专利名称：生产促卵泡激素的细胞克隆的制作方法
生产促卵泡激素的细胞克隆 本发明涉及含有分别编码人促卵泡激素(FSH)的a链和|3链的核酸序列的核酸 分子，同野生型的人促卵泡激素相比，对核酸序列在CHO细胞中的密码子使用进行了修饰。
本发明还涉及含有这样的核酸序列的重组核酸分子、内含这样的重组核酸分子的 宿主细胞，以及它们在人促卵泡激素的生产中的用途。 最后本发明也涉及了在无血清的情况下将本发明的重组核酸分子转染入悬浮培 养的细胞，从而制造出表达人促卵泡激素的宿主细胞的方法。 促卵泡激素是由垂体前叶的促性腺细胞制造并释放到循环系统。促卵泡激素与黄 体生成素(LH) —起作用控制女性卵母细胞的成熟和男性精子的产生。促卵泡激素和黄体 生成素都属于异二聚体糖蛋白家族，其由独立的基因分别编码的两条非共价连接的a链 和P链形成。FSH和LH的a链的氨基酸序列是相同的，但P链的氨基酸序列是不同的。 a链和13链都是糖基化的。促卵泡激素的a链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位 点，分别在52和78的位置，而13链的两个潜在的天冬氨酰胺连接的糖基化位点则分别在 7和24的位置(Olijve等(1996)Mol. Hum. R印rod. 2 (5) :371-382)。 人促卵泡激素用来治疗不孕(unovulation)的女性，剌激多卵泡发育(超数排卵) 和用于辅助受孕的制剂，如IVF， GIFT或ZIFT。而且人促卵泡激素用来剌激患有低水平或 者缺乏促卵泡激素的产生的女性的卵泡成熟、和剌激先天或者后天性患有低促性腺素性功 能减退症的男性的精子发生。 最初医学使用的促卵泡激素是从人绝经期后的尿液中提纯的。但是这种提纯的促 卵泡激素有缺陷，内有黄体生成素和其它人源蛋白的污染。而且这种天然来源的使用暗示 了有限的产品可用性和一致性。 随着DNA重组技术的出现，使得通过将编码a链和|3链的核酸序列转染入培养 细胞来生产人促卵泡激素成为可能。编码a链和P链的DNA序列和生产重组的人促卵泡 激素的方法已经公开，比如在W0 88/10270， W086/04589和EP 0 735 139中。目前德国市场上有两种市售的重组人促卵泡激素产品，即G0NAL-F⑧和
111^0(^@，它们都是通过在^0细胞中表达编码野生的a链和|3链的DNA来生产的。
但是仍旧需要优化促卵泡激素链的表达从而对一定数目的细胞而言，提高促卵泡 激素的产量和表达率。因此本发明要解决的一个问题就是提供核酸序列和重组核酸分子， 使得重组人促卵泡激素能够在真核细胞中大量产生。 根据本发明，这样的及另外的问题都已由独立权利要求的特征解决。
有利方案在从属权利要求中定义。 根据本发明，含有修饰的编码人促卵泡激素的a链和|3链的核酸序列的核酸分 子经修改已适应中华仓鼠卵巢(CHO)细胞的密码子使用，该核酸分子用于转染CHO细胞后 引起了促卵泡激素在转染的CHO细胞中的产量显著性增加。 在本发明的上下文中，术语"促卵泡激素产量增加"指的是这样的情况，一旦把修 饰的核酸序列表达在宿主细胞中，与把有同样的氨基酸序列的非修饰的编码促卵泡激素的 核酸序列在相似的条件下(比如具有可比较的转染过程和可比较的表达载体等等)表达在
3同一类型的宿主细胞中相比，有更高产量的促卵泡激素在宿主细胞中产生。 遗传密码是冗余的，20个氨基酸由61个三联体密码子编码。因此，这20个蛋白
质氨基酸中的大多数是由几种碱基三联体(密码子)编码的。编码某一特定的氨基酸的密
码子在某一特定的生物体内的使用频率并不相同，但是有使用频繁的偏爱密码子和较少使
用的稀有密码子。人们认为所述密码子使用不同来自选择性的进化压力，尤其是翻译效率。
稀有密码子的翻译效率低的原因可能是相对应的氨酰tRNA的库被清空，不再能用来合成
蛋白质。 而且不同的生物体偏爱不同的密码子。于是，例如源于哺乳动物细胞的重组DNA 在大肠杆菌细胞中的表达往往达不到最佳状态。因此把稀有密码子替换为高频使用的密码 子在一些情况下能增强表达。 对许多生物体来说，大量基因的DNA序列是已知的，并有从中可以得到特定的密 码子在各个生物体中的使用频率的表格。使用这样的表格，蛋白质序列可以相对准确地反 向翻译成含有对于蛋白质中的不同氨基酸在各个生物体中的偏爱密码子的DNA序列。密码 子使用的表格尤其會统下列网址中找到http:〃www. kazusa. or. jp/codon/index. html ; 或者http://www. entelechon. com/index, php 7 id = tools/index。 也有可利用的程序进行蛋白质序列的逆向翻译，比如把人促卵泡激素的a链和 P链的蛋白质序列逆向翻译成简并DNA序列，例如http:〃www. entelechon. com/eng/ backtranslation. html。 术语"核酸序列"在本发明中的目的涉及任何编码肽、蛋白质等多肽的核酸分子。 这些核酸分子可能是由DNA， RNA或其相关的类似物组成。但优选由DNA组成的核酸分子。
本领域技术人员清楚地意识到初始核苷酸序列的修饰描述了关于密码子使用的 优化过程。 比如说如果外源的野生型的酶的编码序列调整为CH0细胞的密码子使用，那么引 进的变化很容易通过比较修饰的序列和初始序列得到鉴定(见图la和lb)。而且这两个序 列都编码相同的氨基酸序列。人促卵泡激素的a链的氨基酸序列在SEQ ID No. 5中描述， 人促卵泡激素的P链的氨基酸序列在SEQ ID No. 6中描述。这些氨基酸序列对应人促卵 泡激素的a链和P链的野生型氨基酸序列，如EMBL数据库里登录号为J 00152、 NCBI库 里登录号为NM_000510所保藏的。 就人促卵泡激素的a链而言，初始核酸序列列在SEQ ID No. 3，而人促卵泡激素的 P链的初始核酸序列列在SEQ ID No. 4。 根据本发明，相对于初始序列，编码人促卵泡激素a链的核酸序列在CHO细胞中 的密码子方面的修饰发生在至少30个位置，优选至少40个位置，尤其优选至少50个位置， 还尤其优选至少60或70个位置，最优选至少75个位置。 而且根据本发明，相对于初始序列，编码人促卵泡激素13链的核酸序列在CH0细 胞中的密码子方面的修饰至少发生在25个位置，优选至少30个位置，更优选至少40个位 置，尤其优选至少50个位置，还尤其优选至少60个位置，最优选至少65个位置。
最优选这样的修饰的编码人促卵泡激素的13链的核酸序列是SEQ IDNo. 1中给出 的核酸序列的编码区，或者这段核酸序列整个编码区与SEQ IDNo. l中给出的核酸序列的编 码区有至少90 % ，优选至少92 %或者94 % ，尤其优选至少96 %或者98 % ，最优选至少99 %相同。在SEQ ID No. 1中编码区始于核苷酸56，一直延伸到核苷酸442。
最优选优化的编码人促卵泡激素a链的核酸序列是SEQ ID No.2中给出的核酸 序列的编码区，或者这段核酸序列整个编码区与SEQ ID No.2中给出的核酸序列的编码区 有至少85 % ，优选至少87 %或者90 % ，尤其优选至少92 %或者94 % ，最优选至少96 % 、 98%或者99%相同。在SEQ ID No. 2中编码区始于核苷酸19， 一直延伸到核苷酸366。
术语"未修饰的核酸序列"、"野生型的核酸序列"或者"初始核酸序列"在本发明 中的目的是指意欲用于(过)表达在宿主细胞且没有调整以适应宿主细胞的密码子使用的 核酸序列，而是编码蛋白的实际野生型核酸序列。 术语"修饰的核酸序列"或者"优化的核酸序列"在本发明中的目的是指意欲表达 在宿主细胞中，其已经将未修饰的/初始的核酸序列加以调整以适应宿主细胞的密码子使 用的核酸序列。修饰的或者优化的核酸序列编码的蛋白质与未修饰的序列编码的蛋白质的 氨基酸序列相同。 序列的同一性是由许多基于不同算法的程序决定的。在这方面Needleman和 Wunsch的或者Smith和Waterman的算法取得了尤其可信的结果。就序列比对而言，使用 的程序为PileUp(Feng和Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25 :351-360 ;Higgins等 (1989) CABI0S5 :151-153)或者G即和Best Fit程序(Needleman和Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453， Smith和Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2 :482-489)，其包含在了 GCG 软件包中(GeneticsComputer Group, 575 Science Drive, Madison， Wisconsin, USA)。
本文给出的以百分比表示的序列同一性的值是由程序G即用以下设置在整个序 列区域决定的空位权重50，长度权重30，平均匹配10， 000和平均错配0. 000。除非特 别提到，刚才说的设置用作序列比较的标准设置。 无意受假设限制，假定密码子优化的DNA序列允许更有效的翻译，其形成的mRNA 在细胞里可能有更长的半衰期，因此可更频繁地被用于翻译。 本领域技术人员非常熟悉这样的技术，其能将初始的核酸序列改变成修饰的核酸 序列，该修饰的核酸序列用不同的密码子使用编码有相同氨基酸的多肽。比如这可以通过 基于聚合酶链式反应的基因突变技术，通过众所周知的克隆过程，通过化学合成等等来实 现。 另外本发明的目的是包含编码人促卵泡激素13链的修饰的核酸序列的重组核 酸分子，其中修饰的核酸序列选自根据SEQ ID No. 1中的核苷酸序列的编码区、与SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列编码区的同一性为至少90%的核苷酸序列，而且其中修饰的核 酸序列是宿主细胞中有活性的启动子所控制的。 术语"宿主细胞中有活性的启动子"是指在重组核酸分子中的启动子，它能使核酸 序列在期望其表达的宿主细胞中表达。启动子的活性通常是由转录因子的存在决定的，转 录因子能与启动子相结合从而激活转录。 适合核酸序列在哺乳动物细胞中表达的启动子被本领域技术人员所熟知，包括病 毒启动子，像CMV、 SV40、HTLV或者腺病毒主要晚期启动子和其它启动子，比如EF_1 a启动 子或者UbC启动子。 术语"宿主细胞"在本发明中的目的是指任何普遍用于表达的细胞，即转录和翻译 核酸序列以生成多肽之类的产物。术语"宿主细胞"或者"生物体"尤其是指与原核生物、
5低等的真核生物、植物、昆虫细胞或者哺乳动物细胞培养系统。宿主细胞优选哺乳动物细 胞，更优选啮齿类动物细胞，甚至更优选与CH0细胞的密码子使用类似的啮齿类动物细胞， 最优选宿主细胞为CH0细胞。 用于表达修饰的序列和生产重组人促卵泡激素的宿主CHO细胞系衍生于CH0-K1 细胞系，缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)活性。细胞系是从DSMZ(目录号ACC 126)获得，适 应悬浮和无血清培养的条件。 含有包含编码人促卵泡激素13链的第一优化核酸序列和编码人促卵泡激素 a链的第二优化核酸序列的重组核酸分子的CH0细胞系于2007年3月28日保藏在 Braunschweig的DSMZ，保藏号是DSM ACC2833。 术语"重组核酸分子"在本发明中的含义是指包括各种能够被导入宿主细胞并影 响重组核酸分子内含的核酸序列表达的核酸分子。该术语特别包括质粒载体和病毒载体， 比如腺病毒、慢病毒和逆转录病毒载体，但优选质粒载体。 可用于在哺乳动物细胞中表达蛋白的适合的质粒载体的例子已被大家所 熟知，包括pCI载体系列、pSI (Promega) 、 pcDNA 载体、pCEP4、 pREP4、 pSHOOTER 、 pZeoSV2 (Invitrogen) 、 pBlast、 pMono、 pSELECT、 pVITRO和pVIVO (Invitrogen)。除了要表 达的启动子和核酸序列，重组的核酸分子通常还包括其它功能性的元件，比如多聚腺苷酸 序列，用来识别转化阳性的原核和/或真核细胞的原核和/或真核细胞选择性的基因，以及 复制起始点。专家知道他要为某个具体的目的而选择哪一个元件，以及哪一个质粒载体适 合在某个具体的宿主细胞中表达某个具体的核酸序列。 包含本发明的核酸序列的重组核酸分子可以通过文献中描述的标准的分子生物 学的方法获得，比如Sambrook禾口Russell (2001)Molecularcloning_a laboratory manual, 第三片反，Cold Spring Harbour LaboratoryPress， Cold Spring Harbour, NY， USA.
本发明中的重组核酸分子优选包含编码人促卵泡激素的13链的修饰核酸序列和 编码人促卵泡激素的a链的核酸序列。 编码人促卵泡激素的a链的核酸序列选自编码人促卵泡激素的a链的优化核酸 序列中，而该优化核酸序列选自SEQ ID No. 2中显示的核酸序列的编码区，与SEQ ID No. 2 中描述的核酸序列的编码区至少有85%的序列同一性的核酸序列，SEQ ID No.3中描述的 未修饰的核酸序列的编码区，与SEQ ID No.3中描述的核酸序列的编码区至少有70%的序 列同一性的的核酸序列。 编码人促卵泡激素a链的核酸序列可能与编码人促卵泡激素13链的核酸序列在 相同的启动子的控制下，比如通过内核糖体进入位点(IRES)，或者是在独立的启动子的控 制下。优选把编码人促卵泡激素a链的核酸序列放在独立的启动子的控制下。更优选把 编码优化的人促卵泡激素P链的核酸序列放在SV40启动子的控制下，把编码人促卵泡激 素a链的核酸序列放在CMV启动子的控制下。最优选本发明中的重组核酸分子有SEQ ID No.7中描述的核酸序列。 另外本发明涉及的宿主细胞内含含有编码人促卵泡激素13链的优化核酸序列的 重组核酸分子，该重组核酸分子还含有编码人促卵泡激素a链的核酸序列，且该编码人促 卵泡激素a链的核酸序列选自修饰的核酸序列，其选自SEQ ID No.2中的核苷酸序列的编 码区，与SEQ ID No.2中的核苷酸序列的编码区有至少85X的序列同一性的核苷酸序列，SEQ ID No. 3中的未修饰的核酸序列的编码区，与SEQ ID No. 3中的核酸序列的编码区有至 少70%的序列同一性的核酸序列。 编码人促卵泡激素a链的核酸序列可能与编码人促卵泡激素13链的优化核酸序 列存在同一个重组核酸分子中，或者可以在独立的重组核酸分子中被导入宿主细胞。优选 编码人促卵泡激素a链的核酸序列与编码人促卵泡激素13链的优化核酸序列存在于同一 个重组核酸分子中。 宿主细胞可以从哺乳动物细胞培养的系统中选出，比如NIH3T3细胞、CH0细胞、 COS细胞、293细胞、Jurkat细胞、BHK细胞和Hela细胞。宿主细胞优选是啮齿类动物细胞， 更优选是与CHO细胞有类似的密码子使用的啮齿类动物细胞，最优选宿主细胞是CHO细胞。
本发明的目的还有内含重组核酸分子的宿主细胞在合适的培养基中的细胞培养 物，该重组核酸分子包含编码人促卵泡激素P链的修饰核酸序列和编码人促卵泡激素a 链的核酸序列，其中编码a链的核酸序列可选自上面定义的未修饰的核酸序列和修饰的 核酸序列。 细胞培养是通过在合适的培养基中在支持宿主细胞生长的条件下培养宿主细胞 而获得。 术语"培养细胞"应理解为是指细胞在这样的条件下在体内保存，该条件允许增 殖、正常的细胞代谢以及形成重组蛋白。那意味着提供细胞所有必要的营养以及氧气并保 存在合适的pH和渗透性下。细胞可以在任何合适的条件下培养。细胞优选以悬浮培养的 方式培养，比如在培养瓶或者转瓶中。术语"培养"包括分批培养、补料分批培养和灌注培 养以及其它合适的培养方法。"悬浮培养"指细胞并不附着在(容器)表面上，而是分布在培养基中。"分批培养"在本发明中的意思是指一种培养方法，在培养中，培养基既不添加也
不取出。"补料分批培养"在本发明中的意思是指一种在培养中会添加培养基但不会取出 培养基的培养方法。"灌注培养"在本发明的范围中指培养中会取出培养基且会添加新的培养基的一 种培养方法。 培养基优选仅具有低血清含量，比如最大含量为1 % (体积/体积)的血清；最 优选是无血清的培养基。合适的培养基的实例是基本培养基比如RPMI 1460、 DMEM、 F12、 ProCH05或者eRDF，它们之间可以相互混合，并与根据细胞需要的补料混合。除了葡萄糖和 氨基酸，培养基还可能含有螯合剂如金精三羧酸(ATA)、无机盐如磷酸盐、多胺及其前体如 腐胺、激素如胰岛素、抗氧化剂如抗坏血酸和维生素混合物、脂类前体如乙醇胺、和细胞保 护物质如pluronic F68。专家知道哪一种培养基用于某种类型细胞的培养。培养基优选 ProCH05。 本发明的目的还有把本发明所述的宿主细胞先是在合适的培养基中培养一定的 时间，然后收获细胞培养上清的方法。"细胞培养上清"是指与细胞接触一段时间，然后与细胞分开的细胞培养基。细胞 培养上清包含细胞生产的重组蛋白。细胞与悬浮液可以通过传统的分离技术比如过滤和离 心来分离。在长期培养中，本发明的宿主细胞上清包含的促卵泡激素的浓度至少是500ng/ml，优选至少1000ng/ml，更优选至少1500ng/ml，最优选至少2000ng/ml。 重组人促卵泡激素可以通过一个或多个纯化步骤从细胞培养上清中提纯。专家知
道适宜的纯化方法，包括离子交换层析、疏水作用层析、羟磷灰石层析、亲和层析和凝胶过
滤。纯化重组人促卵泡激素的方法公开在W000/63248，W0 2006/051070和WO 2005/063811
中 要作为药剂服用，纯化的重组人促卵泡激素与一种或多种赋形剂混合，获得能对 病人施用的制剂。适合重组人促卵泡激素的制剂已经特别公开在EP 0 835 945，EP 1 285 665， EP 0 974 359， EP1 188 444和EP 1 169 349中。 本发明的宿主细胞通过用本发明的仅仅包含编码人促卵泡激素13链的修饰核酸 序列或者还包含编码人促卵泡激素a链的核酸序列的重组核酸分子转染细胞而制造。可 选地，编码13链的核酸序列和编码a链的核酸序列可存在于分开的核酸分子中，所述核酸 分子同时或者相继导入宿主细胞。 本领域技术人员熟知适宜的转染方法，比如包括磷酸钙沉淀法JEAE-葡聚糖介导 的转染、电穿孔法和脂转染法。也可以用市售的转染试剂盒，比如SuperFect、 PolyFect、 Effectene (Qiagen) 、 TransFast 、 ProFectiorT、 Transfectailf (Promega)禾口 TransPasSTM(NEB)。优选在细胞悬浮状态下和无血清的状态下转染细胞。
为了以商业规模生产重组人促卵泡激素，细胞通常被稳定转染，这意味着在转染 后成功转化的细胞能通过杀死未转染的细胞的选择性试剂筛选出来，而包含抗性基因的转 染的细胞继续生长。合适的选择性试剂包括抗生素如博莱霉素(zeocin)、新霉素和嘌呤霉 素，及其它药物比如甲氨蝶呤。 本发明通过下列实施例来说明，但实施例不应理解为限制性。 实施例 1.包含编码人促卵泡激素a链和|3链的优化核酸序列的重组核酸分子的克隆
使用的pUC18载体骨架已经包含了 SV40多聚腺苷酸位点和剪接位点以及由RSV 启动子、小鼠二氢叶酸还原酶基因、及SV40多聚腺苷酸位点和剪接位点组成的二氢叶酸还 原酶基因表达盒。二氢叶酸还原酶基因使得能够利用药物氨甲蝶呤选择转染阳性的细胞和 扩增转染的基因。 人促卵泡激素a链和p链未修饰的序列分别来自Fiddes和Goodman(1979) Nature 281 :351-356和Jameson等(1998)Mol. Endocrinol. 2 (9) :806-815。序列的优化在 于编码区采用了 CHO基因频繁使用的密码子使用。 而且引入了另外的终止密码子来保证翻译的有效终止。a链和|3链的优化核酸
序列分别显示于SEQ ID No. l和2中，野生型和修饰的核酸序列显示在图la和lb中。序
列的比较显示编码人促卵泡激素a链的修饰的和未修饰的核酸序列有80%的同一性，而
编码人促卵泡激素P链的修饰的和未修饰的核酸序列有85%的同一性。 修饰的序列通过限制性酶SacII和Ncol酶切和随后的连接分别插入两个pUC18
骨架拷贝。 CMV启动子和SV40启动子用下列弓|物从合适的模板DNA扩增，同时引入Ascl和 Pad限制性位点(下列引物的下划线处)。
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Asc-CMV-正向引物 5， -GGC GCG CCT TTT GCT CAC ATG GCT CG_3， (SEQ ID No. 8)
Pac-CMV-反向引物 5' -CCT TAA TTA AGA GCT GTA ATT GAA CTG GGA GTG—3' (SEQ ID No. 9)
Asc_SV40-正向引物 5' -GGC GCG CCG CAT ACG CGG ATC TG-3' (SEQ ID No. 10)
Pac_SV40-反向引物 5' -CCT TAA TTA AGT TCG AGA CTG TTG TGT CAG AAG A_3' (SEQ ID No. 11)
CMV启动子通过用限制性酶Ascl和Pacl切割质粒然后连接引入包含人促卵泡激 素a链的质粒中，SV40启动子通过用限制性酶AscI和PacI切割质粒然后连接引入包含 人促卵泡激素P链的质粒中。 最后包括SV40启动子、编码13链的核酸序列和SV40多聚腺苷酸信号的人促卵泡 激素P链的表达盒用下列引物扩增，同时在扩增物的5'和3'端引入NotI限制性酶切位 点(下列引物的下划线处)
P-Notl-正向引物 5' -GCG GCC GCA TAC GCG GAT CTG C_3， (SEQ ID No. 12)
P-NotI-反向引物 5， -GCG GCC GCT CAC TCA TTA GGC ACC CCA GG_3， (SEQ ID No. 13)
扩增物然后插入到NotI酶切的包含人促卵泡激素a链的质粒中。得到的质粒显 示在图2中，包含编码a链的优化核酸序列和编码|3链的优化核酸序列。包含这两个优 化核酸序列的质粒的序列显示在SEQ ID No. 7中。 2.用包含人促卵泡激素的a链和|3链不同组合的重组核酸分子瞬时转染CHO细 胞 包含编码a链的优化核酸序列或者包含编码|3链的优化核酸序列与相应的野生 型的P链或a链组合、或者包含这两种优化的序列的质粒按照上面1)中描述的方法制 造。DNA与含8mM谷氨酰胺不含HT的培养基ProCH05 (Lonza)混合达到200 y 1的总体积。 然后把20 ill的SuperFect试剂(Qiagen)加入到DNA溶液中并混合。将混合物在室温下 孵育5-10分钟。 包含1.68xl(f个CH0细胞的小份离心(5分钟，800rpm， 18_25°C )后，除去上清，将 细胞重悬在1. 1ml含8mM谷氨酰胺不含HT的培养基ProCH05中。在DNA混合物孵育5_10 分钟后，将悬液转移到DNA混合物中，混合并转移到6孔板的一个孔中。细胞在37t:孵育 3小时，使得细胞贴壁。除去上清后，将细胞用1ml磷酸缓冲液(PBS)洗3次，然后加入新 鲜的培养基(2ml含8mM谷氨酰胺不含HT的ProCH05)。在37。C孵育2天后，取出上清并离 心。将上清浓縮(浓縮因数为16.67)，用ELISA读板器(Anogen)测量促卵泡激素的浓度。 测量的结果显示在图3中。 结果表明与两条链都是野生型的相比，修饰的a链与野生型的|3链的共同引入， 使得蛋白表达量减少了几乎50%。与之不同的是，与野生型的a链与野生型的|3链的组 合相比，修饰的13链与野生型或修饰的a链的共同引入，均使得促卵泡激素的瞬时表达增 加1.5-3倍。因此尤其是修饰的13链的使用会使促卵泡激素的表达在瞬时转染后显著性增加，而修饰的a链不会促进促卵泡激素的生产。 附图简述
图1 :编码人促卵泡激素a链和|3链的非修饰和修饰的核酸序列的比较 a)编码人促卵泡激素a链的修饰和未修饰的核酸序列的序列比较 pXM17ss恥含编码人促卵泡激素a链的修饰的核酸序列的质粒的部分(SEQ ID No. 2) wtaFSH:编码人促卵泡激素a链的未修饰的核酸序列(SEQ IDNo. 3) 起始密码子和终止密码子都用粗体表示。 b)编码人促卵泡激素13链的修饰和未修饰的核酸序列的序列比较 查询编码人促卵泡激素13链的未修饰的核酸序列(SEQ ID No. 4) 目标编码人促卵泡激素13链的修饰的核酸序列(SEQ ID No. 1) 起始密码子和终止密码子都用粗体表示。 图2 :含编码人促卵泡激素a链的修饰的核酸序列和编码人促卵泡激素P链的 修饰的核酸序列的重组核酸分子的图谱 图3 :不同组合的a链和|3链在CH0细胞中瞬时转染后的表达分析 与表达野生型的a链和|3链的组合的细胞相比，促卵泡激素表达的相对量被列出。 w/w :未修饰的a链和P链 s/w :修饰的a链和未修饰的P链 w/s :修饰的P链和未修饰的a链 s/s :修饰的a链和P链
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权利要求
核酸分子，其包含编码人促卵泡激素(FSH)β链的核酸序列，该核酸序列选自SEQ ID No.1中的核酸序列的编码区、和与SEQ ID No.1中的核酸序列的编码区有至少90％的序列同一性的核酸序列。
2. 核酸分子，其包含编码人促卵泡激素(FSH) a链的核酸序列，该核酸序列选自SEQ ID No. 2中的核酸序列的编码区、和与SEQ ID No. 2中的核酸序列的编码区有至少85%的 序列同一性的核酸序列。
3. 重组核酸分子，其包含权利要求书1所述的第一核酸序列，该核酸序列在于宿主细 胞中有活性的启动子的控制下。
4. 根据权利要求3的重组核酸分子，还包含根据权利要求2的第二核酸序列。
5. 根据权利要求3的重组核酸分子，还包含第二个核酸序列，该核酸序列选自SEQ ID No. 3中的核酸序列的编码区、和与SEQ ID No. 3中的核酸序列的编码区有至少70%的序列 同一性的核酸序列。
6. 根据权利要求4或5的重组核酸分子，其中第二核酸序列在独立的启动子的控制下。
7. 根据权利要求3到6任一项的重组核酸分子，其中第一核酸序列和/或第二核酸序 列在病毒启动子的控制下。
8. 根据权利要求7的重组核酸分子，其中第一核酸序列是在SV40启动子的控制下。
9. 根据权利要求7的重组核酸分子，其中第二核酸序列是在CMV启动子的控制下。
10. 根据权利要求3到9任一项的重组核酸分子，其具有SEQ ID No.7中描述的核酸序列。
11. 宿主细胞，其包含根据权利要求4到IO任一项的重组核酸分子。
12. 根据权利要求11的宿主细胞，其为哺乳动物细胞。
13. 根据权利要求11或12的宿主细胞，其为中华仓鼠卵巢(CH0)细胞。
14. 根据权利要求11至13任一项的宿主细胞，保藏号是DSMACC2833。
15. 宿主细胞，其包含根据权利要求3的第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，该第 二重组核酸分子包含这样的核酸序列，其选自根据权利要求书2的核酸序列和SEQ ID No. 3 的核酸序列。
16. 细胞培养物，其包含在合适的培养基中的根据权利要求11到15任一项的宿主细胞。
17. 生产重组人促卵泡激素的方法，其包含步骤有 -在合适的培养基中培养根据权利要求书11到15任一项的宿主细胞； -收取细胞培养的上清液。
18. 根据权利要求17的方法，还包括从细胞培养上清液中纯化重组人促卵泡激素的步骤。
19. 产生根据权利要求11到14任一项的宿主细胞的方法，包括在无血清的条件下用根 据权利要求4到10任一项的重组核酸分子转染悬浮培养的细胞。
20. 产生根据权利要求15的宿主细胞的方法，包括在无血清的条件下用根据权利要求 3的第一重组核酸分子和第二重组核酸分子转染悬浮培养的细胞，该第二重组核酸分子包 含这样的核酸序列，其选自根据权利要求2的核酸序列和SEQ ID No. 3的核酸序列。
21. SEQ ID No. 1和/或2的核酸序列用于生产重组人促卵泡激素的用途。
全文摘要
本发明涉及含有分别编码人促卵泡激素(FSH)的α链和β链的核酸序列的核酸分子，其对核酸序列在CHO细胞中的密码子使用进行了修饰。本发明还涉及含有这样的核酸序列的重组核酸分子、内含这样的重组核酸分子的宿主细胞，以及它们在人促卵泡激素的生产中的用途。最后本发明也涉及了在无血清的情况下将本发明的重组核酸分子转染入悬浮培养的细胞，从而产生表达人促卵泡激素的宿主细胞的方法。
文档编号C07K14/435GK101720332SQ200880022358
公开日2010年6月2日 申请日期2008年6月27日 优先权日2007年6月28日
发明者N·耶利内克, S·阿诺德 申请人:拜奥吉耐里克斯股份公司