改进的重组人促卵泡激素的制作方法

专利名称：改进的重组人促卵泡激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及促性腺激素领域。特别地，提供了改进的重组人促卵泡激素(rhFSH)。这种改进的rhFSH可用于不育症的治疗，特别是用于人类患者。
背景技术：
促性腺激素是一组蛋白质激素，其调控雄性和雌性的性腺功能，因此在人类能育中起到重要作用。其是由脊椎动物脑垂体的促性腺细胞在受到促性腺激素释放激素(GnRH)刺激后分泌的。促性腺激素为异二聚体糖蛋白，包括促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)及绒毛促性腺激素(CG)。这些促性腺激素具有相同的α-亚基，但包含不同的β_亚基，后者能确保其的受体结合特异性。FSH包含一个92个氨基酸的α -亚基以及一个111个氨基酸的β-亚基，后者赋予其对FSH受体的特异性结合。所述天然蛋白质的两个亚基都受到糖基化修饰。α-亚基在Asn52和Asn78处而β -亚基在Asn7和Asn24处进行天然糖基化。在细胞中两种亚基都是以前体蛋白质产生然后加工并分泌的。FSH调控身体的发育、生长、青春期成熟及生殖过程。特别地，其刺激生殖细胞的成熟并因此参与精子发生及卵泡发生。卵泡发生是由FSH诱导的，例如通过FSH对粒层细胞表面上的FSH受体的结合。FSH受体为G蛋白偶联受体，其在FSH结合时激活偶联的G蛋白。然后所述G蛋白进而激活腺苷酸环化酶，导致cAMP——种二级信使分子的产生。细胞中cAMP浓度的增加激活数种下游靶标，特别是cAMP依赖的蛋白质激酶，后者然后引起黄体酮和雌激素的合成。黄体酮和雌激素是由粒层细胞分泌的，诱导卵泡发生。在粒层细胞受到FSH刺激时，其还释放抑制素-B，这形成了一个负反馈 环，从而抑制垂体中FSH的产生和分泌。已有显示抑制素B为很好替代标记物，提示有FSH造成的卵巢刺激。FSH在对不育症的治疗中有广泛使用，可以单独或与其他试剂(特别是LH)组合使用。在本领域中，通用已经使用了纯化自绝经期后人尿液的FSH (尿FSH)或由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组产生的FSH用于人类治疗。然而，由于存在不同异构体，所以有极大的与不同FSH制备相关的异质性。个体FSH异构体显示相同的氨基酸序列，但在其糖基化程度和本质上有差异。具体的异构体的特征在于碳水化合物支链结构的异质性以及不同量的唾液酸(一种带负电的末端单糖单元)，这二者都影响了异构体的特异生物活性。因此，FSH的糖基化形式对其生物学活性有显著的影响。然而，来自不同供体和不同制备物的尿液FSH在其碳水化合物结构上有显著的变化，形成高度的批-批变化。考虑到尿液制品中病毒的存在，还存在安全问题。进一步地，获自CHO细胞的FSH显示的糖基化形式特异于这些仓鼠细胞，这与人类糖基化形式不相同。这些差异导致所获得的FSH有变化的生物学活性及副作用，因此要施用于患者的药用制备物也具有这些性质。鉴于此，本发明的一个目标就是提供改进的FSH制备物。进一步地，本发明的一个目标是提供具有新型治疗或药用特征的FSH制备物。进一步地，本发明的一个目标是提供具有改进的糖基化形式的FSH制备物。
发明概述本发明人已经发现获自人类细胞的改进的FSH制备物(优选地，是以优化的糖基化水平选择的制备物)能够以比对应的获自人尿液或CHO细胞的FSH制备物更低的浓度诱导性类固醇如雌激素和黄体酮的分泌。因此，根据本发明的FSH制备物具有可用于治疗的惊人的特征。本发明在第一方面提供了重组的FSH制备物，其中制备物中的重组FSH具有的糖基化形式包含一种或多种以下特征(i)携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20%;(ii)携带果糖的聚糖的相对量为至少30%;和/或(iii) 2，6-偶联唾液酸的相对量为至少30% ;和/或(iv)其为多样的糖基化形式。在第二方面，本发明提供了重组FSH制备物，其可通过在人类细胞或人类细胞系中生产而获得，特别是细胞系GT-5s (DSM ACC3078,保藏于2010年7月28日)。据发现在各细胞系中产生的FSH产生了改进的糖基化谱，如上文和下文所描述的。还提供了一种药用组合物，其包含根据本发明的重组FSH。进一步地，本发明涉及根据本发明的重组FSH制备物或药用组合物，用于治疗不育症。进一步地，本发明涉及根据本发明的重组FSH制备物或药用组合物，用于不依赖于cAMP而诱导和/或刺激性类固醇的分泌。一些实验显示根据本发明的FSH的低浓度效应在特定环境中不依赖于靶标细胞中的cAMP信号传导。因此，这些实验表明根据本发明的改进的FSH制备物可在一定浓度下诱导性类固醇如黄体酮的分泌而不增加cAMP的分泌。因此，认为根据本发明的改进的FSH制备物的特定实施方式能够诱导信号转导通路而导致性类固醇的分泌，所述通路不同于对通常使用的FSH制备物所描述的使用cAMP作为第二信使的已知信号转导通路。进一步地，本发明涉及根据本发明的重组FSH制备物或药用组合物用于通过不依赖于cAMP信号的生物学过程刺激或共刺激生殖细胞的成熟。进一步地，本发明涉及根据本发明的重组FSH制备物或药用组合物用于诱导和/或刺激性类固醇的分泌的用途，在这些FSH浓度下不会诱导显著的cAMP释放。本发明的其他目标、特征、优势及方面通过以下描述及附随的权利要求对本领域技术人员变得明显。然而，要理解的是以下描述、附随的权利要求及指出本应用优选的实施方式的特异实施例都只是以示例说明的方式给出。在阅读下文后，本领域技术人员会容易理解在所公开的发明的精神和范围内的多种变化和修饰。发明详述定义如本文所使用的，以下词语通常优选地具有下文提出的意义，除非其使用的上下文中另有指出。如本文所使用的，词语“包含”除了其常规意义外还包括并特异性指代词语“基本上由……组成”及“由…… 组成”。因此，词语“包含”指的是这样的实施方式，其中“包含”特异性列出的元素的主题物质不包含其他元素，还包括这样的实施方式，其中“包含”特异性列出的元素的主体物质可能和/或确实包含其他元素。术语“FSH”指的是促卵泡激素，一种促性腺激素。FSH为一种糖蛋白，其包含两个亚基的糖蛋白，标记为α和β亚基。优选地，FSH为人类FSH，特别是由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的α亚基和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的β亚基组成的人类FSH。然而，在其中一个或两个亚基中可能存在一个或多个，如I个、I或2个、多至3个、多至5个、多至10个或多至20个氨基酸的置换、添加和/或删除。优选地，α亚基的氨基酸序列与根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列共有的整体同源性或同一性为至少80%、更优选地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。进一步地，β亚基的氨基酸序列与根据SEQ ID NO: 2的氨基酸序列共有的整体同源性或相同性优选为至少80%、更优选地至少85%、至少90%、至少95%或至少98%。所述FSH的亚基优选地为两条分离的多肽链，然而，如本文所使用的，术语“FSH”还包括这样的实施方式，其中这两个亚基共价地彼此相连，例如通过交联试剂或连接多肽链，还包括这样的实施方式，其中一个或两个亚基被进一步划分为数条多肽链。优选地，根据本发明的FSH能够结合及/或激活FSH受体，优选地为人类FSH受体。如本文所使用的，术语“FSH”具体指代制备物中的所有FSH蛋白质。因此，术语“FSH”具体指代FSH制备物或组合物中所有FSH蛋白质的全体。
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优选地，所述FSH蛋白质的两个亚基都包含一个或多个连接于多肽链的碳水化合物结构。更优选地，这些碳水化合物结构是连接于这些亚基的天冬氨酸残基上的。在尤其优选的实施方式中，ct亚基包含两个碳水化合物结构,分别连接于Asn52和Asn78,而/或β亚基含两个碳水化合物结构，分别连接于Asn7和Asn24。携带这些碳水化合物结构的氨基酸残基以相对于根据SEQ ID N0:1和2的相应α和β亚基的人类氨基酸序列的方式进行标注。人类FSH的糖部分优选地由果糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺和/或唾液酸构成。根据本发明使用的FSH优选地为重组FSH，更优选地为重组人类FSH。术语“重组FSH”指的是FSH并非由活的人类或动物体天然产生并因此获自来源于其的样品，如尿液、血液或其他体液、排泄物或人类或动物体的组织。优选地，重组FSH获自经过生物技术工程改造的细胞，特别是以编码FSH或者FSH的α或β亚基的核酸转化或转染的细胞。根据优选的实施方式，重组FSH获自包含编码FSH的外源核酸的人类细胞。相应的外源核酸可例如通过使用一种或多种表达载体而引入，其可例如经由转染而引入宿主细胞。用于重组产生蛋白质和FSH的相应方法在在先技术中已熟知，无需其他描述。根据本发明的FSH优选地为FSH，更优选地为人类FSH，可通过在人类细胞，优选地为人类细胞系中产生而获得。所述人类细胞系优选地来源于人类血细胞，特别是髓细胞系，优选地为髓性白血病细胞系。所述细胞系优选地是永生化的。在一个优选的实施方式中，用于产生根据本发明的FSH的细胞系为细胞系GT-5s (其根据布达佩斯协议于2010年7月28日以登记号DSM ACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstraβ e7B, 38124Braunschweig(DE)),保藏人为 Glycotope GmbH, Robcrt-Rosslc-Str.10, 13125Berlin(DE))或来源于此的细胞系，或同源细胞系。GT-5s为一种永生化人类髓性白血病细胞系，能够提供如本文所描述的特异糖基化形式。根据本发明，术语“GT-5s”和“GT-5s细胞系”还包括来源于GT-5s的细胞或细胞系。来源于GT-5s的细胞系可例如通过随机或特异性地从GT-5s培养物中选择单一克隆或一组细胞而获得，任选地在之前已经对GT-5s细胞进行了增强突变率的处理，或通过遗传改变GT-5s细胞系而获得。所选择的克隆或一组细胞可进一步如上文所述的方法进行处理和/或可进行其他的筛选轮。同源于GT-5s的细胞系特别是永生化人类髓细胞系。优选地，来源于或同源于GT-5s的细胞系能够提供的FSH具有的糖基化形式类似于获自GT-5s的形式。优选地，由来源于或同源于GT-5s的细胞系产生的FSH具有一种或多种本文所描述的糖基化特征，特别是携带N-平分型乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20% ;和/或携带果糖的聚糖的相对量为至少30%;和/或2，6-偶联唾液酸的相对量为至少30% ;及/或多样的糖基化形式。根据一个实施方式，来源于或同源于GT-5s的细胞系能够表达具有如本文描述的优选糖基化形式的FSH，特别是选自表I的糖基化形式。由来源于或同源于GT-5s的细胞系产生的FSH的类似的糖基化形式优选地与获自GT-5s的FSH的糖基化形式在一种或多种，优选地为所有糖基化特性上的差异为20%或更少、更优选地为15%或更少、10%或更少或5%或更少，所述糖基化特性选自bisGlcNAc的相对量、唾液酸化聚糖的相对量、硫酸化聚糖的相对量、2，6-偶联唾液酸的相对量、果糖相对量、四天线型聚糖的相对量、携带半乳糖的聚糖支链相对量及Z数。进一步地，根据本发明的FSH优选地为FSH，更优选地为人类FSH，其具有一种或多种本文公开的特异性糖基化特征，优选地具有选自表I的糖基化形式。细胞系GT-5s以及由其来源的细胞系及与其同源的细胞系尤其有优势，因为其提供了非常稳定和均一的蛋白质生产，尤其是就FSH蛋白质而言。其具有很好的批次一致性，即，从不同生产运行中获得的或以不同规模和/或用不同培养步骤所产生的蛋白质及其糖基化形式是类似的。特别地，如本文所描述的多样的糖基化形式在使用这些细胞系表达FSH的不同生产运行中是高度可复制的。根据本发明的FSH是糖基化的，S卩，其是由一个或多个，优选地为四个连接于多肽链的寡糖修饰的。这些寡糖，即聚糖或碳水化合物可以为线性或分支的糖链，并且优选地为复合型N-连接寡糖链。根据寡糖的分支数，称为单_、二 _、三-或四天线型(或甚至五天线型)。单天线型寡糖是不分支的，而二 _、三-或四天线型寡糖分别具有一个、两个或三个分支。因此具有更多天线的糖蛋白具有更多的寡糖终点并可携带更多的功能性末端糖单元，如唾液酸。如本文所使用的，“至少三天线型”指的是具有至少3个天线的寡糖，包括三天线型、四天线型和五天线型寡 糖。如本文所使用的，“至少四天线型”指的是具有至少4个天线的寡糖，包括四天线型和五天线型寡糖。对于复合型N-聚糖，优选地认为平分型GIcNAc残基不是分支或天线，因此不加到FSH的天线之内。本文所指代的FSH的糖基化形式特别指的是根据本发明的FSH制备物中所有FSH蛋白质的整体糖基化形式。特别地，在糖基化形式中考虑到并反映了 FSH制备物中在FSH蛋白质中包含并由此连接于FSH多肽链的任何聚糖结构。术语“唾液酸”特别指代任何神经氨酸的N-或O-置换衍生物。其可指代5-N-乙酰神经氨酸或5-N-羟乙酰神经氨酸，但优选地仅仅指代5-N-乙酰神经氨酸。唾液酸，特别是5-N-乙酰神经氨酸，优选地通过2，3-或2，6-连接与碳水化合物链相连。优选地，本文描述的FSH制备物中存在有2，3-及2，6-偶联唾液酸二者。FSH的唾液酸化程度通常以Z数表示。Z数表示糖蛋白的聚糖结构上的相对负电荷。Z数是通过以下公式计算的Z=A1%*I+A2%*2+A3%*3+A4%*4
其中Al%为带-1电荷的聚糖的百分比，A2%为带_2电荷的聚糖的百分比，A3%为带-3电荷的聚糖的百分比，而A4%为带-4电荷的聚糖的百分比。这些百分比是相对连接于FSH的所有聚糖计算的，包括带电及不带电的聚糖。聚糖的的电荷可由聚糖中包含的任何带电的单糖单元或置换物提供，尤其是由唾液酸残基和/或硫酸基团和/或磷酸基团提供。由于FSH的聚糖的电荷通常只是通过其的唾液酸残基确定而FSH通常具有四个聚糖结构，所以Z数指示了 FSH上的唾液酸的量或FSH的酸性。然而，当FSH还包括显著量的硫酸聚糖时，Z数指示了唾液酸和硫酸基团的组合量。根据本发明，“聚糖的相对量”指代连接于FSH制备物或包含FSH的组合物中FSH糖蛋白的聚糖的特定百分比或百分比范围。特别地，聚糖的相对量指的是FSH蛋白质中包含并因此连接于FSH制备物或包含FSH的组合物的FSH多肽链的所有聚糖的特定百分比或百分比范围。100%的聚糖指的是分别连接于FSH制备物或包含FSH的组合物中的FSH糖蛋白的所有聚糖。例如，携带平分型GIcNAc的聚糖的相对量为60%指的是这样的FSH制备物，其中FSH蛋白质中包含并因此连接于所述FSH制备物中FSH多肽链的所有聚糖中的60%包含平分型GIcNAc残基，而FSH蛋白质中包含并因此连接于所述FSH制备物中FSH多肽链的所有聚糖中的40%不包含平分型GlcNAc残基。本文给出的数值，特别是特异糖基化特性的相对量优选地理解为近似数值。特别地，这些数值优选地可高出或低于多至10%，特别是高出或低于多至9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2% 或 1%。“FSH制备物”可为任何包含或由FSH构成的组合物或物质。其可为固态或液态形式，可包含FSH之外的其他成分。特别地，FSH制备物可为溶液，包含FSH及合适溶剂如水和/或乙醇，或为例如含有FSH的溶液冻干后获得的粉末。FSH制备物的合适实例为在细胞中表达FSH后获得的组合物，特别是在FSH的纯化之后，或包含FSH的药用组合物。FSH制备物可在FSH之外含有例如溶剂、稀释剂、辅料、稳定剂、防腐剂、盐、佐剂和/或表面活性剂。术语“FSH制备物”在本文使用的意义特别是“包含FSH的组合物”。这些术语优选地在本文以同义词使用。“2，6-偶联唾液酸的相对量”指代为2，6-偶联唾液酸的唾液酸的总量的特定百分比或百分比范围。因此2，6-偶联唾液酸的相对量为100%意味着所有唾液酸为2，6-偶联唾液酸。例如，2，6-偶联唾液酸的相对量为60%指的是这样的FSH制备物，其中FSH蛋白质中包含并因此连接于所述FSH制备物中FSH蛋白质的寡糖链的所有唾液酸中的60%是以2，6-连接而连接，而FSH蛋白质中包含并因此连接于所述FSH制备物中FSH蛋白质的寡糖链的所有唾液酸中的40%不是以2，6-连接而连接，而是经由2，3-连接或2，8-连接而连接·术语“多样糖基化形式”特别指的是制备物或组合物中FSH蛋白质的糖基化形式，这些糖基化形式包含多种不同的聚糖结构。不同的聚糖结构为寡糖结构在至少一个寡糖单元的存在/不存在、量和/或位置及/或至少一种化学修饰例如硫酸残基、乙酰残基等等上有差异。特定的“不同聚糖结构”优选地在其相对量为糖基化形式中聚糖结构总量的至少
O.02%、更优选地至少O. 03%、至少O. 05%、至少O. 07%、至少O. 1%、至少O. 15%、至少O. 2%、至少O. 25%、至少O. 3%或者至少O. 5%时只以这方面考虑。多样糖基化形式特别是包含至少5种不同聚糖结构的糖基化形式。优选地，多样糖基化形式包含至少7、更优选地至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55且最优选地至少60种不同的聚糖结构。多样糖基化形式特别还指代制备物或组合物中FSH的糖基化形式，所述糖基化形式包含比在相应制备物或组合物中获自CHO细胞的的FSH更多的不同聚糖结构。特别地，糖基化形式比获自CHO细胞的FSH包含的不同聚糖结构多至少10%、优选地至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%且最优选地至少100%。术语“核酸”包括单链和双链核酸及核糖核酸，以及脱氧核糖核酸。其可包含天然发生的及合成的核苷酸，也可天然或人工修饰，例如有甲基化、5’ -和/或3’ -帽化。术语“载体”在本文使用的是其最通用的意义，包含核酸的任何中间媒介物，其能使得所述核酸例如引入原核及/或真核宿主细胞，并在恰当的时候整合入宿主细胞的基因组中。此种类型的载体优选地在宿主细胞中复制和/或表达。载体优选地包含一种或多种选择标记物以选择包含所述载体的宿主细胞。合适的选择标记物为抗性基因，其为宿主细胞提供例如针对特异抗生素的抗性。其他合适的选择标记物为例如酶类基因如DHFR或GS。使得重组蛋白质(包括FSH)能够表达的载体以及能够使得重组蛋白质在宿主中以高产量表达的合适的表达盒及表达元件在在线技术中已熟知，也是商业可得的，因此无需在本文进行详细描述。术语“细胞”和“多个细胞”以及“细胞系”可交换使用，优选地指代一种或多种哺乳动物细胞，特别是人类细胞。该术语包括细胞的子代或细胞群体。本领域技术人员会认识到“多个细胞”包括单一细胞的子代，而由于天然、偶然、或认为突变和/或改变的原因，子代不必(在形态或总DNA互补物上)完全相同于起始亲本细胞。“细胞”优选地指代分离的细胞核/或培养的细胞，其没有并入活的人类或动物体。术语“患者”根据本发明指的是人类、非人灵长动物或其他动物，特别是哺乳动物如奶牛、马、猪、绵羊、山 羊、狗、猫或啮齿动物如小鼠和大鼠。在一个具体优选的实施方式中，患者为人类。在人类患者的情况下，FSH优选地为人类FSH。患者可以为雄性或雌性，优选地为雌性。术语“药用组合物”特别指代适合施用于人类或动物的组合物，即含有药用可接受组分的组合物。优选地，药用组合物包含活性化合物或盐或其原药，以及载体、稀释剂或药用辅料如缓冲液、防腐剂及张力调节剂。FSH的国际单位(IU)指的是人尿液FSH和LH的第四套国际标准(the fourthInternational Standard for Human Urinary FSH and LH) (Storring, P. L. &GainesDas, R. E. (2001) Journal of Endocrinology 171, 119-129)，是根据增广卵巢增重法(aaugmented ovarian weight gain method)石角定的(Steelman, S. L. &Pohley, F. M. (1953)Endocrinology53, 604-616)。根据本发明，术语“不育症治疗”指的是对人类或动物受试者生殖或能育性相关的功能不良或疾病的治疗。特别地，不育症治疗包括辅助生殖技术、排卵诱导、体外受精、宫腔内人工受精以及生殖细胞成熟如卵泡发生或精子发生的实现或改进。根据本发明，术语“其中未释放显著量的cAMP”或类似的词语特别指的是细胞或组织释放的cAMP的量占由以导致最大cAMP释放的浓度的FSH刺激后的细胞或组织获得的cAMP释放量的少于25%、优选地为少于20%、更优选地为少于15%、少于10%、少于7. 5%、少于5%或少于2. 5%。这些细胞或组织易感或敏感于FSH的刺激,如粒层细胞或睾丸支持细胞(Sertoli cell)。不依赖于FSH的cAMP释放，即在FSH不存在时也会发生的cAMP释放不应当在这一方面考虑。优选地，“释放显著量的cAMP”或“cAMP的显著释放”是高于FSH不存在时cAMP释放的任何cAMP释放，特别是在测量的不精确度之上的任何可检测的cAMP释放。用于测量cAMP释放的标准步骤在实施例中有所描述，可用于确定显著或不显著的cAMP释放。“cAMP的释放”指的是cAMP的细胞内释放及/或cAMP的细胞外释放或分泌，优选地只指代cAMP的分泌。cAMP指代环磷酸腺苷，其在细胞信号转导中起第二信使分子的作用。cAMP是由腺苷环化酶从ATP合成的。“不依赖cAMP信号传导”的生物学过程或信号转导途径优选地不涉及腺苷环化酶的活化。“性类固醇”，也称为性腺类固醇或性激素，特别指代与脊椎动物的雄激素和雌激素受体相互作用的类固醇激素。术语“性类固醇”包括雄性激素如合成代谢类固醇、雄烯二酮、脱氢表雄酮、二氢睾丸酮和睾丸酮；雌激素如雌二醇、雌三醇和雌素酮；以及黄体酮。优选地，性类固醇指代天然发生的性类固醇，更优选地指代天然人类性类固醇。根据本发明的优选的性类固醇为雌二醇和黄体酮，尤其是黄体酮。本发明根据一个方面基于的是一项发现，具有优化糖基化形式的改进的重组FSH制备物能够在低的不诱导显著cAMP释放的FSH浓度下诱导性类固醇如黄体酮的分泌。特别地，在此特定方面，根据本发明的改进的FSH在比通常所用的尿液FSH或获自CHO细胞的重组FSH低很多的浓度下诱导性类固醇分泌。因此，改进的FSH可以低很多的剂量施用，这减少了副作用的风险，并进一步降低了生产成本。进一步地，如果以可比的剂量施用，在此实施方式中改进的FSH比通常使用的FSH在患者体内提供更长久的活性，因为在施用一段很长的时间后只有很低浓度的FSH留存在循环系统中，但是根据本发明的这个实施方式的FSH仍然发挥其生物学活性并优选地刺激或共刺激生殖细胞成熟和/或释放性类固醇。此夕卜，在高浓度下，根据本发明的改进的FSH以及通常使用的尿液或来源于CHO的FSH显示出可比的效应。因此，相比于通常使用的FSH，剂量过大没有其他风险。进一步地，本发明者已经在猕猴中证明根据本发明的改进FSH与通常使用的尿液或来源于CHO的FSH相比具有类似甚至 较高的药学效应。这一点尤其意外，因为根据本发明的FSH在大鼠和猴中显示了比获自尿液或CHO细胞的常用FSH制备物更低的最大血清浓度(Cmax)及循环半衰期。虽然改进的FSH的生物可及性较低，但却具有类似或更高的药学效应，因此可以推论根据本发明的改进的FSH具有比尿液或CHO来源的FSH更高的特异性治疗活性。根据所获得的临床数据，根据本发明的改进的FSH在人类中比常用FSH制备物有显著更高的Cmax ;然而，改进的FSH的循环半衰期稍低却也是可比的。最意外的是，根据本发明的改进FSH制备物甚至在只施用了单次剂量之后都在人类中显示出治疗效应，特别是卵泡生长的效应。相反，以单次剂量施用常用FSH制备物后未观察到任何效应。因此，预期的是以所述改进的FSH可对患者进行更精确的治疗。特别地，有可能使用确切定时、定量的剂量治疗并改进患者的不育症，也可能不需要长期的连续治疗。因此，也减少了多胎妊娠的风险。总之，根据本发明的改进的FSH制备物更加有效。因此，可对患者施用较小的剂量，这引起更少的副作用，对患者更加方便也花费更少。进一步地，用改进的FSH可设计更特异和详细的剂量方案。进一步地，减少的半衰期可减少不期望的副作用并进一步使得治疗终止后FSH能更快从人体移除。不受此理论的约束，本发明的发明人推论根据本发明的FSH制备物的更高的特异性治疗活性是基于改进的糖基化形式。特别地，高量的平分型GIcNAc残基和/或高量的2，6-偶联唾液酸以及高量的硫酸化聚糖可产生高的活性。进一步地，根据本发明的FSH制备物还显示了更多样复杂的糖基化形式，意味着相比于例如来源于CHO细胞的常规FSH制备物，所述制备物中存在更多不同的聚糖结构。据相信，CHO来源的FSH只能在靶标细胞中激活单一的通路，而根据本发明的改进的FSH由于其由独特的糖基化形式，显然是经由多种不同通路发挥其生物学活性，产生增加的生物学应答。如本文实验数据所示，这些途径中有一些涉及cAMP信号传导，而其他的新型通路是不依赖于cAMP的。鉴于这些发现，本发明在第一个方面提供了 FSH制备物，其中制备物中的FSH具有的糖基化形式包含一种或多种以下特征⑴携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20%;(ii)携带果糖的聚糖的相对量为至少30%;和/或(iii) 2，6-偶联唾液酸的相对量为至少30% ;和/或(iv)其为多样的糖基化形式。在特定实施方式中，本发明提供了 FSH制备物，其中制备物中的FSH具有的糖基化形式包含一种或多种以下特征(i)携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少35%;(ii)携带果糖的聚 糖的相对量为至少60%;和/或(iii) 2，6-偶联唾液酸的相对量为至少30% ；优选地，所述FSH为重组FSH，因此其可通过宿主细胞中的重组生产而获得，后者优选地为人类宿主细胞。合适的提供相应糖基化形式的人宿主细胞随后有描述。优选地，所述糖基化形式包含特征(i)、(ii)和(iii)的至少两种(特别是特征
(i)和(ii)、(i)和(iii)、或(ii)和(iii))，更优选地包含全部特征(i)、(ii)和(iii)。进一步地，所述糖基化形式可进一步包含至少四天线型的聚糖，其相对量为至少15%，和/或携带一个或多个唾液酸残基的聚糖，其相对量为至少80%，和/或携带半乳糖的聚糖，其相对量为至少95%，和/或携带末端半乳糖单元的聚糖分支，其相对量为至少60%，和/或携带硫酸基团聚糖，其相对量为至少1%，优选地为至少2. 5%。所述末端半乳糖单元任选地进一步携带唾液酸残基。所述组合物中的重组FSH优选地具有Z数为至少200。携带bisGlcNAc的聚糖的相对量优选地为至少25%、至少27%、至少30%、至少35%、至少38%或至少40%。更优选地，其的范围为大约25%-大约60%，特别是大约35%-大约60%的范围或大约38%-大约50%的范围，或大约40%-大约45%的范围。根据一个实施方式，为大约42%。携带一个或多个唾液酸残基的聚糖的相对量优选地为至少83%、至少85%或至少88%，更优选地为大约85%-大约98%的范围或大约88%-大约95%的范围，最优选地为大约90%。Z数优选地为至少210、更优选地至少215、至少220、至少230或至少240。较高的Z数可例如通过在FSH制备物中富集酸性和/或负电FSH蛋白质而获得。优选地，至少四天线型聚糖的相对量为至少16%、至少17%、至少18%或至少19%、更优选地至少20%或至少21%。至少三天线型聚糖，特别是三-和四天线型聚糖的相对量优选地为至少25%、至少30%、至少35%或至少40%、更优选地至少45%、至少50%或至少55%。优选地，携带果糖的聚糖的相对量为至少35%、至少40%、至少50%、至少60%或至少70%、更优选地至少75%或至少78%。其可为大约70%-大约90%的范围，特别是大约75%-大约85%的范围。优选地，2，6-偶联的唾液酸的相对量为至少40%、至少45%、至少50%、至少53%、至少55%、至少60%或至少65%，特别是大约40%-大约99%的范围，优选地为大约40%-大约80%、大约50%-大约60%或大约53%-大约70%的范围。优选地，2，3-偶联唾液酸对2，6-偶联唾液酸的比率范围为大约1:10-大约7:3，更优选地为大约1:5_大约3:2或大约1:2_大约1:1，最优选地为大约2:3-大约1:1。在优选的实施方式中，2，6-偶联唾液酸的相对量超过2，3-偶联唾液酸的量。携带半乳糖的聚糖的相对量优选地为至少97%，最优选地为大约98%。优选地，携带半乳糖单元(任选地由唾液酸残基修饰)的聚糖分支的相对量为至少65%、更优选地至少70%或至少73%。其优选地范围为大约60%-大约95%，更优选地范围为大约70%-大约80%。优选地，携带硫酸基团的聚糖(硫酸聚糖)的相对量为至少1%、至少1. 5%、至少2%、至少2. 5%、至少3%或至少5%、更优选地至少7%、至少10%或至少12%。根据一个实施方式，携带硫酸基团的聚糖的相对量不超过50%，优选地不超过40%、35%、30%、25%或20%。在优选的实施方式中，制备物中的FSH具有多样糖基化形式，其中制备物中FSH包含至少45或优选地至少50种不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有制备物中FSH的聚糖结构总量的相对量为至少O. 05%。根据一个实施方式，制备物中FSH包含至少35或优选地至少40种不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有制备物中FSH的聚糖结构总量的相对量为至少O. 1% ;和/或制备物中FSH包含至少20或优选地至少25中不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有制备物中FSH的聚糖结构总量的相对量为至少
0.5%。在一个进一步的实施方式中，制备物中的FSH比相应制备物中获自CHO细胞的FSH包含的不同聚糖结构多至少40%，优选地至少50%，其中每种不同的聚糖结构具有相应制备物中FSH的聚糖结构总量的相对量为至少O. 05%,O. 1%或O. 5%。在优选的实施方式中，根据本发明的重组FSH制备物不包含N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)或可检测量的Neu Gc。进一步地，根据本发明的重组FSH制备物优选地还不含有Galili表位(Gal α I, 3-Gal结构)或可检测量的Galili表位。本发明特别提供了具有人类糖基化形式的FSH。由于这些糖基化特性，不存在诱导副作用的外源免疫原性非人结构，这意味着避免了已知由特定外源糖结构如免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal结构)(所述二者对于啮齿动物生产系统也是已知的)或其他结构如已知来自酵母系统的免疫原性高甘露糖结构引起的不期望的副作用或不利之处。在特定实施方式中，根据本发明的制备物中重组FSH的糖基化形式包含一种或多种，优选地包括全部的以下特征⑴携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量范围为大约25%-大约 50%;(ii)携带果糖的聚糖的相对量为至少35%;(iii) 2，6-偶联唾液酸的相对量为至少53%;(iv)携带一个或多个唾液酸的聚糖的相对量为至少88%;以及(V)至少四天线型聚糖的相对量为至少16%.在特定的优选实施方式中，根据本发明的重组FSH制备物具有下文表I中列出的糖基化形式之一表1:特异糖基化参数
权利要求
1.重组FSH制备物，其中制备物中的重组FSH具有的糖基化形式包含一种或多种以下特征 (i)携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量为至少20%;和/或 ( )携带果糖的聚糖的相对量为至少30%;和/或 (iii)2，6-偶联唾液酸的相对量为至少30% ;和/或 (iv)其为多样的糖基化形式。
2.根据权利要求1的重组FSH制备物，其中糖基化形式包括特征(i)、(ii)和(iii)中至少两项，优选地包括全部特征(i)、(ii)和(iii)。
3.重组FSH制备物，其可通过在人细胞系GT-5s或来源于其的细胞系或同源于其的细胞系中生产而获得。
4.根据权利要求1-3中任何一项的重组FSH制备物，其包含一种或多种以下特征 (a)糖基化形式包含携带一种或多种唾液酸残基的聚糖的相对量为至少85%; (b)糖基化形式包含至少四天线型聚糖的相对量为至少18%； (c)Z数为至少200; (d)其为人重组FSH;和/或 (e)其由人细胞系或人类细胞产生。
5.根据权利要求1-4中任何一项的重组FSH制备物，其中糖基化形式包含一种或多种以下特征 (i)携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量范围为大约25%-大约50%; (ii)至少四天线型聚糖的相对量为至少16%； (iii)携带果糖的聚糖的相对量为至少35%； (iv)2，6-偶联唾液酸相对量为至少53%; (v)携带一种或多种唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88%； (vi)Z数为至少220; (vii)携带半乳糖的聚糖的相对量为至少95%; (viii)携带任选地由唾液酸残基修饰的末端半乳糖单位的聚糖分支的相对量为至少60% ； (ix)携带硫酸基团的聚糖的相对量为至少3%; (x)其包含至少45种不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有的相对量为制备物中FSH的聚糖结构总量的至少O. 05% ； (xi)其包含至少35种不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有的相对量为制备物中FSH的聚糖结构总量的至少O. 1% ； (xiii)其包含至少20种不同的聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有的相对量为制备物中FSH的聚糖结构总量的至少O. 5% ;和/或 (xiv)其包含相比于对应制备物中获自CHO细胞的FSH多出至少40%的不同聚糖结构，其中每种不同的聚糖结构具有的相对量为相应制备物中FSH的聚糖结构总量的至少O.05%。
6.根据权利要求1-5中任何一项的重组FSH制备物，其中糖基化形式包含以下特征(i)携带平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相对量范围为大约25%-大约50%; (ii)至少四天线型聚糖的相对量为至少16%; (iii)携带果糖的聚糖的相对量为至少35%; (iv)2，6-偶联唾液酸的相对量范围为大约53%-大约99%;且 (v)携带一种或多种唾液酸残基的聚糖的相对量为至少88%。
7.根据权利要求1-6中任何一项的重组FSH制备物，其中制备物中的重组FSH具有根据表I中列出的任何一个实施方式的糖基化形式。
8.根据权利要求1-7中任何一项的重组FSH制备物，其中所述FSH能够 (a)以不释放显著量的cAMP的浓度；及/或 (b)通过诱导不依赖于cAMP信号传导的信号转导通路 刺激粒层细胞中黄体酮的释放。
9.根据权利要求1-8中任何一项的重组FSH制备物，其中所述FSH能够通过不依赖cAMP信号传导的生物学过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
10.根据权利要求1-9中任何一项的重组FSH制备物，其中FSH具有一种或多种以下可在粒层细胞测定中确定的特征 (a)其能够以低于诱导粒层细胞释放cAMP所需的最小浓度的浓度刺激粒层细胞中黄体酮的释放； (b)其能够以不诱导cAMP释放或诱导cAMP的释放低于10pmol/ml的FSH浓度刺激大约5*104-大约1*105粒层细胞/ml中释放至少200ng/ml的黄体酮； (c)其能够以低于人尿液FSH或产生于CHO细胞中的重组FSH(Gonal F)所需浓度的浓度刺激大约5*104-大约1*105粒层细胞/ml中释放至少100ng/ml的黄体酮；及/或 (d)其能够以人尿液FSH或产生于CHO细胞中的重组FSH(Gonal F)不产生相应的黄体酮释放的浓度刺激大约5*104-大约1*105粒层细胞/ml中释放至少100ng/ml的黄体酮。
11.根据权利要求1-9中任何一项的重组FSH制备物，其中FSH能够在单次剂量施用后诱导雌性人类中的卵泡生长，其中所述单次剂量优选地包含25-500IU FSH且优选地是肠道外施用的，特别是通过皮下注射而施用。
12.药用组合物，其包含根据权利要求1-11的重组FSH制备物。
13.根据权利要求1-11中任何一项的重组FSH制备物或根据权利要求12的药用组合物用于不育症治疗。
14.根据权利要求13的重组FSH制备物或药用组合物，其中要施用于患者的剂量使得患者循环系统中FSH浓度范围为大约O. 05-大约2IU/L，优选地为大约O.1-大约1IU/L。
15.根据权利要求1-11中任何一项的重组FSH制备物或根据权利要求12的药用组合物用于也不依赖cAMP而诱导和/或刺激性类固醇的分泌。
16.根据权利要求1-11中任何一项的重组FSH制备物或根据权利要求12的药用组合物用于通过不依赖cAMP信号传导的生物学过程刺激或共刺激生殖细胞成熟。
17.根据权利要求1-11的重组FSH制备物或根据权利要求12的药用组合物用于以不诱导显著cAMP释放的FSH浓度诱导和/或刺激性类固醇的分泌。
18.根据权利要求13-16中任何一项的重组FSH制备物或药用组合物用于不育症治疗，其中不育症的治疗包括辅助生殖技术、排卵诱导、体外受精例如通过胞浆内单精子注射的体外受精、配子输卵管内转移、宫腔内人工受精，对女性无卵障碍的治疗、对女性卵子成熟的严重激素缺陷障碍的治疗、对男性精子产生缺陷的治疗和/或对生殖细胞成熟如卵泡发生或精子发生的实现或改进，尤其是例如在体外受精刺激操作流程中和/或进行无卵障碍治疗时实现或改进女性卵泡成熟。
19.根据权利要求13-18中任何一项的重组FSH制备物或药用组合物，其中重组FSH制备物或药用组合物具有一种或多种以下特征 (i)其能够在仅施用单次剂量后诱导卵泡生长和/或卵子成熟'及/或 (ii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一种或多种中比获自人尿液及/或表达于CHO细胞中的FSH制备物具有更低的循环半衰期；及/或 (iii)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一种或多种中比获自人尿液及/或表达于CHO细胞中的FSH制备物具有更低的生物利用率；及/或 (iv)其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一种或多种中具有的治疗效力与获自人尿液及/或表达于CHO细胞中的FSH制备物类似或比其更高。
20.根据权利要求1-11中任何一项的重组FSH制备物或根据权利要求12的药用组合物用于诱导卵泡生长和/或卵子成熟的用途，及/或如权利要求13-19中任何一项限定的用途。
全文摘要
本发明涉及改进的FSH制备物，其能够以比通常使用的尿液FSH或获自CHO细胞的重组FSH低得多的浓度刺激性类固醇的释放，且其不依赖cAMP信号传导而起作用。这些改进的FSH制备物可用于不育症的治疗。
文档编号A61K38/24GK103068839SQ201180037096
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者S·戈勒兹, L·施特克尔 申请人:葛莱高托普有限公司