生物组织的处理方法

生物组织的处理方法
【专利摘要】本发明描述一种生物组织的处理方法，具体地说，描述了处理医用组织的方法，所述医用组织特别是用于人造心瓣膜的组织，其中所述方法至少包括下列步骤：用去垢剂为所述组织脱细胞，接着用适当的交联剂使所述组织的胶原纤维交联。将至少一种脂肽如枯草菌表面活素用作脱细胞用的去垢剂。
【专利说明】生物组织的处理方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种处理医用组织的方法，所述医用组织特别是用于人造心瓣膜的组织，其中所述方法至少包括下列步骤:
[0002]用适当的去垢剂为所述组织脱细胞，接着
[0003]用适当的交联剂使所述组织的胶原纤维交联。
[0004]下面以用于人造心瓣膜的组织的处理方法为例对本发明进行说明。本发明虽然特别适合用来处理此类组织，但并不限于这一应用。本发明也适用于血管、骨软骨、韧带或类似之物的处理。
[0005]本发明还涉及至少一种含脂肽溶液的用途。

【背景技术】
[0006]原则上存在两种不同的心瓣膜假体类型:一类是机械瓣膜假体，大多是用涂有热解碳的石墨人工制成，另一类假体的瓣膜由生物组织构成，大多为心包组织，多数来源于动物(例如猪或牛)。由生物组织形成的心瓣膜大多被固定在一基体(例如固定的塑料架或自膨胀支架)中，再将该基体植入在天然瓣膜位置上。本发明描述的就是被植入天然心瓣膜位置上的心瓣膜假体所使用的这样一种组织的处理方法。
[0007]原始组织须在植入前加以彻底的提纯与处理。在此过程中尽可能将组织改性，使其不会被人体识别成外来组织，不会钙化并具有尽可能长的使用寿命。这种组织处理方法基本上包括至少两个主要步骤及数个穿插于其间的冲洗过程。
[0008]第一个主要处理步骤就是所谓的组织脱细胞。这个步骤尽可能彻底地移除组织中的细胞膜、胞内蛋白、细胞核及其他细胞成分，以便获得尽可能纯的细胞外基质。残留于组织内的细胞和细胞成分是强力籽晶，会使生物植入材料发生非期望钙化。应当尽可能温和地实施作为清洗步骤的脱细胞处理，使得细胞外基质中的结构和胶原纤维尽可能不受影响，而另一方面则需彻底移除组织中所包含的所有细胞。
[0009]第二个主要处理步骤是组织交联，特别是使组织的胶原纤维交联。脱细胞之后组织中已尽可能移除所有的细胞成分，生物材料几乎仅由细胞外基质构成。心包组织的细胞外基质主要由胶原纤维构成。为了使生物材料获得尽可能最佳的机械性能并防止受体出现防御反应，通过用适当的交联剂嵌入化学键来使胶原纤维交联。交联剂结合到胶原纤维的氨基上并在胶原纤维之间建立化学稳定的连接。三维分布的胶原纤维由此形成长期稳定的生物材料，从而不再被识别成外来生物材料。用交联剂使单个胶原纤维三维交联或联结能显著提高组织的稳定性和强度。这在用作心瓣膜组织的情况下特别具有决定性意义，因为组织作为瓣膜须在一秒钟内打开和关闭一次。
[0010]WO 2004/052417描述一种替代性的生物组织处理方法。这种属于现有技术的方法用1-2%浓度的脱氧胆酸溶液为组织脱细胞。实施过数个冲洗步骤后在含有环脂肽的溶液中进行组织调整。在完成脱细胞之后、进行细胞再定植之前，主要将环脂肽枯草菌表面活素用作调整剂。现有技术中的这种替代性方法不用适当的交联剂来使胶原纤维交联。完成调整后在组织中定植天然细胞。
[0011]WO 2011/109433揭示一种用蒸馏水脱细胞的生物组织处理方法。在之后的步骤中使用戊二醛作为交联剂。
[0012]WO 2005/118014揭示使用第一离子型去垢剂和第二非离子型去垢剂来脱细胞。其建议优选将阴离子型去垢剂如十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠用作第一离子型去垢剂。作为替代方案，可以将胆汁酸如胆酸钠或脱氧胆酸钠用作第一去垢剂。第二去垢剂不带电荷，例如含有聚乙二醇的去垢剂。


【发明内容】

[0013]有鉴于此，本发明的目的是设计一种生物组织处理方法，能够彻底而温和地移除组织中的细胞成分，并在之后的交联中形成机械稳定且耐用的组织，该组织特别适合用作人造心瓣膜组织。
[0014]本发明的另一目的是找到包含至少一种脂肽的溶液的新用途。
[0015]在方法方面，本发明用以达成上述目的的解决方案是权利要求1的特征组合。在用途方面，本发明用以达成上述目的的解决方案是权利要求6的特征组合。本发明的有益技术方案详列于从属权利要求。
[0016]本发明的基本构思是将脂肽作为脱细胞用的去垢剂。根据本发明的构思，含有β羟基脂肪酸或β氨基脂肪酸的肽、脂肽并非用于调整，而是作为脱细胞用的去垢剂。出人意料的是，脂肽显示出突出的组织脱细胞效果。组织被以温和得多的方式去除细胞成分。与现有技术中的去垢剂相比，使用本发明的脱细胞用去垢剂时，细胞外基质的结构明显更好地得以保持。因此，本发明的去垢剂包含至少一种两亲性脂肽，所述脂肽由亲水性基本结构和疏水性侧链构成。由此就能通过后续交联步骤获得一组织，该组织的机械性能远好于现有技术，因而特别适用于心瓣膜假体。
[0017]特别优选地，所述脱细胞用的去垢剂包含环状脂类七肽(zyklischesLipoheptapeptid),特别是枯草菌表面活素。本发明的这个优选技术方案用含有枯草菌表面活素的去垢剂脱细胞。特定而言，该去垢剂包含具有下述环状结构的枯草菌表面活素:
[0018](CH3) 2-CH- (CH2) η — CH-CH2-C0 — L-Glu — L-Leu — D-Leu — L-Val — L-Asp — D-Leu—L-Leu — O
[0019]其中，n= 10_12，Glu、Leu、Val、Asp代表谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸和天门冬氨酸几种氨基酸。
[0020]同样有益的脂肽例如有达托霉素、卡泊芬净、节活性素(Arth1factin)、棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringop印tid和/或多粘菌素。合理地，所述去垢剂包含至少一种选自以下清单的脂肽:枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素或棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringop印tid、多粘菌素群组。
[0021]所述交联剂优选包含戊二醛。在本发明的替代技术方案中，所述交联剂包含碳二亚胺、甲醛、戊二醛缩醛、酰基叠氮、氰亚胺、京尼平、单宁、五没食子酰葡萄糖、植酸、原花色素、罗氏菌素和/或环氧化合物。
[0022]优选在脱细胞之前，特别优选在脱细胞之后，用适当的溶剂特别是缓冲盐溶液和/或醇溶液冲洗所述组织至少一次，优选多次。
[0023]其中，特别有益的是缓冲氯化钠溶液和/或乙醇溶液。
[0024]特别优选地，所述去垢剂由缓冲液构成，特别优选由pH值优选为7.4的磷酸缓冲液构成，该缓冲液以100mg/l至2000mg/l,优选500mg/l至700mg/l,特别优选600mg/l的浓度包含所述脂肽特别是枯草菌表面活素。其中，将不含钙镁的杜氏磷酸缓冲液(DPBS)用作枯草菌表面活素去垢剂的载体溶液是特别有益的。同样有益的其他生物缓冲液例如有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液或2-[4-(2_羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)缓冲液。
[0025]本发明还涉及一种溶液的用途，所述溶液包含至少一种两亲性脂肽，所述脂肽由亲水性基本结构和疏水性侧链构成，所述溶液用作为生物组织特别是心瓣膜假体用生物组织脱细胞的去垢剂。根据本发明，包含至少一种脂肽的溶液并非用于调整，而是用于生物组织的脱细胞与提纯。
[0026]出人意料的发现是，含有脂肽的溶液能彻底而温和地为生物组织脱细胞。
[0027]将至少包含枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素、棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringop印tid和/或多粘菌素的溶液用作为生物组织脱细胞的去垢剂是特别有益的。
[0028]其中，枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素和/或棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringopeptid、多粘菌素优选溶解在缓冲液特别是磷酸缓冲液中。TRIS缓冲液或HEPES缓冲液也是有益的。
[0029]本发明特别提供一种处理生物组织的方法，该方法能确保彻底而可靠地脱细胞，同时以组织友好的方式脱细胞，使得组织的机械性能在脱细胞和交联后相对于现有技术得到显著改善。
[0030]本发明处理生物组织特别是处理心瓣膜假体用生物组织的方法将临床应用时组织(和假体)钙化的风险降至最低。本发明所使用的脱细胞用去垢剂能对组织性能产生决定性的有益影响。经按本发明方法处理的组织显示出显著改善的机械强度。

【具体实施方式】
[0031]下面借助图示实施例详细说明本发明，并将本发明与现有技术中的方法进行比较。
[0032]在本发明的实施例中，通过机械移除附着的外来组织以及随后在等渗盐水(Fresenius-Kabi公司)中冲洗20小时来获得由猪心包组织构成的生物组织。用去垢剂为该组织脱细胞，所述去垢剂由不含钙/镁的DPBS溶液(Lonza公司；DPBS w/o Ca++/Mg++ ；货号17-512)和浓度为600mg/l的枯草菌表面活素(Sigma-Aldrich公司，源自枯草芽孢杆菌的枯草菌表面活素，货号F3523)构成。
[0033]将本发明的上述实施例与现有技术中的两种去垢剂进行比较。
[0034]在根据现有技术的第一实例中，用含有浓度为5g/l的十二烷基硫酸钠(SDS ；Sigma-Aldrich公司，货号L3771)的去垢剂为生物组织脱细胞。此处使用的溶剂同样是不含钙 / 镁的 DPBS 溶液(Lonza 公司；DPBS w/o Ca++/Mg++ ;货号 17-512)。
[0035]在根据现有技术的第二实例中，用含有浓度为10g/l的脱氧胆酸(DCA ；Sigma-Aldrich公司，货号D6750)的去垢剂为生物组织脱细胞。此处使用等渗盐水(Fresenius-Kabi公司)作为溶剂。
[0036]图1是本发明实施例与现有技术两个实例之间关于脱细胞后DNA含量的对比图。图1中的纵坐标是脱细胞后心包组织DNA含量在脱细胞前的原始DNA含量中所占的百分t匕。所标注的DNA含量分别是生物组织在相应的清洗溶液中放置I小时、3小时和20小时后的DNA含量。根据DNA含量可以直接判断出生物组织中细胞成分的移除程度。
[0037]通过用含有DCA的去垢剂来脱细胞，可以在三小时后将DNA含量减小至4%左右。如图1所示，在本发明实施例的含枯草菌表面活素去垢剂中经过20小时后，可以将DNA含量减小至一个相似的值。利用枯草菌表面活素在20小时内达到的心包组织脱细胞度与利用脱氧胆酸达到的脱细胞度相似。关于含SDS去垢剂的DNA含量值在此只在一定条件下具有可比性，因为SDS会引发非常强烈的蛋白结构变化，在脱细胞效果明显可见的情况下，检测方法会严重损坏DNA。
[0038]本发明方法相对于现有技术中的脱细胞过程的重要优势由接下来的图2至图3d示出。
[0039]图2中的纵坐标(标度增大，坐标原点未绘示)是脱细胞组织经用上述三种去垢剂处理后的皱缩温度(shrinkage temperature)及其与原生组织皱缩温度的对比。
[0040]由于胶原蛋白在心包组织的细胞外基质中占主导份额，皱缩温度是胶原蛋白发生热变性(即不可逆地改变其空间结构)的温度。胶原分子的结构变化致使组织中发生大规模的不可逆的结构变化，组织在达到皱缩温度时明显可见地变小。
[0041]通过实验以差示扫描量热法(DSC)测定皱缩温度。该方法是待测量试样的温度随时间呈线性提高，并以参比试样为参照测量进出试样的热流。如果试样中出现热力学过程，例如胶原蛋白不可逆的结构变化，测量到的热像图中就会出现明显的皱缩温度峰值。根据皱缩温度的高低可以直接判断出胶原分子空间结构的稳定性。因此，若相对于原生组织状态发生尽可能小的变化，这在分子水平上可以直接证明枯草菌表面活素的脱细胞方式温和得多。
[0042]从图2中可以清楚看到，心包组织在按本发明实施例脱细胞后的皱缩温度与未经处理的原生心包组织的皱缩温度几乎一样。而现有技术中用DCA和SDS实施的两个脱细胞实施例导致皱缩温度明显下降3°C和5°C，从而导致组织结构明显受损。因此，原生生物组织和经过本发明脱细胞处理后的组织的机械性能极为相似。因此可以证实，本发明的方法可以极为温和地完成脱细胞。
[0043]原生组织和经用上述去垢剂脱细胞后的组织如图3a至图3d所示的电子显微图像也显示了组织结构的不同受损程度。
[0044]比较图3a所示的原生组织与图3b所示的根据本发明上述实施例的脱细胞组织可以发现，其图像高度相似。两份组织均具有大量彼此分离的胶原纤维和胶原链。
[0045]与此相比，图3c和图3d所示的组织在用现有技术的上述去垢剂脱细胞后发生了明显变化。尤其是较小的胶原纤维倾向于积聚在一起。如此一来，组织结构会发生明显变化，在电子显微图像中显得紧凑许多。
[0046]图4为本发明的植入用生物组织处理方法的完整流程图。
[0047]步骤I是从屠宰场的猪身上提取心包并将该心包在4°C的温度下在无菌等渗氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)中放置2小时。该溶液除氯化钠外还含有用来杀死细菌的青霉素和/或链霉素。
[0048]步骤2是在氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)中湿式解剖组织。也就是将心包的两瓣分离，小心移除附着的脂肪组织和结缔组织，切割组织使其在大小和形状上与预期用途匹配。
[0049]步骤3是在轻微移动组织的情况下用氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)冲洗，之后在步骤4中为组织脱细胞。
[0050]用去垢剂实施步骤4中的脱细胞，该去垢剂由含有枯草菌表面活素的缓冲液构成。在本发明的这个实施例中，将浓度为600mg/l的枯草菌表面活素(Sigma-Aldrich公司，源自枯草芽孢杆菌的枯草菌表面活素，货号F3523)溶解在DPBS磷酸缓冲液(Lonza公司；DPBS w/o Ca++/Mg++;货号17-512)中。组织在37°C下在该清洗溶液中停留20小时。在此之后，组织中所包含的细胞成分几乎全部被移除，胶原纤维结构却未发生显著变化。
[0051]在接下来的步骤5、6和7中用无菌溶液彻底冲洗脱细胞组织。步骤5是在室温下边轻微移动组织边用10ml氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)冲洗组织。在本发明的这个实施例中，步骤5实施10分钟，反复实施8次。随后的步骤6是在37°C下用10ml浓度为70%的乙醇溶液冲洗10分钟。在接下来的步骤7中，继续边轻微移动边用10ml氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)冲洗。
[0052]步骤8是用交联剂使胶原纤维交联。在本发明的这个实施例中，将组织在4°C的温度下在PH值为7.4的含有戊二醛(Sigma-Aldrich公司，货号F5882)的溶液中放置48小时。该含有戊二醛的溶液由以6g/l的浓度溶解在不含钙镁的DPBS(Lonza公司；DPBS w/oCa++/Mg++ ;货号17-512)中的戊二醛构成。
[0053]步骤9是在室温下重复步骤8。步骤9实施14天，其中每48小时更换一次溶液。
[0054]在步骤10中实施过冲洗过程后，可将组织放置在戊二醛中或者在步骤11中加以进一步处理。在本发明的这个实施例中，步骤10是在室温下边轻微移动组织边用10ml氯化钠溶液(9g/l ；Fresenius-Kabi公司)冲洗20分钟，冲洗6次。
[0055]这里所描述的实施例用以说明本发明。冲洗步骤的数目和/或具体设计(特别指冲洗用溶液或缓冲液的浓度和组成)可由本领域技术人员在其认识范围内加以改动。
【权利要求】
1.一种处理医用组织的方法，所述医用组织特别是用于人造心瓣膜的组织，其中所述方法至少包括下列步骤:用去垢剂为所述组织脱细胞，接着用适当的交联剂使所述组织的胶原纤维交联，其特征在于，所述脱细胞用的去垢剂包含至少一种两亲性脂肽，所述脂肽由亲水性基本结构和疏水性侧链构成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱细胞用的去垢剂包含环脂肽，特别是枯草菌表面活素。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述去垢剂包含枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素、棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringop印tid和/或多粘菌素。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联剂包含戊二醛、碳二亚胺、甲醛、戊二醛缩醛、酰基叠氮、氰亚胺、京尼平、单宁、五没食子酰葡萄糖、植酸、原花色素、罗氏菌素和/或环氧化合物。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在脱细胞之前和/或之后用适当的溶液特别是盐溶液和/或醇溶液冲洗所述组织至少一次。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述去垢剂由缓冲液特别是磷酸缓冲液构成，所述缓冲液以100mg/l至2000mg/l,优选500mg/l至700mg/l,特别优选600mg/l的浓度包含至少一种脂肽特别是枯草菌表面活素。
7.一种溶液的用途，所述溶液包含至少一种两亲性脂肽，所述脂肽由亲水性基本结构和疏水性侧链构成，所述溶液用作为生物组织特别是心瓣膜假体用生物组织脱细胞的去垢剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述溶液至少包含枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素、棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringop印tid和/或多粘菌素。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，枯草菌表面活素、达托霉素、卡泊芬净、节活性素和/或棘白菌素、伊枯草菌素、丁香霉素、Syringopeptid、多粘菌素溶解在缓冲液特别是磷酸缓冲液中。
【文档编号】A61L27/36GK104338180SQ201410352864
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】亚历山大·里查尼, 威赫勒姆·艾德布吕埃格尔 申请人:百多力股份公司