一种爱德华氏菌的灭活方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水产养殖动物病害防治领域，尤其涉及一种爱德华氏菌的灭活方法及其灭活疫苗，即采用H+浓度范围在10-7mol/L—1mol/L的酸性溶液，在0℃—100℃下，灭活10min—48h，对爱德华氏菌进行完全灭活，与现有技术相比，本发明制备的灭活爱德华氏菌疫苗可有效维持爱德华氏菌抗原的免疫原性。
【专利说明】一种爱德华氏菌的灭活方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产养殖动物病害防治领域，尤其涉及一种爱德华氏菌的灭活方法及 其应用。
【背景技术】
[0002] 爱德华氏菌（Edwardsiella sp.)包括迟缓爱德华氏菌（E. tarda)、鲇鱼爱德华氏 菌（E. ictaluri)和保科爱德华氏菌（E.hoshinae)，是水产养殖中的主要病原菌之一，其宿 主范围十分广泛，鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及包括人类的哺乳类都有感染报道，且呈世 界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利亚、日本、印度、以色列、 马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区。从首次报道至今，该菌在多种养殖鱼 类中引发了病害并造成了巨大损失。目前在鱼类疾病防治中常采用化学治疗剂以及抗生 素，但随着它们的使用，病原耐药性也随之增强，而且药物残留和在环境中的扩散已经引起 了食品安全、环境及公共卫生方面的问题。鱼用疫苗使用后不会产生污染，不会在免疫鱼体 内形成残留，可以避免环境污染并维持鱼体本身的品质，反复使用也不会产生耐药性，应用 前景广阔。
[0003] 目前，鱼用疫苗在应用中，包括有灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗和 菌蜕疫苗等形式，其中，灭活疫苗研发周期短、制作成本低、安全性好，在免疫效率得到保证 的情况下最容易获得批准，因此成为目前商业化疫苗的最主要种类。但研究表明，爱德华氏 菌与弧菌等许多病原菌不同，采用常规技术制备的爱德华氏菌灭活疫苗对受试鱼不能产生 有效的免疫保护性。Gutierrez 和 Miyazaki (1994, Dis Aquat Org. 6:110117.)研究中福 尔马林灭活的迟缓爱德华氏菌注射免疫日本鳗的相对保护率仅为12. 5-25%，我们前期实 验采用未经优化的常规技术制作的爱德华氏菌灭活疫苗的相对保护率（RPS)也不到40% ; Mekuchi等（1995，Fish Pathol. 30(4) :251-256)分别采用肌肉注射、浸泡或口服的接种 方式用福尔马林灭活的迟缓爱德华氏菌免疫牙鲆，但均没有取得有效的免疫保护效果；Sun 等（2011，Fish Shellfish Immunol.31(4):595-599.)虽然也报道了爱德华氏菌的灭活疫 苗，爱德华氏菌的单价灭活疫苗的免疫保护率只有33. 3%，只有当灭活的爱德华氏菌与鳗 弧菌等另三种菌联合使用时，才能获得较好的免疫保护率，鳗弧菌等其他三种菌灭活疫苗 其实为爱德华氏菌灭活疫苗起到了免疫佐剂的作用。总体来说，结合我们自己的多次实验 结果以及大多数的报道，爱德华氏菌灭活疫苗的免疫效果不尽理想，这也可能是人们不得 不花更大的代价进行其他种类的疫苗的研究的原因。
[0004] 爱德华氏菌的弱毒活疫苗的应用报道中，Klesius等（2000)的发明（US Patent6153202)公开了一种鲶鱼爱德华氏菌减毒活疫苗，Evans等（2006)的发明（US Patent7067122)公开了一种基因修饰的迟缓爱德华氏菌的活疫苗，王启要等（2010)的发 明（201010541646.2)公开了一株迟缓爱德华氏菌基因缺失弱毒活疫苗。这些专利说明减 毒疫苗在爱德华氏菌疫苗研究中得到了更多的重视。减毒疫苗虽然能保证爱德华氏菌疫苗 的免疫保护率，但由于减毒疫苗仍然存在一定的生物安全风险，在安全性评价上需要更为 谨慎，使得这种疫苗研制和实现商业化的周期长，代价高。另外由于不同疫苗都存在一定的 特异性，一旦有不同种或不同血清型的爱德华氏菌的威胁，这种减毒疫苗可能就不再发挥 免疫保护作用。爱德华氏菌的其他类新型疫苗，如DNA疫苗、亚单位疫苗和菌蜕疫苗等，虽 然也具有一定的免疫效果，但考虑到生产工艺，成本，安全性等问题，上述疫苗目前也难以 投入到实际应用中。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种爱德华氏菌灭活方法及其应用，采用该方法可制备有效 维持爱德华氏菌抗原免疫原性的灭活疫苗，以克服现有技术的不足。
[0006] 本发明所述的爱德华氏菌灭活剂，即采用酸性试剂对爱德华氏菌进行灭活处理。
[0007] 优选的，对爱德华氏菌采用最低灭活强度进行灭活处理，最低灭活强度指使爱德 华氏菌得以完全灭活的最低灭活剂浓度、灭活温度和灭活时间这三种条件的组合，且三者 之间互为负相关。
[0008] 最低灭活强度为使爱德华氏菌完全灭活的最小剂量，使用最低灭活强度的目的是 灭活爱德华氏菌的同时尽可能的维持抗原的免疫原性。经上述最低灭活剂浓度、灭活温度 和灭活时间这三种条件的组合灭活处理的爱德华氏菌，经将灭活剂去除，并能使100%的处 理后的爱德华氏菌在TSB液体培养基中完全失去生长繁殖的能力，而且也无法在体内恢复 生长繁殖的能力，则视为完全灭活。这三种条件的组合关系是三者互为负相关性，形成在由 这三种条件组成的三维坐标系中的连续的近倒数关系的曲面，曲面上的具体点的确定是在 特定温度和特定时间下测定使爱德华氏菌完全灭活的最低灭活剂浓度，或特定浓度的灭活 剂在特定温度下测定使爱德华氏菌完全灭活的最短时间。本发明证实采用不同剂量的同种 灭活剂制备完全灭活疫苗的时间是不同的，两者的关系呈现负相关。
[0009] 优选的，所述酸性灭活剂为室温下H+浓度为的KTmol/L - lmol/L的酸性溶液；灭 活温度范围在〇°C - 100°C ;灭活时间范围是lOmin - 48h。
[0010] 优选地，所述灭活剂采用的灭活条件为，H+浓度为的l(T2m〇l/L的酸性溶液、灭 活温度为4°C、灭活时间为24h，或H+浓度为的ΙθΛιοΙ/L的酸性溶液、灭活温度为16°C、 灭活时间为36h，或H+浓度为的KTmol/L的酸性溶液、灭活温度为50°C、灭活时间为 20min，上述灭活方法所制备的疫苗对受试鱼可提供相对保护率（RPS)分别为62. 8%、 63. 4% -65. 7%和60. 3% -61. 2%的免疫保护效果。
[0011] 优选地，对上述灭活处理后爱德华氏菌，进行细菌是否已完全灭活检测。由于细 菌的灭活中，一些物理因素的影响，如可能存在着一些可影响灭活剂与作用效果等的可能 因子，例如灭活时不同的细菌浓度、培养基成分等可能消耗一些灭活剂的灭活效应等，因 此在实际应用中，特别是商业化大规模生产的条件下，可能会导致灭活不完全的问题从而 影响疫苗产品的质量稳定性及安全性，也因此，实际应用中有必要通过实际灭活效果的检 测（如疫苗的安全性、稳定性及应用免疫效果等），制定针对上述因素在灭活工艺的相应标 准。
[0012] 本发明证实灭活条件对爱德华氏菌灭活疫苗的免疫原性有重要影响，对爱德华氏 菌的核酸和蛋白分析表明，不同灭活条件处理对灭活疫苗的核酸完整性及蛋白结构存在有 明显的影响。以斑马鱼为模式动物进行爱德华氏菌灭活疫苗的应用试验结果，证实采用最 低灭活剂量的不同灭活剂制备的灭活疫苗能在鱼体内诱导不同抗体水平，产生不同的免疫 效果。因此，对于改变具体灭活条件制备的爱德华氏菌灭活疫苗，只要遵循最低灭活强度的 原则进行灭活疫苗的制备，并取得有效免疫保护的爱德华氏菌灭活疫苗，就仍然受到本专 利的保护。
[0013] 上述灭活方法制备灭活疫苗的免疫保护力评估可以采用以下方式，即1次免疫注 射受试鱼4周后，再用10倍半致死剂量（LD 5CI)的活的爱德华氏菌对受试鱼注射感染，较未 经灭活疫苗免疫接种的对照鱼，计算免疫组的相对保护率（RPS)。
[0014] 本发明还包括所制得的爱德华氏菌灭活疫苗在鱼类疾病防治中的应用。
[0015] 优选地，上述灭活方法所获得的灭活疫苗在使用中也可以与佐剂联合应用以达到 更好的免疫保护效果。其中，佐剂的作用是通过免疫调节、参与抗原递呈、诱导免疫应答、抗 原贮存等方式提高抗原的免疫原性和免疫反应的可持续性。可选用的常用佐剂主要有不溶 性铝盐类胶体、油水乳剂、微生物成分、核酸及其类似物、多糖类物质、细胞因子、脂质体、免 疫刺激复合物、蜂胶、中草药成分等。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制作的爱德华菌灭活疫苗是采用 最低灭活强度对爱德华氏菌进行完全灭活，能有效维持爱德华氏菌抗原的免疫保护力。初 步的应用试验结果表明该方法制备的爱德华氏菌灭活疫苗的免疫效果较好，其RPS可以达 到60%以上的效果，这一结果要明显高于使用常规灭活剂处理所得的爱德华氏菌疫苗的免 疫保护率。本发明所述的爱德华氏菌灭活疫苗符合商业化疫苗的安全、有效、实用和成本低 的要求，具有进行商业销售或直接对商业化养殖的鱼类实施免疫接种开发价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为不同灭活剂处理对E. tarda细菌基因组DNA的影响的电泳图谱；
[0018] 其中：泳道1-来苏水；泳道2-硫酸铜；泳道3-丙酮；泳道4-戊二醛；泳道5-低 pH (pH值为2);泳道6-PBS (对照）。
[0019] 图2不同灭活剂处理对E. tarda细菌蛋白的影响的电泳图谱；
[0020] 其中，Marker为分子量标记；泳道1-丙酮；泳道2-低pH (pH值为2);泳道3-来 苏水；泳道4-硫酸铜；泳道5-PBS (对照）；泳道6-戊二醛。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 实施例1 :灭活剂最低灭活剂量的确定
[0023] 迟缓爱德华氏菌可培养于LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 去离子水定容至lL，pH7.0)或胰蛋白胨大豆肉汤（TSB，胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，葡萄 糖2. 5g，NaC15. 0g，Κ2ΗΡ042· 5g，去离子水定容至1L，ρΗ7· 3)或2216E培养基中（根据培养 基成分中海水的有无，可分为两种，其一：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FeP040. lg，海水定 容至1L，pH7. 6 - 7. 8 ;其二：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FeP040. lg，NaC134g，去离子水 定容至1L，pH7. 6 -7. 8)。将对数生长期的迟缓爱德华菌以1 :100的比例接种至上述一种 培养基中，28°C恒温培养箱，180rpm振荡培养5h，6000rpm，4°C离心lOmin收集菌体，以无菌 磷酸盐缓冲液（PBS)洗涤菌体三次，并用PBS重悬菌体，制成1 X 109CFU/mL菌悬液。
[0024] 实验室灭活剂量筛选中，取96孔细胞培养板，每孔中加入200 μ L制备好的迟缓 爱德华氏菌悬液。选用的灭活剂分别为来苏水（10% )、丙酮（AR)、戊二醛（25% )、硫酸铜 (AR)和浓盐酸（36% -38% )，采用的剂量梯度如表1所示，其中，来苏水和丙酮按体积分 数计，戊二醛和硫酸铜分别按其终浓度计，浓盐酸按pH值计，4°C静置（期间多次重悬），24h 后，各孔取菌液20 μ L转接至另一 96孔细胞培养板（各孔加有新鲜200 μ L TSB培养基） 的相应孔中，28°C振荡培养过夜，以检查灭活情况。观察各孔中菌体实际生长情况（PBS组 作为对照），如原最低灭活剂浓度末能达到完全灭活的效果，则对原不同梯度中的灭活剂浓 度进行相应添加，重新进行最低灭活剂浓度的确定试验，方法同上；反之，则可依据本次试 验的结果，确定灭活剂对迟缓爱德华氏菌的最低灭活浓度。
[0025] 表1不同灭活剂使用浓度的筛选
[0026]
【权利要求】
1. 一种爱德华氏菌灭活方法，其特征在于，采用酸性试剂对爱德华氏菌进行灭活处理， 可维持爱德华氏菌抗原免疫原性。
2. 根据权利要求1所述的爱德华氏菌灭活方法，其特征在于，对爱德华氏菌采用最低 灭活强度进行灭活处理，所述最低灭活强度即为最低浓度的酸性灭活剂、最低灭活温度和 最短灭活时间之间组合，且三者之间互为负相关。
3. 如权利要求2所述的爱德华氏菌灭活方法，其特征在于，所述酸性灭活剂为室温下 H+浓度为KTmol/L - lmol/L的酸性溶液。
4. 根据权利要求3所述的爱德华氏菌灭活方法，其特征在于，所述灭活温度为0? 100。。。
5. 根据权利要求3所述的爱德华氏菌灭活方法，其特征在于，所述灭活时间为lOmin? 48h。
6. 根据权利要求1所述的爱德华氏菌的灭活方法，其特征在于，所述灭活剂为H+浓度 为l(T2m〇l/L的酸性溶液、灭活温度为4°C、灭活时间为24h，或H+浓度为l(T 4m〇l/L的酸性 溶液、灭活温度为16°C、灭活时间为36h，或H+浓度为lO^iol/L的酸性溶液、灭活温度为 50°C、灭活时间为20min。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的爱德华氏菌的灭活方法，其特征在于，对爱德华氏 菌进行灭活处理后检测爱德华氏菌是否已完全灭活。
8. 根据权利要求1-6任一项所述的爱德华氏菌的灭活方法所制得的灭活疫苗在鱼类 疾病防治中的应用。
9. 根据权利要求8所述的爱德华氏菌灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗可以与一 种或多种佐剂联合使用。
10. 根据权利要求9所述的爱德华氏菌灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为不溶性铝盐 类胶体、油水乳剂、微生物成分、核酸及其类似物、多糖类物质、细胞因子、脂质体、免疫刺激 复合物、蜂胶或中草药成分。
【文档编号】A61P31/04GK104140940SQ201410350754
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】黄倢, 隋虎辰, 谢国驷, 王秀华, 杜迎彬, 史成银 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所