用于刺激自然杀伤细胞活性的组合物的制作方法

专利名称：用于刺激自然杀伤细胞活性的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种营养组合物及其用于刺激自然杀伤细胞(NK细胞)活性的用途。
背景技术：
NK细胞活性的下降是肿瘤患者、HIV感染患者以及老年人和手术患者疾病进展的
一个重要症状。自然杀伤(NK)细胞通常由其以非特异性的以及非受组织相容限制的方式裂解某 些肿瘤细胞以及受病毒感染的细胞的能力所定义。除了调节造血的作用外，NK细胞还对细 菌、真菌和寄生虫有一定的活性。从形态学方面，人NK细胞被归类为大颗粒淋巴细胞。从 表型上来看，它们表达多种特定的膜相关分子和受体，其中⑶56 (NCAM)和⑶16最常用于鉴 定和计数。人们认为NK细胞提供了对病毒感染和肿瘤细胞的基本防御。据文献记载，NK细胞活性的下降在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的人、肿瘤患者以 及老年人或者应激患者如手术患者中有症状。人们认为，HIV患者、肿瘤患者和老年人中存 在的NK细胞活性的下降对这些个体中先天免疫反应的有效性有着显著的影响，从而使得 清除病毒感染的细胞或者癌细胞的能力下降。在老年人中，这可能会引起病毒感染和癌的 数量增加。Galit Alter et al ；Blood 2005 ；106 :3366_3369 记载了 HIV 患者中 NK 细胞的下调。对功能的研究已经就NK细胞对抗K562肿瘤细胞系的活性进行了测量，并证实 老年供体中的NK细胞的细胞毒性受到损伤。进一步的证据来源于对百岁老人的研究，百 岁老人被认为是健康长寿的一个模型实例，据报道，百岁老人的NK细胞的细胞毒性保存 良好，参见 Facchini et al. Clinical Experimental Immunology 1987,68(2) :340_347 ； Sansoni et al. Blood 1993,82:2762773。EP 0596717公开了含有多种维生素和矿物质的营养补充剂用于提高老年人中的 自然杀伤细胞的活性的用途。EP 0941088公开了一种增强自然杀伤淋巴细胞的活性的方法，以及一种提高动物 中的自然杀伤细胞活性的基准水平的方法，通过给予缀合的亚油酸来进行。WO 2007/016132公开了两种乳杆菌用于制备能够刺激自然杀伤细胞的免疫调节 组合物的用途、尤其是用于治疗和/或预防变态和免疫缺陷的用途。WO 02/076471公开了在老年人中使用FOS能够刺激粪便中的双歧杆菌。没有显示 对自然杀伤细胞有影响。这份公开内容将引导技术人员不使用膳食纤维来刺激NK细胞。

发明内容
令人惊喜的是，本发明人发现，使用含有特定膳食纤维混合物的营养组 合物可以刺激自然杀伤细胞的活性。具体而言，已表明，口服补充低聚半乳糖 (galactooligosaccharide)、低聚果糖(fructooligosaccharide)和果胶降解产物的混合物能够特别增强自然杀伤细胞的活性，参见实施例。如上文所述，HIV患者的自然杀伤细胞 活性通常下降。在本申请中，令人惊奇的是，发现含有特定膳食纤维混合物的营养组合物可 以在HIV患者中显著地刺激自然杀伤细胞的活性。因此，本发明的组合物尤其适合用于在 HIV患者中对自然杀伤细胞活性的下降进行治疗。已证实，肿瘤患者和老年人的自然杀伤细胞的活性要比健康的年轻人要低。这可 能是这些患者中的几种免疫相关疾病的病因。因此，本发明含有特定膳食纤维的混合物的 营养组合物还可以用于在肿瘤患者和老年人中对自然杀伤细胞活性的下降进行治疗。
具体实施例方式自然杀伤(NK)细胞活性的下降在HIV、肿瘤和老年患者中是疾病进展的症状。本 发明的目的是提高这些人群中的NK细胞活性，从而预防疾病进展。由于NK细胞能够破坏人体中受病毒感染的细胞和癌细胞，因此预测，这些细胞在 发生病毒感染之后的疾病进展预防中起到重要作用。类似地，在肿瘤患者中，疾病进展和NK 细胞活性之间也存在着很强的联系。在这组患者中，NK细胞活性的下降使得癌细胞较快速 生长。因此，能在肿瘤患者中刺激NK细胞活性的组合物将极其有益。在HIV患者中，在血液中测量的病毒负载是在治疗期间连续测量的一个主要参 数。不受理论束缚，本发明人认为病毒负载的增加与NK细胞活性的下降相关。因此，本发 明的一个目的是为HIV患者提供能刺激NK细胞活性以降低HIV患者中的病毒负载的组合 物。因此，本发明涉及一种在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患者或老年人 中刺激自然杀伤细胞的活性的方法，所述方法包括将含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水 解产物的混合物给予所述患者或者老年人。对于一些司法体系而言，本发明可以被表述为 一种含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物用于制备用于在人免疫缺陷病毒 (HIV)感染的患者、肿瘤患者或者老年人中刺激自然杀伤细胞活性的药剂或组合物或营养 组合物的用途。本发明还可以被表述为低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物，或者含有低 聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物，它们用于在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的 患者、肿瘤患者或者老年人中刺激自然杀伤细胞的活性。在一个实施方案中，本发明用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患 者或者老年人，并且有利的是，所述治疗包括刺激自然杀伤细胞的活性或者增进对自然杀 伤细胞活性的刺激。“人免疫缺陷病毒感染的患者”是这样的一个人，其中，根据公知的标准，已确定被 HIV所感染。尽管这样的一名受试者可能并不表现出任何疾病症状或者看起来并没有生病， 但是这样的受试者还可以被称作HIV感染患者或者HIV患者。“肿瘤患者”为被诊断患有癌 症的人。“老年人”为50岁或者50岁以上的人，特别是55岁或者55岁以上的人，更特别是 60岁或者60岁以上的人，更特别是65岁或者65岁以上的人。本文在“刺激自然杀伤细胞活性”中所用的术语“刺激”是指与摄入本文所述含有 特定膳食纤维混合物的营养组合物之前的NK细胞的活性相比，NK细胞活性增加。在一个实施方案中，“刺激自然杀伤细胞活性”是指自然杀伤细胞活性的增加。 在本发明中，NK细胞活性通过商购测试试剂盒]VKT￡ST 确定，所述试剂盒由ORPEGEN
4Pharma制备。通过NKTEST ,对自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性进行了定量。在本发 明中，与摄入本文所述含有特定膳食纤维混合物的营养组合物之前的NK细胞的活性相比， 如果活性增加了至少30 %，优选如果活性增加了至少40 %，更优选如果活性增加了至少 50 %，则NK细胞活性被刺激或者有增加。在一个方面，本发明涉及一种用于在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患 者或者老年人中对自然杀伤细胞活性的下降进行治疗的方法，所述方法包括将含有低聚半 乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物给予所述患者或者老年人。对于一些司法体系而 言，本发明可被表述为一种含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物用于制备 用于在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患者或者老年人中对自然杀伤细胞活性下 降进行治疗的药剂或营养组合物的用途。本发明还可以被表述为低聚半乳糖、低聚果糖和 果胶水解产物或者含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物，它们用于在人免 疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患者或者老年人中对自然杀伤细胞活性下降进行治 疗。本文中的术语“下降”是指与健康的非老年人的NK细胞活性相比，如与年龄在 30-40岁的健康人的NK细胞活性的平均值相比较，人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤 患者或者老年人中的NK细胞活性降低。在一个实施方案中，下降是指与健康的非老年人的 NK细胞活性相比，NK细胞的活性低至少10%或者20%或者30%或者40$%。如前所述，NK 细胞的活性通过商购试剂盒NKTEST 来确定，该试剂盒由ORPEGEN Pharma制备。不受理论束缚，本发明人假定，寡糖和多糖与Toll样受体或者其他受体的结合在 刺激或者活化NK细胞的活性时起作用。已知这些受体能够结合糖结构，特别是寡糖和多 糖。该作用可能是膳食纤维特有的。膳食纤维在本说明书中使用术语“膳食纤维”时，这是指低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解 产物。本发明中所使用的膳食纤维通常不能为人的小肠所消化和吸收，并优选地，在大肠中 完全的或者部分的发酵。令人惊奇的是，发现GOS、FOS和果胶水解产物的混合物有着比单独的糖更佳的对 NK细胞活性的刺激作用。因此，本发明的组合物含有三种纤维如G0S、F0S和果胶水解产物 的混合物。优选地，GOS、FOS和果胶的比例范围为大约5-9 1 2-10。果胶被分为两大类高甲氧基化的果胶和低甲氧基化的果胶，前者的特征在于甲 氧基化程度高于50%，后者的甲氧基化程度低于50%。本文所使用的“甲氧基化程度”(也 称为DE或者“酯化程度”)旨在指多聚半乳糖醛酸链中所含有的游离羧酸基团已被酯化(如 通过甲基化)的程度。本发明的酸性寡糖优选地是由高甲氧基化的果胶制备。优选地，所 述酸性寡糖的甲基化程度高于20 %，优选高于50 %，甚至更优选高于70 %。果胶水解产物优选的给予量为IOmg-IOOg/天，优选为100mg-50g/天，甚至更优选 为 0. 5g-20g/天。膳食纤维通常具有大的分子量。优选地，所使用的纤维的平均聚合度为至少3，并 且不高于250。这是因为较小的寡糖不会结合Toll样受体，因此预测其在本发明的模型系 统中不会有效。这一要求并不暗示，不可以存在DP为1或2的寡糖。大部分可商购的寡糖 有一部分由DP为1和2的糖组成，而大部分具有3或3以上的DP。在计算寡糖级分的重量百分比时，全部寡糖(包括DP为1和2的糖)的重量均用于此计算中。因此，组合物中所 使用的纤维的总量还取决于寡糖的来源以及该来源中存在的DP为3或者3以上的寡糖的 量。约250的最大DP值关系到对粘度的作用。DP高于大约250的大分子量膳食纤维将会 显著增加液体产品的粘度，从而会导致该产品的口感降低，并且导致在生产液体产品期间 也可能存在困难。营养组合物在一个实施方案中，本发明的方法、用途或者组合物涉及(给予)一种营养组合 物。该营养组合物含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物，并且还含有蛋白、脂肪、可消 化的碳水化合物、维生素和矿物质，所述组合物含有以总的组合物计至少10能量％的乳蛋 白，优选至少15能量％的乳蛋白，并且所述组合物含有以总的组合物计10-50能量％的脂 肪，优选15-45能量％的脂肪。能量％是能量百分比的缩写，表示一种组分对所述组合物的总卡路里值有贡献的 相对量。本发明的营养组合物含有膳食纤维低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)和果胶水 解产物，因为这一组合物被证明在HIV患者中对刺激NK细胞活性极其有效，参见实施例1 的表格。蛋白优选选自乳蛋白源，例如但不限于脱脂乳、初乳、乳清、酪蛋白，全都优选来源 于牛、山羊、绵羊，更优选来源于牛，因为该蛋白来源最易得且最便宜。优选的组合物含有乳 清和酪蛋白的混合物，其中乳清/酪蛋白的比例为至少0. 1，优选至少0.3，更优选0.5，甚至 更优选至少1。肿瘤、HIV和老年患者通常食欲不振。因此，优选的组合物被充分浓缩，目的是以较 小的体积提供充足的营养组分，包括NK细胞活性的刺激纤维。这将大大地提高对产品的顺 应性，并由此提高产品的有效性。因此，本发明的液体组合物每IOOml应该含有至少8g蛋 白质、15g可消化的碳水化合物、4g脂肪和2g本发明的膳食纤维。甚至更优选地，能量密度 为至少150kcal/100ml，甚至更优选至少170kcal/100ml。此营养致密组合物所存在的一个问题在于，在灭菌之后粘度的增加。当于20°C、 以IOOiT1的剪切率测量时，粘度应该低于IOOmPa. s,优选低于60mPa. s,甚至更优选低于 40mPa.s。对于液体产品的味道和口感而言，低的粘度很重要。如果粘度太高，则顺应性将 降低。可通过两种方式获得所需粘度。一种方式是使用不会增加粘度的特定蛋白混合 物，如水解的蛋白或者酪蛋白和乳清的混合物，其中酪蛋白和乳清的比例为至少1.5(以重 量计)。另一个方案是使用粉末产品。该方案所具有的优点是所有成分均可很容易地与患 者偏爱的食品相混合。例如，在食用之前，其可与乳制品、果汁、酸奶等混合。预计，随后粘 度并没有显著的升高。此粉末组合物将可以用作补充物，并优选含有至少15重量％蛋白， 优选至少20重量％蛋白，至少5重量％脂肪，优选至少10重量％脂肪，10重量％本发明的 膳食纤维，优选至少15重量％本发明的纤维，全都以粉末总组成的重量计。膳食纤维的每日剂量优选为至少5g/天，优选至少10g，优选至少15g，甚至更优选 至少20g/天。为了预防肠胃气胀和其他不适，每日剂量的上限应该不超过75g/天，甚至更优选应该不超过50g/天。营养组合物中优选包含可消化的碳水化合物源。优选地，其提供所述营养组合物 能量的约30%至约70%。任何合适的碳水化合物(源)均可使用，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、 果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精及其混合物。优选地，液体和粉末组合物还含有维生素和矿物质的混合物。具体而言，维生素D 和锌对于NK细胞的活性很重要，优选地，其以所推荐每日剂量的上限水平存在。组合物的用涂本发明的组合物可以用于在HIV患者、肿瘤患者和老年人中治疗NK细胞活性的下 降。NK细胞活性的下降是对病毒感染的细胞或者已经恶化的细胞作出响应的能力下降的主 要症状之一。本发明组合物的其他用途如下。在HIV患者中，所述组合物可用于降低病毒的负载。具体地，对于HIV患者而言， 该组合物中含有N-乙酰基半胱氨酸是有利的。在肿瘤患者中，该组合物可以用于治疗和预防病毒感染、杀死肿瘤细胞以及巩固 化疗治疗。在化疗之后，需要NK细胞来消除残留的癌细胞。因此，本发明组合物优选在化 疗期间和之后给予。在老年人中，本发明组合物可用于治疗自然杀伤细胞活性的下降，并用于预防病 毒感染和癌症。实施例1.使用本发明的纤维混合物在HIV患者中刺激NK细胞的活性。HIV患者的治疗方案泄该研究测试纤维混合物对NK细胞活性的剂量_反应作用，该研究是随机的、双盲 的和平行组次设计方式的以安慰剂作为对照的。对每一名患者的研究持续时间为自基准时间就诊起的16周，其中有12周是给药 期。在基准时间和在基准时间之后4、12和16周进行就诊筛查。研究目的目的是在没有症状的HIV血清阳性成年人中测定每日服用口服补充物持续12周 的容忍度、安全性并建立免疫调节作用。所提供的研究产品NR100063为独立囊剂中的粉末形式，且每个囊剂有16克。该 粉末由低聚半乳糖(scGOS)、低聚果糖(IcFOS)和果胶水解产物(酸性寡糖，AOS)，麦芽糊 精和惰性糖组成，并溶于水或者果汁中，或者与酸奶混合。研究受试者每天服用总量为48克的粉末一三个囊剂一持续12周。安慰剂有着 相似数目的囊剂和产品体积，由麦芽糊精和惰性糖组成，同样也溶解于水或者果汁中，或者 与酸奶混合。研究群体未进行HAART的57名成年人(> 18岁)一HIV-I感染的男性和女性成年人一被 随机分为三组1.两个剂量(N = 19)2.单个剂量(N = 19)3.安慰剂(N = 19)
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评估在基准时间、四周、十二周和十六周采集血液，用于NK细胞活性和安全性测量。在基线时间和十二周之后收集大便样本。使用回顾性问卷在每次就诊时评估容忍度。通过计算返回的研究产品囊剂的数目在每次就诊时评估顺应性，并对产品的使用 情况进行目标评估。根据制造商的说明书，使用对自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性进行定量的测试试 剂盒(NKTEST , ORPEGEN Pharma)测量NK细胞活性。所有使用的样本均孵育4个小 时。MM NK细胞活性 结果首次表明，在接受单个剂量和两个剂量的纤维混合物GOS、FOS和果胶水解产 物的HIV患者中，在12周时，对于在组内和在与对照相比较时的两种情况下，NK细胞的活 性均显著增加(P < 0. 005)。实施例2.快速老化(fast-ageing)小鼠中NK细胞活性的刺激为了研究纤维对老龄小鼠中的NK细胞活性的影响，对8月龄快速老化的SAMP8小 鼠脾细胞中的NK细胞活性进行了测量，所述SAMP8小鼠接受了不同剂量的scGOSUcFOS和 来自果胶水解产物的酸性寡糖。用标准的啮齿动物食物使动物变老，并在最后43天接受了 增补的膳食或者对照膳食(“处理方案”)。NK细胞活性通过经改进的“JAM”分析测量。所述方法由P. Matzinger在JAM测 试中描述。使用了一种用于DNA片段化和细胞死亡的简单分析(A simple assay for DNA fragmentation 禾口 cell death. J Immunol Methods. 1991 Dec 15 ; 145(1—2) : 185—92),同 时对其改进和说明描述于此。将Yac-I细胞用作靶细胞，用2. 5microCurie/ml氚化胸苷 (Perkin Elmer, Groningen, the Netherlands)标记 4-6 小时，并以 5000 个细胞 / 孔接种 于圆底96孔板中的细胞培养基中(RPMI-1640，含10%胎牛血清)。将小鼠脾细胞加入96 孔板中作为效应细胞，三个不同的效应细胞靶细胞(E T)比例为100 1,50 1和 25 1。将效应细胞和靶细胞于37°C下在含有5%二氧化碳的空气中孵育4小时。孵育之 后，将效应细胞和靶细胞收集到Unifilter GF/c板(Perkin Elmer)上。将这些过滤板干 燥，并用闪烁计数仪(Wallac Microbeta, Perkin Elmer)计数，并将靶细胞裂解百分比如 P. Matzinger所描述的那样进行计算。并对各个E T比例进行统计学分析。MM
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对于全部三个比例，使用线性回归分析(斜率显著高于零)发现，靶细胞裂解有着 显著的剂量依赖性增加。较低的三条曲线示出这些回归，统计检验在SPSS中进行。该图示出所有效应细胞靶细胞(E T)比例和所有的GFA剂量的整体情况。可 以看出，小鼠中的NK细胞活性随着纤维剂量的增加而显著增加，表明该纤维确实可以在老 龄小鼠中刺激NK细胞的活性。

包含

有
实施例3
可用于在老年人中刺激NK细胞活性的优选组合物可以包含
蛋白
碳水化合物 脂肪
膳食纤维
24. 9能量％
38. 9能量％ 36. 2能量％ 2. 3g/100ml
20%乳清 80%酪蛋白
低聚果糖 低聚半乳糖 菊粉
0.8g/100ml 0.8g/100ml
维生素依照FSMP条例
矿物质依照FSMP条例
微量元素依照FSMP条例
能量密度介于1和2kcal/ml之间 实施例4
每IOOg干重的可以用于在HIV患者中刺激自然杀伤细胞活性的优选组合物可以
膳食纤维
5-50g
低聚果糖 低聚半乳糖 果胶水解产物 N-乙酰基半胱氨酸 碳水化合物(非膳食纤维) 脂肪 实施例5
每IOOml的可以用于在肿瘤患者中刺激自然杀伤细胞活性的优选组合物可以含
5%的总膳食纤维 45%的总膳食纤维 50%的总膳食纤维 0. 5-5g 2-20g 4-20g
蛋白
碳水化合物
脂肪
纤维
20-30能量％ 35-45能量％ 25-35能量％ 1. 5-2. 5g
低聚果糖 低聚半乳糖
5-20重量％的总纤维 80-95重量％的总纤维
矿物质400-1000mg微量元素依照FSMP条例维生素依照FSMP条例(FSMP条例是指最新的《特别医疗目的食品条例》(Food for Specical Medical Purposes regulations))
权利要求
一种含有低聚半乳糖、低聚果糖和果胶水解产物的组合物用于制备在人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿瘤患者或者老年人中刺激自然杀伤细胞的活性的组合物的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述组合物用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的患者、肿 瘤患者或者老年人。
3.权利要求1或者2任一项的用途，其中所述组合物用于在人免疫缺陷病毒(HIV)感 染的患者中刺激自然杀伤细胞的活性。
4.权利要求1-3任一项的用途，用于在HIV患者中减少病毒负载。
5.权利要求3或者4的用途，其中所述组合物还含有N-乙酰基半胱氨酸。
6.权利要求1-5任一项的用途，其中所述组合物为还含有蛋白质、脂肪、可消化的碳水 化合物、维生素和矿物质的营养组合物，所述组合物含有占所述整个组合物至少10能量％ 的乳蛋白，并且所述组合物含有占所述整个组合物10-50能量％的脂肪。
7.权利要求6的用途，其中低聚半乳糖、低聚果糖和果胶降解产物的每日剂量介于5g 至75g之间。
全文摘要
本发明涉及一种用于刺激自然杀伤细胞活性、尤其是用于在HIV感染的患者、肿瘤患者和老年人中刺激自然杀伤细胞活性的含有膳食纤维的营养组合物。
文档编号A61K31/732GK101932318SQ200980103874
公开日2010年12月29日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年2月1日
发明者A·J·M·弗里斯玛, A·L·B·范海佛特, A·P·沃斯, B·佩特派尔-范特兰德 申请人:N.V.努特里奇亚