一种治疗白血病的中药提取物及其制备工艺和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种治疗白血病的中药提取物及其制备工艺和应用，所述的中药提取物为胃友果提取物。本发明涉及的中药提取物由单一的中草药胃友果制备而成，其通过诱导白血病细胞凋亡的机制抑制其增值，从而可开发成治疗白血病的药物。
【专利说明】一种治疗白血病的中药提取物及其制备工艺和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物提取【技术领域】，涉及一种治疗白血病的中药提取物及其制备工艺 和应用。
【背景技术】
[0002] 白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤，是一类起源于造血(或淋 巴）干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增 值与分化能力不平衡，而停止在细胞发育的不同阶段，具体表现为细胞在体内无限增值，而 其分化成熟和凋亡受阻。因此，白血病的治疗可从三个方面入手：诱导细胞凋亡、诱导细胞 分化及干细胞移植重建造血功能。迄今白血病的治疗仍主要采用传统的联合化疗，但此疗 法副作用甚大，复发率高，尤其对机体免疫与造血系统有较大的损害。
[0003] 胃友果为黄杨科植物野扇花Sarcococca ruscifolia Stapf的果实。野扇花为常 绿灌木，高l_4m。有发达的纤维状根系。分枝较密，小枝被密或疏短柔毛。叶互生；叶柄长 3-6mm;叶片阔椭圆状卵形、卵形、椭圆状披针形、披针形或狭披外形，长2-7cm，宽7-30mm， 变化很大，但常见为卵形或椭圆状披针形，长3. 5-5. 5cm，宽10-25mm，先端急尖或渐尖，基 部急尖或渐狭或圆，一般中部或中部以下较宽，上面亮绿，下面淡绿，叶面中脉凸出，无毛， 稀被微细毛；大多数中脉近基部有1对互生或对生侧脉，多少成离基三出脉，叶背中脉稍平 或凸出。花单性，雌雄同序，花序短总状，长l-2cm，花序轴被微细毛；苞片披针形或卵状披 针形；花白色，芳香；雄花2-7,占花序轴上方大部，通常下方雄花有长约2_的花梗，具2小 苞片，小苞片卵形，长为萼片的1/3-2/3,上方雄花近无梗，有的无小苞片，萼片4 (亦有3或 5)，内方的阔椭圆形式阔卵形，先端圆，具小纤毛，长3-3. 5mm，花丝白色，长约6mm，花药黄 色，背部着生，不育雌蕊细小，扁平；雌花2-5,生花序轴下部，连柄长6-8mm，柄上小苞多片， 狭卵形，覆瓦状排列，萼片6,长1. 5-2_，子房卵状长圆形，花枝3。核果球形，直径7-8_， 熟时猩红至暗红色，宿存花技3或2,长2mm。花、果期10月至翌年2月。
[0004] 目前，该药材被报道具有养肝安神的功效，主要用来治疗头晕、目花、心悸、夜眠不 安，尚无文献报道胃友果或其提取物具有治疗白血病的功效。
【发明内容】
[0005] 基于细胞的程序化死亡的研究，本发明的目的在于提供一种治疗白血病的中药提 取物及其制备工艺和应用。
[0006] 为了实现本能发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如 下技术方案： 一种治疗白血病的中药提取物，所述的中药提取物为胃友果提取物。
[0007] 本发明所述中药提取物的制备工艺，该工艺包括如下步骤：取胃友果原料，置提取 装置中，以甲醇加热回流提取，所得醇提液回收甲醇并继续浓缩成膏状，加水混悬，以氯仿 萃取，对萃取液回收氯仿并继续浓缩成稠膏，干燥。
[0008] 在上述治疗白血病的中药提取物的制备工艺中，优选甲醇加热回流提取1-3次， 每次甲醇的用量为原料的4-10倍，每次回流提取的时间为3_6h。
[0009] 另外，在上述治疗白血病的中药提取物的制备工艺中，优选所述的氯仿萃取步骤 为等体积萃取。
[0010] 再次，在上述治疗白血病的中药提取物的制备工艺中，优选所述的干燥步骤为冷 冻干燥或72°C以下减压干燥。
[0011] 本发明人以人慢性髓系白血病细胞株K562细胞为模型探索胃友果提取物的体外 抗白血病作用，采用MTT法检测结果显示，不同浓度胃友果提取物作用于K562细胞一定时 间后，表现出明显的增殖抑制作用，白血病细胞毒效果显著，并呈现剂量-效应关系和时 间-效应关系。这预示着胃友果提取物具有体外抗白血病的生物活性。另外，形态学观察显 示，Hoechst 33342荧光染色下，可见空白对照组K562细胞核呈圆形或肾形，大小一致，染 色质分布均匀、疏松，发出均匀蓝色荧光；经不同浓度胃友果提取物处理后，核形态不规则， 核内染色质明显缩小，呈致密浓染的蓝色荧光团块；尤其是150 μ g/mL浓度作用后，核裂解 成碎片，染色质聚集，细胞呈明显凋亡形态。这表明胃友果提取物能够诱导K562细胞发生 凋亡。
[0012] 由此可见，胃友果提取物对人慢性髓系白血病K562细胞有增殖抑制作用，能促进 凋亡的发生，损伤线粒体诱导凋亡可能是其作用机制之一。因此，本发明的另一个目的在于 提供一种制药用途，即：上述的胃友果提取物在制备抑制白血病细胞增殖的药物中的应用。 或者：上所述的胃友果提取物在制备诱导白血病细胞凋亡的药物中的应用。或者：上述的 胃友果提取物在制备治疗白血病的药物中的应用。
[0013] 与现有技术相比，本发明涉及的中药提取物由单一的中草药胃友果制备而成，其 通过诱导白血病细胞凋亡的机制抑制其增值，从而可开发成治疗白血病的药物。另外，该提 取物来源于天然植物，因此毒副作用低，属于"绿色治疗药物"的范畴。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1不同浓度胃友果提取物对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的抑制率曲线 图。
[0016]
【具体实施方式】
[0017] 以下是本发明胃友果提取物的制备实施例和效果试验例，对本发明做进一步说 明。但是，本发明的保护范围并不受限于以下实施例，凡是基于本发明上述内容所实现的技 术均属于本发明的范围。
[0018] 实施例1胃友果提取物干粉的制备 取胃友果药材lkg，置圆底烧瓶中，分别加甲醇约6L，加热回流提取2次，每次5h，合并 2次醇提液，滤过，回收甲醇并继续浓缩成膏状，加入适量水，混悬，总体积约500mL，用氯仿 进行提取，每次用量为500mL，均萃取3遍，经提取得到氯仿提取液，然后对提取液回收氯仿 并继续浓缩成稠膏，70°C减压干燥，粉碎成细粉，即得。
[0019] 实施例2胃友果提取物对K562细胞增殖的影响试验研究 将人慢性髓系白血病K562细胞接种于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基的细 胞培养瓶中，在37°C恒温、5% C02、相对饱和湿度的条件下放置培养箱中培养，每1?2d换 液传代1次。取对数生长期且生长状态良好的细胞进行试验。
[0020] 取对数期生长的K562细胞，将细胞浓度调整为1X105 / mL，分别加入不同浓度 (60、90、120、150、180yg / mL)的胃友果提取物，轻轻吹打均匀后，接种于96孔板，100μ?7 孔，同时设空白对照组（加入等体积含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基）每组4个复孔， 分别培养24、48、72 h后，加入MTT(5mg / mL)溶液20yL /孔，继续培养4h后，每孔加入 三联液100 μ L终止反应，37°C继续培养16?18 h，用酶标仪在570nm波长处检测各孔光密 度值D( λ)值，计算肿瘤细胞生长抑制率。实验重复3次。
[0021] 生长抑制率（％ ) ={1-[ DU)药物组-DU)对照组]/ DU)对照组}Χ100% 不同浓度胃友果提取物作用于Κ562细胞24、48、72 h后增殖抑制作用如图1所示： 当lSOyg/mL胃友果提取物作用K562细胞24h，其抑制率为（52.06±4.82)% ;72 h达到 (92. 81 ± 25. 16) %，与对照组比较P〈0. 05，有显著差异，显示胃友果提取物在体外对白血病 K562细胞有抑制作用。
[0022] 总之，通过图1的细胞增殖抑制率曲线图可以看出，在每个时间点，伴随胃友果提 取物浓度的增加，细胞增殖速度减缓，增殖抑制率显著升高，表明胃友果提取物对人慢性髓 系白血病K562细胞的生长有抑制作用，并呈现剂量-效应关系。在同一给药浓度下，增殖 抑制率与作用时间呈正相关，表现出明显的时间-效应关系。该实验结果显示，胃友果提取 物对白血病细胞生长抑制呈现浓度和时间的依赖性。
[0023] 实施例3胃友果提取物诱导K562细胞凋亡的试验研究 取对数期生长的人慢性髓系白血病K562细胞，以IX 105 / mL的浓度接种于6孔板 中，加入不同浓度（90、120、150μ8 / mL)的胃友果提取物后孵育12 h，收集细胞，冷PBS洗 2次，离心后将细胞重悬于PBS中，加入Hoechst 33342荧光染液避光染色lOmin，离心，力口 PBS重悬，涂片，在荧光显微镜下观察细胞核的改变。
[0024] 结果显示，Hoechst 33342荧光染色下，可见空白对照组K562细胞核呈圆形或肾 形，大小一致，染色质分布均匀、疏松，发出均匀蓝色荧光；经不同浓度胃友果提取物处理 后，核形态不规则，核内染色质明显缩小，呈致密浓染的蓝色荧光团块；尤其是150 μ g/mL 浓度作用后，核裂解成碎片，染色质聚集，细胞呈明显凋亡形态。
【权利要求】
1. 一种治疗白血病的中药提取物，其特征在于：所述的中药提取物为胃友果提取物。
2. -种根据权利要求1所述治疗白血病的中药提取物的制备工艺，其特征在于该工艺 包括如下步骤：取胃友果原料，置提取装置中，以甲醇加热回流提取，所得醇提液回收甲醇 并继续浓缩成膏状，加水混悬，以氯仿萃取，对萃取液回收氯仿并继续浓缩成稠膏，干燥。
3. 根据权利要求2所述治疗白血病的中药提取物的制备工艺，其特征在于：甲醇加热 回流提取1-3次，每次甲醇的用量为原料的4-10倍，每次回流提取的时间为3-6h。
4. 根据权利要求2所述治疗白血病的中药提取物的制备工艺，其特征在于：所述的氯 仿萃取步骤为等体积萃取。
5. 根据权利要求2所述治疗白血病的中药提取物的制备工艺，其特征在于：所述的干 燥步骤为冷冻干燥或72°C以下减压干燥。
6. 权利要求1所述的胃友果提取物在制备抑制白血病细胞增殖的药物中的应用。
7. 权利要求1所述的胃友果提取物在制备诱导白血病细胞凋亡的药物中的应用。
8. 权利要求1所述的胃友果提取物在制备治疗白血病的药物中的应用。
【文档编号】A61K36/185GK104147061SQ201410443660
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】李健 申请人:李健