促卵泡激素的液体制剂的制作方法

专利名称：促卵泡激素的液体制剂的制作方法
促卵泡激素的液体制剂本发明涉及包含促卵泡激素多肽和作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇的液体药物 组合物。组合物还任选地包含一种或多种其他的可药用赋形剂。在一个实施方案中，组合 物含有作为抗氧化剂的甲硫氨酸。组合物表现出良好的储藏稳定性，并且特别用于其中促 卵泡激素制剂被视为有效疗法的病症和医学适应症的预防和治疗。促卵泡激素(FSH)由垂体前叶的促性腺激素细胞产生并释放到循环系统中。FSH 与促黄体激素(LH) —同控制女性的卵母细胞成熟和男性的精子发生。FSH和LH都属于由 2个非共价连接的由不同基因编码的α-和链组成的异源二聚体糖蛋白家族。α-和 β-链都是糖基化的。α-亚基由92个氨基酸残基组成，而β-亚基由111个氨基酸残基 组成，它们各自都有2个潜在的连接天冬酰胺的糖基化位点。 人FSH用于治疗不排卵的女性、用于刺激多卵泡发生(超数排卵)和用于例如 IVF、ICSI、GIFT或CIFT的辅助受孕的制剂。此外，人FSH用于刺激FSH生成量低或不产生 FSH的女性的卵泡成熟和用于刺激患有先天的或后天的低促性腺素性功能减退症的男性的 精子发生。直到20世纪80年代，人FSH的主要来源是从孕龄妇女的尿液分离出来的尿源 FSH0在20世纪90年代引入了高纯度的尿源FSH的进一步纯化的形式，并且最终从1998 年起开发出重组FSH并得到广泛应用。随着重组DNA技术的出现，在被编码α-和β-链 的核酸序列转染的细胞培养物中生产人FSH成为可能。在例如WO 88/10270、W0 86/04589 和EP 0 735 139中已经公开了编码α-和β -链的DNA序列以及生产重组FSH的方法。目前，在德国市场上有两种商品化的重组人FSH产品，GONAL-f @和Puregon ，两 者都是通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达编码人野生型α-和β-链的DNA序列来生 产的。通常，蛋白质的半衰期非常短，并且当蛋白质暴露于各种因素(例如不适宜蛋白 质活性表达的温度、水、空气界面、高压、物理/机械胁迫、有机溶剂和微生物污染)时，其发 生变性，例如单体的聚集、二聚体的解离、和吸附在容器表面上。因此，变性蛋白丧失了内在的物理化学性质和生理活性作用。蛋白质的变性是不 可逆的，因此，蛋白质一旦变性就几乎不能恢复其天然的性质而回到初始状态。具体地讲，具有由2个不同亚基组成的异源二聚体结构并且每次以低于几百微克 的痕量进行给药的蛋白质(例如人FSH)遭受了与相对高的蛋白损失有关的问题，包括因在 水溶液中二聚体离解和蛋白质吸附在容器内表面上而引起的蛋白损失。离解的蛋白质丧失 了其自身的生理活性，并且离解的单体非常易于聚集。而且，吸附在容器内表面上的蛋白质 也非常容易通过变性过程聚集。当将其向人体给药时，如此变性的蛋白质可以成为形成对 抗体内天然存在的蛋白质的抗体的诱因。某些蛋白药物制剂已经通过冷冻干燥(冻干)克服了稳定性问题。虽然这 些冻干制剂足够稳定以致能保证足够的半衰期，但是其具有在给药前必须进行重构 (reconstitution)的缺点。因此，患者在使用前必须在溶剂(例如注射用水)中重构干燥 的糖蛋白，这对于患者而言是缺点和不方便。此外，必须与FSH的冻干制剂一起提供溶剂。对于需要有规律地注射FSH的患者，例如为了诱导排卵而接受每日剂量的重组人FSH的患 者，促性腺素制剂的易于处理、给药和注射是重要的。冻干的促性腺素制剂的重构要谨慎和 小心，并且如果可能的话应避免重构。如果能够生产这些糖蛋白并将其分装为稳定的溶液， 使患者无需重构就可直接注射药物，这将为促性腺素的使用提供便利。此外，冻干过程是费 钱和耗时的加工步骤，如果在制备促性腺素制剂时能够避免该步骤，这将是有利的。因此，需要即时可用(ready-for-use)的注射制剂，该制剂具有足够的稳定性从 而保证合理的贮藏期。作为应对这些限制的可选择的措施，可以通过向溶液状态的蛋白质加入稳定剂来 改善蛋白质的稳定性。有用的蛋白质稳定剂的实例有已知的表面活性剂、蛋白质(例如白 蛋白)、多糖、氨基酸、聚合物、盐等。然而，考虑到各种蛋白质的独特的物理化学性质，应该 选择并使用最合适的稳定剂。而且，由于不同稳定剂之间的竞争作用和不良反应，不同稳 定剂的联合使用可能带来预想的不良副作用。此外，由于不同的稳定剂具有特定的对稳定 相应蛋白质有利的浓度范围，存在于溶液中的蛋白质的成功稳定还需要认真关注和很多努 力。已经将FSH配制成在管形瓶、笔胆(carpoule)或安瓿中的单剂量和多剂量的液体 形式。单剂量形式在使用之前的贮存中必须保持稳定和有效。多剂量形式不仅在使用之前 的贮存中必须保持稳定和有效，而且在安瓿开封之后的多剂量使用方案的给药期间也必须 保持稳定、有效和相对无菌。出于该原因，多剂量形式经常含有抑菌剂。GONAL-f ，一种人重组FSH的即时可用的液体制剂，可用作由注射笔给药的注射 用溶液。溶液含有作为防腐剂的间甲酚(ROTE LISTE 2007，No. 50 004)。Puregon 也可 用作即时可用的注射用液体制剂，其含有作为防腐剂的苯甲醇(ROTE LISTE 2007, No. 50 010)。含有防腐剂的FSH液体制剂也已记载于专利文献中。国际专利申请 W0-A1-00/04913记载了包含防腐剂的FSH和FSH变体的制剂，所述的防腐剂选自苯酚、间甲 酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸 钠和硫柳汞。尽管这些防腐剂的使用以一般的方式被提及，但并未公开重组人FSH液体制 剂中的防腐剂的特定的组合或混合物。此外，国际专利申请WO 2004/037607涉及人FSH的水性制剂，其包含甘氨酸、甲硫 氨酸、非离子型表面活性剂和磷酸盐缓冲液作为稳定剂。另外，制剂可以任选地包括防腐 剂，提及的有苯甲醇、甲酚、对羟基苯甲酸酯及其混合物。国际专利申请WO 2004/087213 Al记载了 FSH的液体药物组合物，其包含选自 Pluronic F77、Pluronic F87、Pluronic F88 和 Pluronic F68 的表面活性剂。组合物 可以进一步包含选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯、 苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞的抑菌剂。未提及抑菌剂的混合物或组合。因此，虽然需要提供含有防腐剂的促性腺素制剂，以便制剂适合于多次给药，但生 产含有人蛋白的防腐的药物制剂已经证明是困难的。已经发现，当使用防腐剂时，如果药物 制剂贮存较长时间，其引起稳定性问题。在该过程中，人蛋白失活并且形成团块，这可能是 造成所观察到的对注射溶液不耐受的原因。在活性的人蛋白成分存在的情况下，不能用通 常的方法生产用于输液或注射的防腐的药物制剂，这是因为在121°C的高压灭菌器中的灭菌条件下活性物质被灭活并且其结构被破坏。也已知药剂学中通常所用的防腐剂与有活性 的人蛋白成分发生反应从而使之灭活。所用的防腐剂的类型对于耐受性有重要作用。所有 防腐剂都具有或高或低的过敏率。因此，为了实现良好的防腐，而且使与某种人糖蛋白组合 的特定的防腐剂的缺点最小化，选择人蛋白制剂中的防腐剂是关键。因此，仍然迫切需要开发新的人重组FSH液体制剂，其由防腐剂进行防腐并且能 够在延长的时间内稳定维持人重组FSH的活性。根据本发明，该问题和其他的问题能够通过主权利要求的特征解决。有利的实施方案在从属权利要求中进行定义。令人惊讶地，已经发现在包含作为活性剂的FSH或其变体和作为防腐剂的苯扎氯 铵和苯甲醇的液体药物组合物中配制重组人FSH提供了良好的组合物稳定性，以致其能够 用于单剂量和多剂量用途。本发明的组合物不需冷藏就能在延长的时间内贮存，没有显著 的活性损失并且没有显著的降解。推测作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇的组合特别有利于 与糖激素FSH组合，这是因为其提供了更好的防腐效果和确保与ras之间的不利的相互作 用保持最低水平。除非另有说明，以下定义是用来对用于描述本发明的各种术语的含义和范围进行 举例说明和定义。术语“FSH”是指作为全长成熟蛋白的促卵泡激素多肽，其非限制性地包括人FSH 或“hFSH”，不论其是重组生产的还是从人源分离得到的(例如绝经后妇女的尿液)。技术 人员根据科学文献和专利文献(参见例如WO 2004/087213)可以获知该人糖蛋白的蛋白质 序列和人FSH β -亚基的蛋白质序列。如本说明书所附的，人FSH的α -链的氨基酸序列记载于SEQ ID No. 1中，人FSH 的β-链的氨基酸序列记载于SEQ ID Νο.2中。这些氨基酸序列对应于分别以登录号J 00152记载于EMBL数据库中和以登录号ΝΜ_000510记载于NCBI数据库中的人FSH的α-链 和β-链的野生型氨基酸序列。编码人FSH的野生型核酸序列在SEQ ID No. 3 ( = α -链)和No. 4 ( = β -链) 中显示。重组FSH可以按照如在人类中天然发现的野生型核酸序列编码，或者其可以被改 变的核酸序列编码，所述的改变的核酸序列表达产生具有野生型氨基酸序列的FSH，S卩，与 在人类中天然发现的野生型蛋白质序列相同。例如，编码人FSH的核酸序列能够以这种方式发生改变为了增加在这些宿主细 胞中的重组FSH的表达水平和产率，使编码人FSH的α-和β -链的核酸序列中的一者或 两者调整为在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中选择使用的密码子。编码人FSH并且按照CHO细胞中的密码子选择方面进行改良的核酸序列的实例记 载于国际专利申请WO 2009/000913中。编码人FSH的β -链的改良核酸序列是记载于SEQ ID No. 5中的核酸序列的编码区(在SEQ ID No. 5中，编码区起始于核苷酸56并且延伸到 核苷酸442)，编码人FSH的α -链的改良核酸序列是记载于SEQ ID No. 6中的核酸序列的 编码区(在SEQ ID No. 6中，编码区起始于核苷酸19并且延伸到核苷酸366)。含有重组核 苷酸分子(其包括编码人FSH的β-链的第一种改良的核酸序列和编码人FSH的α-链的 第二种改良的核酸序列)的CHO细胞系以保藏号DSM ACC2833于2007年3月28日存放于在 Braunschweig 的 DSMZ0在优选的实施方案中，本发明的FSH液体制剂含有通过由FSH核酸序列的重组基 因表达得到的重组人野生型FSH，就人FSH的β-链和FSH的α -链而言，所述的FSH核 酸序列按照CHO细胞中的密码子选择进行了改良。在另一个优选的实施方案中，通过WO 2009/000913所公开的FSH核酸序列表达得到重组FSH。表述“FSH变体”是指包括与人FSH在氨基酸序列、糖基化类型或亚基间连接上有 所不同，但表现出FSH活性的那些分子。实例包括CTP-FSH，长效的改良的重组FSH，由野 生型α -亚基和杂合的β -亚基组成，其中hCG的羧端肽已经与FSH的β -亚基的C末端 融合，如 LaPolt 等人在内分泌学(Endocrinology)，131，2514-2520 (1992)中或者 Klein 等人在Human R印rod.，18，50-56 (2003)中所述的。也包括单链CTP-FSH，由Klein等人在 Fertility & Sterility, 77,1248-1255 (2002)中所述的单链分子。FSH变体的其他的实例 包括具有引入α-和/或 β-亚基的另外的糖基化位点的FSH分子，如WO 01/58493中所 公开的，和具有亚基间S-S键的FSH分子，如WO 98/58957中所公开的。FSH变体的其他实 例在WO 2004/087213中公开，其特征在于β-亚基的羧基端缺失。FSH变体的其他实例包 括因蛋白质的氨基酸序列变化(其中该变化引入了另外的糖基化位点或者缺失天然存在 的糖基化位点)而与野生型FSH相比具有改变的糖基化程度的FSH分子。进一步地，本发明的FSH或FSH变体可以是已经被化学部分修饰的FSH分子。例 如，这类FSH偶联物可包含聚亚烷基二醇(例如PEG)、羟烷基淀粉(例如HES)或其他聚合 物部分。FSH异源二聚体或FSH变体异源二聚体能够用任意合适的方法来生产，例如根据 具体情况通过重组技术生产、从天然来源分离或纯化、或者通过化学合成，或者它们的任意组合。术语“重组”的使用是指使用重组DNA技术(参见例如WO 85/01958)生产的FSH 或FSH变体的制剂。有若干种的α -和β -亚基已知道FSH的基因组和cDNA克隆的序列。 用重组技术生产重组FSH或FSH变体的各种方法记载于现有技术中，参见例如欧洲专利申 请EP 0 711 894和欧洲专利申请EP 0 487 512。本发明所用的FSH或FSH变体不但可以用重组方法(包括从哺乳动物细胞、例如 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)来生产，而且可以从其他生物来源(例如从尿液来源)纯化得 到。现有技术中公开了可用的方法。重组人FSH可以从宿主细胞培养上清液通过1个或多个纯化步骤纯化得到。合适 的纯化方法是技术人员已知的并且包括离子交换色谱法、疏水作用色谱法、羟磷灰石色谱 法、亲和色谱法和凝胶过滤。纯化重组人FSH的方法在例如WO 00/63248、W0 2006/051070 和 WO 2005/063811 中公开。在本发明优选的实施方案中，FSH或FSH变体分别对应于人FSH或源自人FSH。在 本发明的优选的实施方案中，FSH或FSH变体已经用重组技术生产。更优选地，FSH是已经重组生产的人FSH，特别优选在用载体或包含编码FSH的人 糖蛋白α-亚基和β-亚基(由SEQ ID No. 3和4(=野生型核酸序列)或者由SEQ ID No. 5和6(=密码子优化的核酸序列)编码)的DNA的载体转染的中国仓鼠卵巢细胞中生 产。编码α-和β-亚基的DNA可以存在于相同或不同的载体上。
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重组FSH与其来自尿液的对应物相比具有若干优点。使用重组细胞的培养和分离 技术保证批次间的一致性。相反地，不同批次的尿液的FSH在亚基的纯度、糖基化类型、唾 液酸化作用和氧化方面差别巨大。由于重组FSH具有更好的批次间一致性和纯度，该激素 可使用例如等电聚焦法(IEF)的技术容易地进行定性和定量。能够容易地对重组FSH进行 定性和定量允许按激素重量填充管形瓶，而不是按生物测定来填充。术语“FSH活性”是指FSH制剂引发与FSH相关的生物响应的能力，例如女性患者 体内的在 Steelman-Pohley 检验(Steelman 等人(1953)内分泌学(Endocrinology) 53， 604-616)中的卵巢重量增加或者卵泡生长。通过超声能够评估女性患者体内的卵泡生长， 例如根据在刺激第8天平均直径为约16mm的卵泡的数量。用针对FSH的可接受的标准评 估生物活性。术语“水性稀释剂”是指含水的液体溶剂。水性溶剂系统可以仅由水组成，或者可 以由水加上1种或多种可混溶的溶剂组成，并且可以含有溶解的溶质，例如糖、缓冲剂、盐 或其他赋形剂。更常用的非水溶剂是短链有机醇(例如甲醇、乙醇、丙醇)、短链酮(例如丙 酮)和多元醇(例如甘油)。在本发明的优选的实施方案中，水性稀释剂是水，即，本发明的 即时可用的液体制剂是水性制剂。“张力调节剂”或“等渗剂”是身体上耐受的并且为制剂赋予适当的张力从而防止 穿过与制剂接触的细胞膜的水的净流量。合适的等渗剂非限制性地包括甘油、氨基酸或蛋 白质(例如甘氨酸或白蛋白)、盐(例如氯化钠)、糖(例如右旋糖、蔗糖、海藻糖和乳糖) 和糖醇(例如甘露醇和山梨醇)。术语“抑菌的”或“抑菌剂”或“防腐剂”是指加入到制剂中的用作抗菌剂的成分或 物质。本发明的含FSH或FSH变体的防腐制剂优选符合对于防腐效果的法律或法规，从而 成为在商业上可行的多用途产品，优选用于人。用于本发明的制剂的抑菌剂是苯扎氯铵和苯甲醇的组合。虽然组合物中可能包 括其他防腐剂(即，除了苯扎氯铵和苯甲醇之外)，例如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲 酚、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苄索氯铵、脱氢醋酸钠或硫柳汞，但 优选仅有苯扎氯铵和苯甲醇作为防腐剂存在。术语“缓冲剂”或“生理上可接受的缓冲剂”是指制剂中已知安全的药用或兽医用 的并且具有维持或控制制剂的PH在制剂所需的pH范围内的作用的化合物溶液。用于控制 PH在适度酸性的pH至适度碱性的pH的可接受的缓冲剂非限制性地包括诸如磷酸盐、醋酸 盐、柠檬酸盐、精氨酸、三羟甲基氨基甲烷和组氨酸的化合物。优选的缓冲剂是磷酸盐缓冲 剂。术语“磷酸盐缓冲剂”是指调整到需要的pH的含有磷酸或其盐的溶液。通常，磷 酸盐缓冲剂是由磷酸或磷酸的盐(其非限制性地包括钠盐和钾盐)制成的。一些磷酸盐是 本领域已知的，例如酸的钠和钾一价、二价和三价盐。磷酸的盐也已知以存在的盐的水合物 存在。磷酸盐缓冲剂可以覆盖例如约PH4至约pHIO的pH范围，优选的范围是约pH 5至约 PH 9，最优选的pH范围是约6.0至约8.0，最优选是pH 7. 0或约pH 7.0。在优选的实施方 案中，缓冲系统仅由磷酸盐缓冲剂组成，即，制剂中除了磷酸盐之外不存在其他缓冲剂。术语“管形瓶”宽泛地指适合于以液体形式在无菌状态保存FSH的容器。本文所 用的管形瓶的实例包括安瓿、药筒、泡罩包装或其他适合于通过注射器、泵(包括渗透泵)、导管、透皮贴剂、肺或跨粘膜喷雾剂向患者递送FSH的贮库。适合于包装胃肠外、肺、跨粘膜 或经皮给药的产品的管形瓶是本领域熟知和公认的。术语“稳定性”是指本发明的制剂中的FSH的物理、化学和构象的稳定性(包括 生物活性的保持)。蛋白制剂的不稳定性可能由蛋白质分子的化学降解或聚集从而形成更 高数量级的聚合物引起，由异源二聚体离解成单体、去糖基化、糖基化修饰、氧化(特别是 α -亚基的氧化)或任何其他降低本发明所包括的FSH多肽的至少1种生物活性的结构变 化导致。“稳定的”溶液或制剂或药物组合物是指其中蛋白质的降解程度、修饰、聚集、生物 活性丧失等受到可接受地控制，并且不会随着时间而发生不可接受地增加。优选地，制剂保 留至少80%或约80%的FSH活性并且在约2-8°C的温度下保持至少6个月时间。通过使用 Steelman-Pohley卵巢增重生物检定法能够测量FSH活性。术语“治疗”是指对需要以刺激卵巢或睾丸或者由FSH调节的任何其他生理反应 为目的而施用FSH的患者进行给药、随访、管理和/或照料。因此，治疗可以非限制性地包 括为了诱导或改善精子质量、刺激男性体内的睾酮释放或女性体内的卵泡发育或诱导排卵 而施用FSH。用语“多剂量给药”或“多剂量使用”是指包括用于1次以上注射(例如2、3、4、5、 6或更多次注射)的FSH制剂的单个管形瓶、安瓿、笔胆或药筒的使用。优选在至少约12个 小时、24个小时、48个小时等的时间内、优选多达约12天的时间内进行注射。可以间隔时 间进行注射，例如间隔6、12、24、48或72小时。发明人已经发现通过将FSH或FSH变体与作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇二者进 行配制，得到了表现出高的蛋白稳定性同时具有良好防腐作用的制剂。而且，人们认为本发 明的FSH制剂组合物与本领域中已知的FSH制剂相比表现出改进的局部耐受性(例如在注 射点没有刺激)。苯扎氯铵优选以足以在需要的贮藏期(例如6至12至24个月)内维持FSH稳定 性并且足以防止细菌生长的浓度存在于制剂中。优选地，本发明的液体制剂中的苯扎氯铵的浓度为约0. 005mg/ml至约0. 05mg/ ml、更优选为约 0. 01mg/ml 至约 0. 04mg/ml、最优选为 0. 02mg/ml 或约 0. 02mg/ml (0. 002% (w/v))。苯甲醇优选以足以在需要的贮藏期(例如6至12至24个月)内维持FSH稳定性 并且足以防止细菌生长的浓度存在于制剂中。优选地，本发明的液体制剂中的苯甲醇的浓度为约0. 5mg/ml至约20. Omg/ml、更 优选为约1. Omg/ml至约15. Omg/ml、更特别优选为约5. Omg/ml至约12. Omg/ml、最优选为 10. Omg/ml 或约 10. Omg/ml (1. 0% (w/v))。本发明的液体制剂之中的促卵泡激素(FSH)的浓度优选为约150IU/ml至约 2，000IU/ml、更优选为约300IU/ml至约1，500IU/ml、更特别优选为约450IU/ml至约 750IU/ml、最优选为 600IU/ml 或约 600IU/ml。重组FSH的体内生物比活性通常在约8，OOOIU FSH/mg蛋白质至约16，OOOIU FSH/ mg蛋白质的范围。例如，可从商业上购买到的产品Puregon(来自Organon)中的重组人FSH 具有约10，OOOIE/mg蛋白质的生物比活性，而对于来自Serono的Gonal-f，重组人FSH的生
9物活性为约13，600IE/mg蛋白质。通过与FSH和其他促性腺素相关的已知方法可以测定FSH活性。这些方法包括例 如酶免疫测定法(EIA)或报道基因测定法。通常用欧洲药典第5版中所述的源自尿液的 FSH的生物检定法来测定生物活性。在这一过程中，通过将FSH增大用绒促性素处理的未成 熟大鼠的卵巢的效果与标准制剂的同样效果相比较来评价生物活性。本发明的液体药物组合物中的FSH或FSH变体的浓度通常在10至200 μ g/ml的 范围。如果组合物是用于多用途给药(例如通过使用注射笔)，FSH或FSH变体的可用浓度 将在30至150yg/ml的范围、优选在40至100yg/ml的范围。一般而言，FSH浓度取决于用途(单剂量或多剂量)、给药方式、给药工具和FSH或 FSH变体的生物活性。优选地，FSH或FSH变体是药物组合物中唯一存在的药物活性剂，虽然可能包括其 他的促性腺激素(例如LH)。为了防止FSH或FSH变体吸附到管形瓶、安瓿、笔胆、药筒或注射器的表面上，本发 明的药物组合物可以进一步包含表面活性剂，优选非离子表面活性剂。在此，非离子表面活 性剂降低蛋白质溶液的表面张力，从而防止蛋白质吸附或聚集在疏水表面上。能够用于本 发明的非离子表面活性剂的优选的实例可以包括基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂和 基于泊洛沙姆的非离子表面活性剂。这些非离子表面活性剂可以单独或者以其任意组合使 用。基于聚山梨醇酯的非离子表面活性剂是特别优选的。基于聚山梨醇酯的非离子表面活 性剂的具体实例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。聚山 梨醇酯20和聚山梨醇酯80是更特别优选的，聚山梨醇酯20是最优选的。聚山梨醇酯20具 有相对低的临界胶束浓度。因此，聚山梨醇酯20不仅在即使低浓度下减少或防止蛋白质的 表面吸附，而且抑制蛋白质的化学降解。在本发明的液体组合物中使用高浓度的非离子表 面活性剂是不合适的。这是因为使用高浓度的非离子表面活性剂导致干扰效应，因此当使 用如紫外光谱或等电聚焦的分析方法进行蛋白质的浓度测定或稳定性评价时，很难精确地 评价蛋白质的稳定性。因此，本发明的水性制剂含有浓度低于1. Omg/ml和更优选0. 05至 0. 5mg/ml的非离子表面活性剂。在优选的实施方案中，聚山梨醇酯20是制剂中唯一存在的表面活性剂。优选地，本发明的FSH制剂的pH在约6. 0和约8. 0之间、更优选约6. 5至约7. 5、 包括约PH 6. 8、pH 7. 0、pH 7. 2和pH 7. 4。优选的缓冲剂是磷酸盐，优选的反荷离子是钠 或钾离子。在总溶液中缓冲剂浓度能够在5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM 和 500mM之间变化。优选地，缓冲剂的浓度是50mM或约50mM。具有pH 7. O的50mM的磷酸盐 缓冲剂是特别优选的。能够通过加入适量的合适酸或碱来调节制剂的pH。在一个实施方案中，用NaOH调 节液体药物组合物的PH。优选地，本发明的制剂含有抗氧化剂，例如甲硫氨酸、亚硫酸氢钠、乙二胺四乙酸 (EDTA)的盐、丁羟甲苯(BHT)和丁羟茴醚(BAH)。最优选甲硫氨酸。抗氧化剂防止FSH(特 别是α-亚基)的氧化。液体药物组合物中的甲硫氨酸的浓度优选是约0. 1至约1. Omg/ml、更优选约0. 2至 0. 8mg/ml、最优选是 0. 5mg/ml 或约 0. 5mg/ml。在优选的实施方案中，甲硫氨酸是本发明的制剂中唯一存在的抗氧化剂。优选地，本发明的制剂含有作为稳定剂和张力调节剂的单糖或二糖或者糖醇，例 如蔗糖、右旋糖、乳糖、山梨醇和/或甘油。最优选的是糖醇，特别优选甘露醇。糖或糖醇的浓度优选为约1. 0至10mg/ml、最优选的浓度为5. Omg/ml或约5. Omg/ ml。在一个实施方案中，本发明的组合物中所存在的甘露醇的量为5. Omg/ml在优选的实施方案中，甘露醇是本发明的制剂中唯一存在的张力调节剂。在优选的实施方案中，本发明的制剂不含任何甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的液体药物组合物含有作为活性剂的FSH或其变体、 作为表面活性剂的聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80、作为张力调节剂的甘露醇、作为缓 冲剂的磷酸盐、作为稳定剂的甲硫氨酸和作为防腐剂的苯甲醇和苯扎氯铵、以及水，并且没 有其他赋形剂。如上所述，本发明提供单次使用和多剂量使用的液体制剂，其含有至少2种抑菌 剂的组合。本发明的制剂适合于药用或兽医用。在一个实施方案中，本发明提供了用于人药用的制备物品，其包括包装材料和容 器，所述容器包含在水性稀释剂中的FSH或FSH变体以及苯甲醇和苯扎氯铵、任选地含有缓 冲剂和/或其他赋形剂的溶液，其中所述的包装材料包含标明该溶液可以在第一次使用后 保存24小时或更长的时间的书面材料。容器优选是注射器、管形瓶、输液瓶、安瓿或笔胆。 最优选地，容器是在注射笔中的笔胆。在第一次使用之前，在容器封闭前，管形瓶、安瓿、笔胆或药筒已经被打破，本发明 的制剂可以保持至少约6个月、12个月或24个月。在优选的贮藏条件下，在第一次使用前， 本发明的药物组合物保持远离强光(优选在暗处)、在约2-8°C温度下。本发明的制剂能够使用公认的装置进行给药。包含这些单个的管形瓶系统的实 例包括用于递送溶液的笔注射器装置，例如已知的Easyject 、G0NAL-F 笔、Humaject 、 吣￥0 611@、8-0 笔3肽0卩611 、？011丨8^111 -笔、Puregon -笔和 OptiPen 。可以将稳定的防腐的制剂以澄清溶液提供给患者。溶液可以单次使用或者其可以 重复多次使用并且可以满足单次或多次循环的患者治疗，因此提供了比当前可用的治疗方 案更方便的治疗方案。本发明的水性制剂是即时可用的溶液，FSH制剂在任何时间点都不需重构。可以通过本领域中熟知的多种给药方法将本文所述的稳定的防腐制剂中的FSH 或FSH变体给予符合本发明的患者，包括皮下或肌肉注射、经皮、肺、跨粘膜、植入、渗透泵、 药筒、微量泵、口服或技术人员理解的其他方法。提供以下实施例，仅仅是用来进一步地举例说明本发明的制剂和组合物的制备。 本发明的范围不应解释为仅仅由以下实施例组成。本发明也涉及含有本发明的液体药物组合物的药物容器。合适的药物容器可从现 有技术获知。例如，容器可以是注射器、管形瓶、输液瓶、安瓿或笔胆。在优选的实施方案中， 当容器是注射器时，注射器装配有针头保护系统。可从现有技术获知的该针头保护系统帮 助降低伤害的危险。在另一个实施方案中，容器是注射笔中的笔胆。本发明也涉及制备本发明的液体药物组合物的方法，其中将作为活性剂的FSH或
11FSH变体配制在包含作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇以及其他药用赋形剂的水性制剂中。在另一方面，本发明涉及本发明的液体药物组合物用于多剂量给药的用途。本发 明的药物组合物能够有利地用于治疗不育症和与FSH相关的其他病症。在优选的实施方案 中，本发明的FSH制剂用于人的治疗。然而，通常也可将本发明药物组合物给予其他哺乳动 物，例如绵羊、牛、猪或马。发现本发明的药物液体制剂表现出非常好的贮藏稳定性。在本发明的范围内，术 语“贮藏稳定的”被理解为指在25°C下制剂贮藏3个月之后，活性的FSH或FSH变体的含量 仍然达到原始浓度的80%或更多。优选地，在25°C贮藏3个月之后，FSH活性的剩余含量 仍达到原始活性的至少85%、更优选至少90%和最优选至少95%。FSH或FSH变体的生物活性能够通过在给定的条件下，将其增大用绒促性素处理 的未成熟大鼠的卵巢的效果与国际标准制剂或以国际单位标定的参照制剂的同样效果相 比较来进行评价(欧洲药典，第5版)。例如，Albanese等人在 Mol. Cell Endocrinol. 101 :211_219 (1994)中描述了 FSH 体外活性的测定。用于本发明的制剂的FSH或FSH变体的纯度应当为至少95%、优选至少97%、更 优选至少99%和最优选高于99%。借助HPLC分析能够测定纯度。实施该分析的合适的材 料和方案能够从例如Vydac或TOSOH Bioscience的商业供应商获得。配制本发明的溶液的组分能够从常规来源获得，例如从如Sigma或Merck公司获得。本发明的制剂能够根据常规的方法来进行生产。制剂的组分能够溶解于水性缓冲 液中。或者，由于纯化过程，已经能够在水性缓冲液中得到FSH或FSH变体。最后，将制成的液体制剂填充到合适的药物容器中，在其中贮藏直至给药。以下实施例是为了举例说明本发明，而不是限制其范围。
实施例实施例1通过重组技术制备重组人FSH用标准方法在转染的CHO宿主细胞中生产重组人FSH。这些方法包括CHO细胞克 隆的传代(所述克隆产生来自编码人FSH的α-链和β-链的一种或多种重组核酸分子的 重组人FSH)、在合适的条件下培养宿主细胞和从细胞培养物中提纯重组人FSH。合适的方 法记载于如上所述的现有技术中。在优选的实施方案中，重组人FSH按照国际专利申请W02009/000913所述生产。实施例2液体FSH制剂通过在水性磷酸盐缓冲溶液中配制以下组分来制备包含重组人FSH的液体制剂。
权利要求
液体药物组合物，其包含促卵泡激素(FSH)或其变体和作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇。
2.根据权利要求1的液体药物组合物，其中所存在的苯扎氯铵的浓度为 0. 005-0. 03mg/ml和所存在的苯甲醇的浓度为5. 0-12. Omg/ml。
3.根据权利要求1或2的液体药物组合物，其中所存在的FSH或其变体的浓度为10至 200 μ g/ml。
4.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其进一步包含作为抗氧化剂的甲硫氨酸。
5.根据权利要求4的液体药物组合物，其中所存在的甲硫氨酸的浓度为0.1至1. Omg/ml ο
6.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其进一步包含表面活性剂。
7.根据权利要求6的液体药物组合物，其中表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇烷基
8.根据权利要求7的液体药物组合物，其中聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯是聚山梨醇酯 20或聚山梨醇酯80。
9.根据权利要求8的液体药物组合物，其中所存在的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80 的浓度为0. 05至0. 5mg/ml。
10.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其进一步包含张力调节剂。
11.根据权利要求10的液体药物组合物，其中张力调节剂是糖醇或糖。
12.根据权利要求11的液体药物组合物，其中张力调节剂是甘露醇。
13.根据权利要求12的液体药物组合物，其中所存在的甘露醇的浓度为1.0至IOmg/ml ο
14.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其具有6.5至7. 5的pH范围。
15.根据权利要求14的液体药物组合物，其中pH范围是6.8至7. 2。
16.根据权利要求14或15的液体药物组合物，其中用NaOH调节pH。
17.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其进一步包含生理上可接受的 缓冲剂。
18.根据权利要求17的液体药物组合物，其中缓冲剂是磷酸盐。
19.根据权利要求17或18的液体药物组合物，其中所存在的缓冲剂的浓度为 10-100mmol/lo
20.根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物，其中组合物含有作为活性剂的 FSH或其变体、作为表面活性剂的聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80、作为张力调节剂的 甘露醇、作为缓冲剂的磷酸盐、作为稳定剂的甲硫氨酸和作为防腐剂的苯甲醇和苯扎氯铵， 并且没有其他赋形剂。
21.药物容器，其含有根据上述权利要求中任意一项的液体药物组合物。
22.根据权利要求21的药物容器，其中容器是注射器、管形瓶、输液瓶、安瓿或笔胆。
23.根据权利要求21或22的药物容器，其中容器是在注射笔中的笔胆。
24.制备根据权利要求1-20中任意一项的液体药物组合物的方法，其中将作为活性剂 的FSH或其变体配制到水性制剂中，所述水性制剂包含作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇以及其他药用赋形剂。
25.制备包装的药物组合物的方法，其包括将包含FSH或其变体以及苯扎氯铵和苯甲 醇的溶液置于管形瓶、安瓿、笔胆或药筒中。
26.根据权利要求1-20中任意一项的液体药物组合物用于多剂量给药的用途。
全文摘要
本发明涉及包含促卵泡激素多肽和作为防腐剂的苯扎氯铵和苯甲醇的液体药物组合物。组合物还任选地包含一种或多种其他的可药用赋形剂。在一个实施方案中，组合物含有作为抗氧化剂的甲硫氨酸。组合物表现出良好的贮藏稳定性，并且特别用于其中促卵泡激素制剂被视为有效疗法的病症和医学适应症的预防和治疗。
文档编号A61K47/18GK101970010SQ200980104085
公开日2011年2月9日 申请日期2009年2月9日 优先权日2008年2月8日
发明者E·科勒, S·斯托尔曾伯格 申请人:拜奥吉耐里克斯股份公司