本发明， 并且这类修改或改变意欲被涵盖在所随附的权利要求书的范围内。如果一组材料、组合物、组分或化合物在本文中被公开，那么应理解，这些组及其 所有亚组的所有个体成员都分别被公开。如果Markush组或其他分组被用于本文中，那么 所述组的所有单个成员以及所述组可能的所有组合和亚组合都意欲被分别地包括在本公 开中。除非另外声明，本文中描述或示例的组分的每种制剂或结合物均可用于实施本发明。 只要本说明书给出一个范围，如温度范围、时间范围或组分范围，则该公开内容中意欲包括 所有的居间范围和子范围以及所述范围内包括的所有单个值。此外，给定范围的端点被包 括在其范围内。在本公开内容和权利要求书中，“和/或”是指额外地或选择地。而且，任何 以单数使用的术语也包括复数形式。本领域普通技术人员将会清楚的是，除了在本文中具体示例的以外，起始材料、试 剂、纯化方法、材料、底物、设备元件、分析方法、测定方法、组分的混合物和结合物还可用于实施本发明，而不需借助于过度实验。本发明意欲包括任一这类材料和方法的所有本领域 已知功能等效物。所使用的术语和表述用于描述而不作为限制，并且这些术语和表述的使 用并不意欲排除所显示和描述的特征或其部分的任何等效物，但是应认识到在所要求保护 的本发明范围内可做多种修改。本文中示例性描述的发明可以适当地在不存在本文未具体 公开的任一种或多种元件、一个或多个限制的情况下实施。 本文中参考的所有出版物都通过引证的方式纳入本文，至不与本文矛盾的程度。 本文所提供的某些参考文献通过引证的方式被纳入本文以提供本发明的其他用途的详情。 本文提到的所有专利和公布文本代表了本发明所属领域的技术人员的技术水平。本文引 用的参考文献通过引证的方式全文纳入本文，以显示出到它们的申请日为止的现有技术状 态，而且如果需要，本文可意欲使用这一信息以排除处于现有技术中的具体实施方案。例 如，如果本发明要求保护一种化合物，那么应理解该权利要求意欲不包括本领域的已知化 合物，所述已知化合物含本文公开的参考文献中公开的化合物。
权利要求
一种马科动物促卵泡激素(eFSH)类似物，包含与SEQ ID NO5有至少90％同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少90％同源性的第二多肽，其中所述第一和第二多肽共价连接。
2.权利要求1的eFSH类似物，还包含一个连接体肽，其中所述连接体肽的一个末端连 结于所述第一多肽，且所述连接体肽的另一个末端连接于所述第二多肽。
3.权利要求1的eFSH类似物，其中所述连接体肽为马科动物绒毛膜促性腺激素羧端肽 (CTP)。
4.权利要求1的eFSH类似物，其中所述第一多肽与SEQID N05有至少95%的同源性。
5.权利要求1的eFSH类似物，其中所述第二多肽与SEQID N06有至少95%的同源性。
6.权利要求1的eFSH类似物，与SEQID NO 8有至少95%的同源性。
7.权利要求1的eFSH类似物，其中所述类似物为一种单链重组型多肽。
8.一种编码权利要求7的eFSH类似物的核酸分子。
9.一种包含权利要求8的核酸分子的载体。
10.一种能够表达权利要求9的载体的细胞系。
11.一种在一只或多只有蹄类动物中增加生殖活性的方法，包括将有效量的eFSH类似 物给予所述一只或多只有蹄类动物，其中所述eFSH类似物包含与SEQ ID NO 5有至少90% 同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少90%同源性的第二多肽，其中所述第一和第二 多肽共价连接。
12.权利要求11的方法，其中所述有蹄类动物为马科动物。
13.权利要求11的方法，其中在排卵后6-16天给予所述有效量。
14.权利要求11的方法，还包括在给予所述eFSH类似物后2-8天对所述一只或多只有 蹄类动物授精。
15.权利要求11的方法，其中所述有效量为大约0.01μ g-大约5mg。
16.权利要求11的方法，其中所述有效量为大约500μ g-大约850 μ g。
17.权利要求11的方法，其中所述eFSH类似物为单链重组型多肽。
18.权利要求11的方法，其中所述eFSH类似物包含一个连接体肽，其中所述连接体肽 的一个末端连结于所述第一多肽，且所述连接体肽的另一个末端连接于所述第二多肽。
19.权利要求11的方法，其中所述eFSH类似物与SEQID NO 8有至少95%的同源性。
20.权利要求11的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的eFSH类似物每天给予每 只有蹄类动物，持续大约4-9天。
21.权利要求11的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的eFSH类似物每天给予每 只有蹄类动物，持续大约5-8天。
22.权利要求21的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的eFSH类似物每天两次给 予每只有蹄类动物，持续大约5-8天。
23.一种用于在牛族动物的单个动情周期中诱导超数排卵或者增加胚胎数目的试剂 盒，包含a)至少一个剂量的有效量的eFSH类似物，所述eFSH类似物包含与SEQ ID NO 5有至 少90%同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少90%同源性的第二多肽，其中所述第一 和第二多肽共价连接；2b)用于给予单剂量的所述eFSH类似物的装置；以及c)用于给予所述eFSH类似物的说明书。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述有效量为大约0.01 μ g-大约5mg。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述有效量为大约500μ g-大约850 μ g。
26.权利要求23的试剂盒，还包含至少一个剂量的前列腺素和用于给予所述前列腺素 的装置。
27.一种在一只或多只有蹄类动物中诱导超数排卵的方法，包括将有效量的eFSH类似 物给予所述一只或多只有蹄类动物，其中所述eFSH类似物包含与SEQ ID NO 5有至少90% 同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少90%同源性的第二多肽，其中所述第一和第二 多肽共价连接。
28.权利要求27的方法，其中所述有蹄类动物为马科动物。
29.权利要求27的方法，其中在排卵后6-16天给予所述有效量。
30.权利要求27的方法，还包括在给予所述eFSH类似物后2_8天对所述一只或多只有 蹄类动物授精。
31.权利要求27的方法，其中所述有效量为大约0.01 μ g-大约5mg。
32.权利要求27的方法，其中所述有效量为大约500μ g-大约850 μ g。
33.权利要求27的方法，其中所述eFSH类似物为单链重组型多肽。
34.权利要求27的方法，其中所述eFSH类似物包含一个连接体肽，其中所述连接体肽 的一个末端连结于所述第一多肽，且所述连接体肽的另一个末端连接于所述第二多肽。
35.权利要求27的方法，其中所述eFSH类似物与SEQID NO 8有至少95%的同源性。
36.权利要求27的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的所述eFSH类似物每天给 予每只有蹄类动物，持续大约5-8天。
37.权利要求36的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的所述eFSH类似物每天两 次给予每只有蹄类动物，持续大约5-8天。
38.一种在一只或多只有蹄类动物中增加胚胎产生的方法，包括将有效量的eFSH类似 物给予所述一只或多只有蹄类动物，其中所述eFSH类似物包含与SEQ ID NO 5有至少90% 同源性的第一多肽和与SEQ ID NO 6有至少90%同源性的第二多肽，其中所述第一和第二 多肽共价连接。
39.权利要求38的方法，其中所述有蹄类动物为马科动物。
40.权利要求38的方法，其中在排卵后6-16天给予所述有效量。
41.权利要求38的方法，还包括在给予所述eFSH类似物后2-8天对所述一只或多只有 蹄类动物授精。
42.权利要求38的方法，其中所述有效量为大约0.01 μ g-大约5mg。
43.权利要求38的方法，其中所述有效量为大约500μ g-大约850 μ g。
44.权利要求38的方法，其中所述eFSH类似物为单链重组型多肽。
45.权利要求38的方法，其中所述eFSH类似物包含一个连接体肽，其中所述连接体肽 的一个末端连结于所述第一多肽，且所述连接体肽的另一个末端连接于所述第二多肽。
46.权利要求38的方法，其中所述eFSH类似物与SEQID NO 8有至少95%的同源性。
47.权利要求38的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的eFSH类似物每天给予每只有蹄类动物，持续大约5-8天。
48.权利要求47的方法，其中在单个动情周期中将一个剂量的所述eFSH类似物每天两 次给予每只有蹄类动物，持续大约5-8天。
49.一种包含权利要求1的组合物的药物制剂。
全文摘要
本发明提供了产生生物学活性重组型eFSH类似物的方法，以及使用重组型eFSH类似物在哺乳动物特别是马科动物中增加生殖的方法。还提供了产生生物学活性单链重组型eFSH的方法。本发明的重组型eFSH类似物可增加马、牛和其他有蹄类动物的超数排卵、卵泡发育、胚胎发育和生殖效率。
文档编号A61K35/55GK101909642SQ200880123523
公开日2010年12月8日 申请日期2008年11月28日 优先权日2007年11月30日
发明者I·博伊姆, J·罗泽, K·尼斯温德, M·科金 申请人:阿斯彭生物制药有限公司