Linc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途
【专利摘要】本发明涉及Linc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途。具体地，本发明涉及Linc-RAM在制备治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤的药物中的用途。本发明还涉及Linc-RAM制备促进肌肉干细胞分化的药物中的用途，制备促进成纤维细胞转变为成肌细胞试剂及药物中的用途。
【专利说明】L i nc-RAM在治疗肌肉疾病中的用途
【技术领域】
[0001] Linc-RAM是本发明人首次鉴定并对其功能和分子机制进行研究，本发明涉及 Linc-RAM在治疗肌肉疾病，特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤的作用。
【背景技术】
[0002] 骨骼肌是人体最大的组织器官，约占体重的40%，在生物体的生命活动中起着非 常重要的作用。它不仅发挥运动和支持的功能，同时它也是一个重要的代谢器官。身体所 摄取的糖和脂类物质大多在骨骼肌中代谢产生能量，这对维持整个身体的平衡状态起着非 常重要的作用。骨骼肌的发生是一个有序和严格调控的过程，不仅受各种肌肉特异性转录 因子的调控，同时受到ncRNAs以及染色质修饰和重塑等表观遗传的精细调控。
[0003] 在众多的肌肉疾病中，如周期性瘫痪、肌营养不良、肌炎等都存在不同程度的肌肉 损伤，目前的治疗药物较少、副作用较大，效果较差。如杜氏肌营养不良症（DMD)，是一种性 联隐性遗传病，又名为假性肥大型肌肉萎缩症，为症状最严重的肌肉萎缩症。由于基因突 变缺陷导致肌肉细胞不能正常产生一种称为抗肌萎缩蛋白（Dystrophin)的蛋白质，会使 钙离子渗入细胞，引发瀑布反应，导致患者全身肌肉无力，又因肌肉细胞内缺少抗肌萎缩蛋 白，导致细胞组织肌肉纤维变得无力且脆弱，其肌细胞不断地处于损伤修复过程中,经长期 的伸展后该缺失肌肉细胞组织将产生机械性伤害等因素而破坏，最终导致肌肉细胞死亡。 全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病，患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化 出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到 20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。目前针对该病，医学界尚无有效疗法。
[0004] 近年来，将成体干细胞植入DMD肌肉疾病的小鼠体内，取得显著治疗效果， 参见 Benchaouir R，Meregalli M，Farini A，D'Antona G，Belicchi M，Goyenvalle A, Bat t i ste 11 i M,Bresolin N,Bottinelli R,Garcia L, Torrente Y.Cell Stem Cell. Restoration of human dystrophin following transplantation of exon-skipping-engineered DMD patient stem cellsinto dystrophic mice. 2007, 1 (6) :646-57。但是成肌细胞移植治疗存在着排异反应以及差的细胞生存率等 局限性，Partridge TA. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 2002, 9(11) :752-3。利用基因治疗将肌萎缩蛋白（Dystrophin)导入患者体内， 使之表达肌萎缩蛋白，具体实施非常困难，主要是因为携带DNA片段较大且要将它们置于 大基因组的正确的位置，且外源DNA需先转录mRNA后再翻译为目的蛋白，此过程会受到体 内各种机制的调节和影响。因而寻找到直接用于基因治疗的核酸类药物更容易治疗或缓解 疾病的效果。
[0005] 此外，横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma)是发生自胚胎间叶组织的一种恶性肿 瘤，其细胞类似于成肌细胞（myoblast)，大多数的横纹肌肉瘤细胞表达生肌决定因子 (myogenic differentiation l，MyoD)，然而横纹肌肉瘤细胞却不具备从增殖至终末分化 的能力，因而无限增殖，形成恶性肿瘤。横纹肌肉瘤占儿童实体肿瘤的15%，软组织肉瘤的 50%。临床表现的多样性、病理改变的多重性以及发病部位的不同，使横纹肌肉瘤成为小儿 肿瘤中最复杂的一种。横纹肌肉瘤分成以下4种亚型：胚胎型、腺泡型、葡萄簇型和多形型。 早期的根治性手术方法包括截肢、骨盆及眼眶肿瘤剜除术。在过去的几十年里，针对肿瘤的 不同发生部位及其扩展的范围采用化疗、放疗与手术相结合的措施，患者的生存率有了显 著地提高，由于横纹肌肉瘤的治疗具有特征性，即外科及放射的局部治疗往往达不到长期 生存的目的，只有应用全身性化疗才能明显提高生存率，这种全身性的化疗对人体产生极 大的危害。
[0006] 因此，寻找抑制横纹肌肉瘤细胞增殖，且降低对病人身体伤害的药物成为当今癌 症治疗的研究热点，目前，已有报道表明anti-miR-122在美国已经获准进入临床治疗肝 癌，提示越来越多的核酸类药物进入临床应用的可能性，且核酸类药物因其自身的使用方 便，容易大量生产，特异性强等特点，为临床用药的选择提供了潜能。
[0007] 长链非编码RNA(long non-coding RNA, IncRNA)广泛存在于各种生物体中， 参见 Stefani G, Slack FJ_ Small non-coding RNAs in animal development· Nat Rev Mol Cell Biol. 2008,9(3):219-30。绝大多数由RNA聚合酶II转录并经可变剪接而来。 IncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形 式在多种层面上，如表观遗传调控、参见Mazo A, Hodgson JW，Petruk S，Sedkov Y, Brock HW. Transcriptional interference:an unexpected layer of complexity in gene regulation. J Cell Sci. 2007, 120(Pt 16):2755-61 ；Katayama S, Tomaru Y, Kasukawa T, ffaki K, Nakanishi M, Nakamura M, et al.Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science, 2005, 309 (5740) : 1564-6。转录调控以及转录后调控等调控基因 的表达水平。
[0008] 最近的研究表明，一些IncRNAs参与调控骨骼肌发育过程中重要的转录因子 和信号分子的表达，从而调控骨骼肌细胞的增殖和分化。如，Myostain处理小鼠后， Malatl在腓肠肌中的表达水平显著下调，进一步研究发现在C2C12细胞和原代骨骼肌 细胞分化时Malat 1 mRNA的表达上调，敲除Malat 1后，细胞增殖受到抑制，参见Watts R, Johnsen VL, Shearer J, Hittel DS Myostatin-induced inhibition of the long noncoding RNA Malatl is associated with decreased myogenesis. Am J Physiol Cell Physiol.2013,304(10):C995-1001。类固醇受体 RNA 激活子（SRA)可转录为非编 码（SRA ncRNA)和编码的SRAP亚型，SRAncRNA能够增强骨骼肌细胞分化，同时SRA ncRNA 与MyoD结合后，能够增强MyoD介导的非骨骼肌细胞转分化为骨骼肌细胞，但是这种作 用可被SRAP抑制，进一步研究发现，SRAP的抑制作用需要通过与SRA ncRNA的相互作 用得以实现，参见 Caretti G，Schiltz RL，Dilworth FJ，Di Padova M，Zhao P, Ogryzko V, Fuller-Pace FV, Hoffman EP, Tapscott SJ, Sartorelli V. The RNA helicases p68/ p72and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 2006, 11(4) :547-60 ；HubeF,Velasco G,Rollin J, Furling D, Francastel C. Steroid receptor RNA activator protein binds to and counteracts SRA RNA-mediated activation of MyoD and muscle differentiation. Nucleic Acids Res. 2011，39(2) :513-25。
[0009] 目前，对于IncRNAs调控骨骼肌发育的机制研究中，有研究者发现IncRNAs能够 调节miRNAs的表达或与miRNAs相互作用，从而进一步实现对骨骼肌发育的调控。如，YY1 正调控骨骼肌相关的lincRNA-Yam-1的表达，Yam-1通过调节miR-715的表达抑制骨骼 肌生成，参见 Lu L，Sun K, Chen X，Zhao Y, Wang L, Zhou L, Sun H, Wang H. Genome-wide survey by ChIP-seq reveals YY1 regulation of lincRNAs in skeletal myogenesis. EMBO J. 2013, 32(19) : 2575-88。H19敲除的骨骼肌细胞和小鼠骨骼肌干细胞分化受到抑制， 进一步研究发现，H19基因第一个外显子编码miR-675-3p和miR-675-5p两个miRNA,两者 随着分化逐渐被诱导表达，二者能够弥补由于H19敲除所造成的骨骼肌细胞分化和损伤修 复抑制，参见 Dey BK, Pfeifer K，Dutta A. The H19 long noncoding RNA gives rise to microRNAs miR-675-3p and miR-675-5p to promote skeletal muscle differentiation and regeneration. Genes Dev. 2014 Mar 1;28 (5) :491-501。Cesana 等通过分析 miR-206 和miR_133b的基因组结构发现一个骨骼肌细胞特异性表达且随着骨骼肌细胞分化表达上 调的长链非编码RNA--linc-MDl，linc-MDl基因与miR-206和miR-133b的基因组序列重 叠，机制研究发现，line-MD1通过结合miR-133和miR-135,竞争性调节miR-133和miR-135 与其靶基因 MAML1和MEF2C结合，从而调控骨骼肌细胞分化，参见Cesana M，Cacchiarelli D, Legnini I, Santini T, Sthandier 0, Chinappi M，Tramontane) A, Bozzoni I. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 20110ct 14 ;147(2) :358_69。提示，miRNAs 作为 IncRNAs 与耙基因 之间的桥梁，可能对探讨IncRNAs的作用机制更显捷径。
[0010] 同样，在肌肉疾病中可以检测到一些IncRNAs分子的异常表达，提示IncRNAs参 与肌肉疾病的生理病理进程。DMD基因座位鉴定出一系列IncRNAs，提示这些IncRNAs可 能参与肌营养不良，参见 Bovolenta M，Erriquez D，Valli E，Brioschi S, Scotton C, Neri M, Falzarano MS, Gherardi S, Fabris M, Rimessi P, Gualandi F, Perini G, Ferlini A. The DMD locus harbours multiple long non-coding RNAs which orchestrate and control transcription of muscle dystrophin mRNA isoforms· PLoS One. 2012,7(9):e45328。 Linc-MDl 在杜氏肌细胞中表达下调，参见 Cesana M, Cacchiarelli D, Legnini I，Santini T, Sthandier 0, Chinappi M, Tramontane) A, Bozzoni I. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 2011 Oct 14 ; 147 (2) :358-69。面肩肱型肌营养不良症（FSHD)是常染色体显性遗传肌肉病，大部 分患者存在4q35的D4Z4重复序列的缺失，健康的受试者D4Z4募集PcG蛋白抑制4q35基 因，FSHD患者由于D4Z4的缺失，PcG复合体的沉默作用降低，导致产生染色质相关的非编码 RNA-DBE-T，DBE-T募集AshlL蛋白到FSHD位点，使H3K36去甲基化，染色质重塑，导致4q35 区域的基因转录激活，参见 Cabianca DS, Casa V，Bodega B，Xynos A, Ginelli E, Tanaka Y, Gabel1 ini D. A long ncRNA links copy number variation to a polycomb/trithorax epigenetic switch in FSHD muscular dystrophy. Cell. 2012, 149(4) :819-31,提示DBE-T 参与面肩肱型肌营养不良症的发生发展。
[0011] 这些研究结果提示IncRNAs参与骨骼肌细胞增殖、分化及骨骼肌发育的调控，并 且在肌肉疾病的病理发生过程中发挥重要作用。MyoD是肌生成中重要的转录因子，其调 节Myogenin等一系列肌生成相关基因的表达，MyoD敲除的小鼠肌肉损伤修复存在缺陷， 参见 Yablonka-Reuveni Z，Rudnicki MA, Rivera AJ，Primig M, Anderson JE，Natanson P. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Dev Biol. 1999, 210(2) :440-55 ;且异位表达MyoD可将成 纤维细胞转变为成肌细胞，参见 Tapscott SJ, Davis RL, Thayer MJ, Cheng PF，Weintraub H, Lassar AB. MyoDl:a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 1988,242(4877) :405-11。因而寻找受 MyoD 调控且在骨骼肌细胞中特异表达的IncRNAs可能在肌生成以及肌肉疾病的病理发生过程 中发挥重要的作用。
【发明内容】
[0012] 本发明人通过一系列实验首次鉴定一个受MyoD调控的长链非编码 RNA-2310015B20Rik，根据RACE实验结果，其5'端增加四个碱基序列（CAGT)，遂全长变为 447bp，因其在骨骼肌细胞中特异表达，其表达量在小鼠骨骼肌发育、C2C12细胞以及分离的 原代成肌细胞的分化过程中逐渐上调，且在基因组中介于两个编码蛋白的基因之间，命名 为 Linc-RAM(linc-RNA Activator of Myogenesis)。本发明人首次发现，Linc-RAM 受:转 录因子MyoD调控，显著促进骨骼肌细胞分化，在CTX诱导的急性肌肉损伤修复模型中显著 促进骨骼肌损伤修复进程，Linc-RAM单独或者协助MyoD将成纤维细胞转分化为成肌细胞。 将小鼠的Linc-RAM在胚胎型横纹肌肉瘤细胞系RD细胞中异位表达，Linc-RAM显著抑制RD 细胞增殖，并促进分化。并且，人-Linc-RAM在人类肌肉营养不良疾病中表达下调，提示可 能在肌肉疾病中发挥作用。
[0013] 分子机制研究发现Linc-RAM作为MyoD的共激活子调节肌源性基因的表达，进一 步研究发现Linc-RAM通过与MyoD结合，介导MyoD-Baf60c-Brgl复合体的形成，从而使染 色质重塑，调节下游肌源性基因的表达，并且这种作用是p38a依赖的。分子信号传导研究 发现bFGF通过RAS/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信号通路调节Linc-RAM的表达。
[0014] 我们的研究提示Linc-RAM促进骨骼肌细胞分化，单独或者协助MyoD将成纤维细 胞转分化为成肌细胞，促进RD细胞分化，在人类肌肉疾病治疗中具有潜在作用。
[0015] 因此，本发明提供一种长链非编码RNA分子在制备治疗肌肉疾病的药物中的用 途，所述长链非编码RNA分子选自Linc-RAM。
[0016] 在一个优选的实施方案中，所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。
[0017] 在另一个优选的实施方案中，所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
[0018] 本发明另一方面提供一种长链非编码RNA分子在制备促进肌肉干细胞分化、成纤 维细胞转分化、促进横纹肌肉瘤细胞分化的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自 Linc-RAM〇
[0019] 本发明进一步提供一种含有编码Linc-RAM的核苷酸的载体用于治疗肌肉疾病， 特别是肌肉损伤和横纹肌肉瘤用途。优选地，所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
[0020] 术语"肌肉损伤"是指在直接外力或间接外力的作用下引起的肌肉的挫伤、拉伤 等，急性肌肉损伤是指肌肉的急性损伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1A显示Line-RAM在小鼠不同组织中的表达情况；图1B显示Linc-RAM在小鼠 胚胎11. 5天的表达情况；图1C显示Line-RAM在小鼠骨骼肌不同发育阶段中的表达情况； 图1D显示Linc-RAM在C2C12细胞分化过程中的表达情况；图1E显示Linc-RAM在小鼠原 代成肌细胞的表达情况；图1F显示ChIP-PCR检测MyoD在Linc-RAM的启动子区具有结合 位点；图1G显示荧光素酶报告基因检测MyoD通过结合Line-RAM启动子区域的E-Box调节 Linc-RAM的表达；1H显示异位表达MyoD的成纤维细胞中，Linc-RAM被诱导表达；图II显 示Linc-RAM在MyoD敲除的小鼠骨骼肌中的表达情况；图1J显示Linc-RAM在细胞质和细 胞核中的分布；图1K显示FISH检测Line-RAM在细胞质和细胞核中的分布。
[0022]图2A显示利用慢病毒转染C2C12细胞构建Linc-RAM敲低的细胞系，real-time PCR检测Line-RAM的敲低倍数；图2B显示C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM敲低细胞分化60 小时后MHC(绿色）免疫荧光染色结果，DAPI染色（红色）定位细胞核；图2C显示MHC阳性 细胞数量统计结果；图2D显示C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM敲低的细胞分化60小时后MHC 蛋白水平的检测结果；图2E显示利用慢病毒转染C2C12细胞构建Line-RAM高表达的细胞 系，real-time PCR 检测 Line-RAM 的高表达倍数；图 2F 显示 C2C12-NC 和 C2C12-Linc-RAM 高表达的细胞分化6〇小时后MHC (绿色）免疫荧光染色结果，DAPI染色（红色）定位细胞 核；图2G显不MHC阳性细胞数量统计结果；图2H显不C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM高表达 的细胞分化60小时后MHC蛋白水平的检测结果；图21显示利用慢病毒转染C2C12细胞构 建MyoD敲低的细胞系，real-time PCR检测MyoD mRNA敲低倍数；图2J显示Line-RAM高 表达质粒转染MyoD敲低的C2C12细胞分化24h后，Myogenin (绿色）免疫荧光染色结果， DAPI染色（红色）定位细胞核；图2K显示Myogenin阳性细胞数量统计结果；图2L显示 Linc-RAM高表达质粒转染MyoD敲低的C2C12细胞分化24h后，检测Myogenin mRNA的表 达。
[0023] 图3A-1和图3A-2分别显示利用慢病毒转染C3H10T1/2细胞构建Linc-RAM高表达 和MyoD高表达的细胞系，real-time PCR检测Linc-RAM和MyoD的高表达倍数；图3B显示 Linc-RAM高表达和MyoD高表达的C3H10T1/2细胞分化3天后MHC (绿色）免疫荧光染色结 果，DAPI染色（蓝色）定位细胞核；图3C-1至图3C-3显示real-time PCR检测MyoD高表 达的C3H10T1/2细胞分化3天后Linc-RAM，MyoG和MHC mRNA的表达；图3D-1至图3D-3显 示 real-time PCR 检测 Linc-RAM 高表达的 C3H10T1/2 细胞分化 3 天后 Linc-RAM，MyoG 和 MHC mRNA的表达；图3E显示MyoD高表达的C3H10T1/2细胞分别高表达和敲低Linc-RAM后 分化48小时，MHC mRNA的表达情况；图3F显示MyoD高表达的C3H10T1/2细胞分别高表达 和敲低Linc-RAM后分化48小时，MHC免疫荧光染色结果；图3G显示敲低Linc-RAM分化48 小时后，MHC阳性细胞数量统计结果；图3H显示敲低Linc-RAM分化48小时后MHC阳性多核 (>2个）细胞数量统计结果；图 31显示收取处于增殖期和分化48小时Line-RAM和MyoD高 表达的C3H10T1/2细胞，RNA-seq检测差异表达的基因 ，Heat map显示差异表达（fold>2) 的基因；图3J显示RT-PCR检测成纤维细胞谱系和成肌细胞谱系相关基因在Line-RAM高表 达和MyoD高表达的C3H10T1/2细胞分化过程中的表达变化。
[0024] 图4A-1和图4A-2显示CTX损伤24小时的胫骨前肌电转Linc-RAM高表达质粒后， RT-PCR检测Linc-RAM的表达；图4B显示CTX损伤的胫骨前肌电转Line-RAM髙表达质粒 5. 5和7. 5天后，胫骨前肌横切面HE染色结果；图4C显示CTX损伤7. 5天胫骨前肌肌纤维 横切面面积统计；图4D-1至图4D-3显不CTX损伤3. 5天，real-time PCR检测MyoD，MyoG 和MHC mRNA的表达。
[0025] 图5A显示利用慢病毒转染RD细胞构建小鼠-Linc-RAM高表达的细胞系，RT-PCR 检测Linc-RAM的高表达倍数；图5B显示Linc-RAM高表达的RD细胞分化72小时后MHC (绿 色）免疫荧光染色结果，DAPI染色（红色）定位细胞核；图5C显示MHC阳性细胞数量统 计结果；图5D-1和图5D-2显示real-timePCR检测Linc-RAM高表达的RD细胞分化3天 后MyoD和MyoG mRNA的表达；图5E显示根据小鼠 Linc-RAM在基因组中的位置，通过同源 线性区域分析人类基因组中human-Linc-RAM，包括两种变体；图5F-1至图5F-4显示人类 肌营养不良的样品中检测human-Linc-RAM的表达，以及MyoD和MyoG mRNA的表达，其中 1111111&11-1^1^-1^1包括两个变体，4代表正常的骨骼肌组织，8代表肌营养不良组织，3,5,6， 7,8代表5个肌营养不良的病人。
[0026] 图6A显示Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞分化12小时，RNA-seq检测差异 表达的基因 ，Heat map显示差异表达（f〇ld>2)的基因；图6B显示G0基因注释的结果；图 6C显示MyoD和Linc-RAM共同调节的基因；图6D显示MyoD和Linc-RAM共同调节与肌细胞 增殖，分化和结构相关的基因；图6E显示RT-PCR进一步确定MyoD和Linc-RAM共同调节的 基因在Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞分化12小时后的表达变化；图6F显示不同剂 量（0,0· 6ug, 1. Oug)的Linc-RAM高表达质粒与0. 4ug MyoD高表达质粒共转染C3H10T1/2 细胞，突光素酶报告基因检测MyoG启动子（MyoG基因转录起始位点上游-470bp?+103bp) 活性；图6G显示C3H10T1/2细胞分别转染MyoD和Linc-RAM高表达质粒分化48小时后， real-time PCR检测MyoG的表达；图6H-1至图6H-3显示甲醛固定Linc-RAM高表达和敲 低的C2C12细胞，超声破碎后分别加入MyoD, H3K4Me3和Pol II抗体进行染色质免疫共沉 淀实验，real-time分别检测这三种蛋白在MyoG启动子区域的富集程度；图61-1至图61-3 显示甲醛固定Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞，超声破碎后分别用MyoD, H3K4Me3和 Pol II抗体染色质免疫共沉淀，real-time分别检测这三种蛋白在miR-206(远端）启动子 区域的富集程度。
[0027] 图7A显示提取RNase-free的C2C12细胞裂解液，利用MyoD抗体免疫共沉淀， Western Blot检测MyoD蛋白水平，RT-PCR检测Line-RAM水平；图7B显示提取RNase-free 的C2C12细胞裂解液，分别利用MyoD，Baf60c和Brgl抗体免疫共沉淀，RT-PCR检测 Linc-RAM水平；图7C-1和图7C-2显示real-time PCR检测Linc-RAM高表达和敲低的 C2C12细胞中Baf60c和Brgl mRNA的表达量；图7D显示分别提取Linc-RAM高表达和敲低 的C2C12细胞RNase-free裂解液，利用MyoD抗体免疫共沉淀，Western Blot检测MyoD, Baf60c和Brgl蛋白水平；图7E-1至图7E-4显示甲醛固定Linc-RAM高表达和敲低的C2C12 细胞，超声破碎后分别用MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac抗体染色质免疫共沉淀，real-time PCR分别检测MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac蛋白在MyoG启动子区域的富集程度；图7F显示 10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分化36小时，MHC (绿色）免疫荧光染 色结果，DAPI染色（蓝色）定位细胞核；图7G显示MHC阳性细胞数量统计结果；图7H显示 10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分化36小时，MHC mRNA水平的检测结 果；图71显示10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分化18小时，Line-_ 的表达结果；图7J显示10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分化18小时， 甲醛固定Linc-RAM高表达的C2C12细胞，超生声破碎后用Brgl抗体染色质免疫共沉淀， real-time分别检测Brgl在MyoG启动子区域的富集程度。
[0028]图8A1至图8A3显示10ng/mL bFGF处理C2C12细胞分化6、12、24小时后检测 Linc-RAM的表达情况；图8B显示C2C12细胞分别转染Linc-RAM野生型和突变型启动子， 即 Linc-RAM-WT(-390bp ?+80bp)和 Linc-RAM-Mutant(-87 和-88 位碱基突变），l〇ng/ mL bFGF处理C2C12细胞分化24小时，荧光素酶报告基因检测Linc-RAM启动子的活性， MyoD(-lkb)和MyoG(GBBS)启动子作为阳性对照；图8C显示10uM PD98059预处理C2C12 细胞1小时后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小时检测p-Erk, t-Erk，p-MEK, t-MEK蛋 白的表达情况；图8D-1至图8D-3显示PD98059预处理C2C12细胞1小时后再用bFGF处理 C2C12细胞分化24小时检测MyoD，Linc-RAM和MyoG的表达情况；图8E显示10uM PD98059 预处理C2C12细胞1小时后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小时，荧光素酶报告基因检 测Linc-RAM-WT和Linc-RAM-Mutant启动子的活性；图8F-1至图8F-3显示5uM FTA预处 理C2C12细胞30分钟后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小时，检测MyoD，Linc-RAM和 MyoG的表达情况；图8G-1至图8G-3显示2. 5uM GW预处理C2C12细胞30分钟后再用bFGF 处理C2C12细胞分化24小时后，检测MyoD，Linc-RAM和MyoG的表达情况；图8H显示bFGF 处理 C2C12-NC 和 C2C12-Linc-RAM-0E 细胞分化 24,36 小时后 Myogenin 和 MHC (绿色）免 疫突光染色结果，DAPI染色（红色）定位细胞核；图81显示Myogenin阳性细胞数量统计 结果；图8J显示MHC阳性细胞数量统计结果。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例详细说明本发明，这些实施例仅是用于阐明本发明而不以任 何方式限制本发明。
[0030] 本发明所使用的Linc-RAM由生物信息学分析得到，RT-PCR检测Linc-RAM的表达 量。
[0031] 实施例1发现一个受MyoD调控并在骨骼肌细胞中特异表达的长链非编码RNA，命 名为 Linc-RAM
[0032] 根据已经发表文章中的两套数据库，参见Cao Y, Yao Z, Sarkar D, Lawrence M, Sanchez GJ, Parker MH, MacQuarrie KL, Davison J, Morgan MT, Ruzzo WL, Gentleman RC,Tapscott SJ. Genome-wide MyoD binding in skeletal muscle cells:a potential for broad cellular reprogramming. Dev Cell. 2010, 18 (4):662-74 ；Trapnell C, Williams BA,Pertea G,Mortazavi A,Kwan G,van Baren MJ,Salzberg SL,Wold BJ, Pachter L.Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.2 010, 28(5) :511-5,利用生物信息学分析得到一系列受MyoD调控的IncRNAs，RT-PCR检 测这些IncRNAs在肌生成过程中的表达图谱，检测结果发现一个在骨骼肌中特异表达的 lncRNA-2310015B20Rik,同时早期胚胎（E11. 5)体节中也检测到其表达,23l〇〇l5B2〇Rik 位于小鼠 10号染色体，介于ccdc6和slcl6a9两个编码蛋白基因之间，2310015B20Rik在核 质中均有表达，且保守性较低，2310015B20Rik的表达量随着肌生成过程逐渐上调，命名为 Linc-RAM〇
[0033] 通过Northern Blot检测Linc-RAM在小鼠各组织中的分布；通过原位杂交检 测Linc-RAM在胚胎期的表达情况。按照常规操作进行骨骼肌原代成肌细胞（primary myoblasts)的分离与培养；提取C2C12细胞和骨骼肌组织中总RNA，RT-PCR检测Linc-RAM 的表达量。
[0034] 结果：如图1A至1E所示，Linc-RAM在骨骼肌细胞中特异表达，小鼠胚胎11. 5天 检测Linc-RAM表达。其表达量在骨骼肌发育，C2Q2细胞分化以及原代成肌细胞中，随着 肌生成过程逐渐上调。结果提示Linc-RAM在肌细胞分化过程中发挥作用。
[0035] MyoD在转录水平调节Linc-RAM表达
[0036] ChIP-PCR检测MyoD在转录水平调节Linc-RAM表达
[0037] 根据预测的MyoD在Linc-RAM启动子区域的结合位点（E-Box)设计多组引物， RT-PCR检测MyoD是否结合在Linc-RAM的启动子区域。
[0038] 结果：如图1F所不，MyoD在Linc-RAM的启动子区域有结合位点，结果提示MyoD 调节Linc-RAM的表达。
[0039] 另外，本发明人将Linc-RAM的启动子区域（-390bp?+80bp)插入到pGL3-Basic 载体，并将Linc-_启动子区域的MyoD结合位点（E-Box)进行点突变（-87和-88位碱基 突变）后插入到pGL3-Basic载体，荧光素酶报告基因实验结果（如图1G)表明MyoD通过结 合在Linc-RAM启动子区域的E-Box调节Linc-RAM转录。异位转染MyoD高表达质粒的成 纤维细胞中，MyoD诱导Linc-RAM的表达（如图1H)。MyoD敲除的小鼠骨骼肌中Linc-RAM 的表达显著下调（如图II)。以上所有结果显示MyoD调节Linc-RAM的表达。
[0040] 检测Linc-RAM在细胞中的分布
[0041] 根据核质分离试剂盒（Ambion公司）的步骤，分别提取细胞质和细胞核RNA， RT-PCR检测Linc-RAM在细胞中的分布。FISH技术进一步检测Linc-RAM在细胞中的分布。 [0042] 结果：如图1J和1K所示，Line-RAM在核质中均有表达，且细胞质中表达量多于细 胞核。结果提示Linc-RAM可能在细胞质和细胞核中发挥不同的作用。
[0043] 实施例2 Linc-RAM对骨骼肌干细胞系分化的作用
[0044] 构建Linc-RAM高表达及敲低细胞系
[0045] 利用 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System(Invitrogen)构建 sh-Linc-RAM敲低质粒，与病毒包装质粒pVSVG，Λ 〇8· 91共感染29：3T细胞，分别收集24 小时和48小时上清，1100g离心3. 5分钟去除细胞碎片，〇· 45um滤器过滤，24000rpm/min 离心2.4h，100ul PBS溶解病毒颗粒，感染C2C12 (购自ATCC)细胞48小时后，杀稻癌菌素 (Invitrogen)筛选得到Linc-RAM(sh-Linc-RAM)敲抵细胞系。同样的方法得到(^ 〇111：1>〇1质 粒对照组细胞系。 ~
[0046] 将 BLOCK-It Lentiviral RNAi Expression System 中的 pENTRTM/U6 Entry Construct pU6启动子表达区域置换为pEGFP-Nl的pCMV启动子表达区域，得到质粒命名为 pvirus (从香港科技大学部振国老师处得到），将Line-RAM片段插入该质粒，与pLenti6/ BL0CK-iT-DEST质粒重组后，包装病毒，感染C2C12细胞得到Line-RAM高表达（Linc-RAM 0E)的C2C12细胞系。
[0047] Real-time RT-PCR 检测 Line-RAM 表达
[0048] 结果：如图2A和2E所不，Line-RAM在1?表达和敲除的细胞系中分别被高表达和 敲低，结果提示细胞系构建成功。
[0049] 免疫荧光检测Linc-RAM对C2C12细胞分化的影响
[0050] 分别将1. 2 X 104个Line-RAM高表达和敲低的C2C12细胞培养于12孔板中（DMEM 培养基，包含10%胎牛血清，1 %青霉素，1 %链霉素，1 %谷氨酰胺），培养24h换分化培养基 (DMEM培养基，包含2%马血清，1 %青霉素，1 %链霉素，1 %谷氨酰胺），60小时后收取细胞。
[0051] 结果：如图28、2(：、2「、26所示，分化6011时1^11(：-腿1高表达组的丽(：阳性的细胞 数比对照组显著增加，而Linc-RAM敲低组的MHC阳性的细胞数比对照组显著减少，结果提 示Linc-RAM显著促进C2C12细胞分化。（MHC是C2C12细胞分化标记基因）。
[0052] Western Blot检测蛋白表达
[0053] 结果：Western Blot结果显示（如图2D、2H)，分化60小时后，Linc-RAM高表达组 的MHC蛋白表达量比对照组显著增加，Linc-RAM敲低组的MHC蛋白表达量比对照组显著减 少。结果提示Linc-RAM显著促进C2C12细胞分化。
[0054] Line-RAM能够部分弥补由于MyoD敲低造成的C2C12细胞分化缺陷
[0055] 如实施例 1 所示 BLOCK-It Lentiviral RNAi Expression System,构建MyoD 敲低 的C2C12细胞系。MyoD敲低的C2C12细胞转染Linc-RAM高表达质粒，检测细胞分化情况。
[0056] 结果：real-time PCR结果显示MyoD mRNA表达量显著降低（如图21)，分化24小 时后，转染了 Line-RAM高表达质粒的MyoD敲低C2C12细胞，MyoG阳性细胞数目显著多于 MyoD敲低组（如图2J，2K)，MyoG mRNA的表达量也显著多于MyoD敲除组（如图2L)，结果 提示Linc-RAM能够部分弥补由MyoD敲低造成的C2C12细胞分化缺陷。
[0057] 实施例3 Linc-RAM将成纤维细胞转变为成肌细胞的作用
[0058] 如实施例 1 所不 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System，构建 MyoD 高表达的C3H10T1/2细胞系，标记为MyoD 0E C3H10T1/2细胞。利用Lenti-XTM Tet-on 3G Inducible Expression System(Clontech Laboratories)构建 Linc-RAM 高表达的 C3H10T1/2细胞系，标记为pLVX-Linc-RAM 0E C3H10T1/2细胞，同时构建其对照质粒标记为 pLVX-TRE C3H10T1/2细胞。其中ΟΗΙΟ--/2细胞系购自中国医学科学院细胞中心。
[0059] Linc-RAM将成纤维细胞转变为成肌细胞
[0060]如同实施例 2,分别将 1. 5X 104 个 pLVX-Line-RAM 0E，pLVX-TRE 和 MyoD 0E C3H10Tl/2细胞培养于l2孔板中，培养1?换分化培养基（DMEM培养基，包含lOug/mL胰岛 素， 5ug/mL转铁蛋白，1%青霉素，1%链霉素，1 %谷氨酰胺），分化72h后分别收取细胞，免 疫荧光，real-time RT-PCR等具体实验操作如同实施例2。将pLVX-Linc-RAM 0E，pLVX-TRE 和MyoD 0E C3H10T1/2细胞培养于10厘米培养盘中，分化48小时后，收取总RNA，送于贝瑞 和康公司，进行RNA-seq测序后，生物信息学分析差异表达的基因，RT-PCR检测成纤维细胞 和成肌细胞谱系相关基因的表达。
[0061] 结果：如图3A-1和3A_2所示，Linc-RAM和MyoD高表达的C3H10T1/2系均构建成 功。分化三天后，pLVX-Linc-RAM 0E和MyoD 0E C3H10T1/2细胞中存在MHC阳性的细胞，且 MyoD 0E C3Hl〇n/2细胞中MHC阳性的细胞多于Line-RAM高表达的C3H10T1/2细胞（如图 3B) ;real-time RT-PCR 结果显示 Linc-RAM 高表达的 Ο3Η10Τ1/2 细胞中 MyoG，MHC mRNA 表 达量低于 MyoD 0E C3H10T1/2 细胞（如图 3C-1 至 3C-3,3D-1 至 3D-3)，结果提示 Linc-RAM 具有将成纤维细胞转变为成肌细胞的能力，但这种能力低于MyoD。如图31所示，heap map 图示RNA-seq结果，显示相对于对照组，pLVX-Linc-RAM 0E的成纤维细胞在增殖期1247个 基因表达上调，613个基因表达下调；分化48小时后，1265个基因表达上调，968个基因表 达下调；图3J所不，RT-PCR进一步检测成纤维细胞和成肌细胞谱系相关基因的表达。
[0062] 实施例4 Linc-RAM协助MyoD将成纤维细胞转变为成肌细胞 [0063] Linc-RAM协助MyoD将成纤维细胞转变为成肌细胞
[0064] 将1. 2X 104个MyoD 0E C3H10T1/2细胞培养于I2孔板中，12h后分别瞬时转染 Line-RAM高表达和shRNA的质粒，24h后更换分化培养基（DMEM培养基，包含l〇ug/mL胰岛 素， 5ug/mL转铁蛋白，1 %青霉素，1 %链霉素，1 %谷氨酰胺），分化4池后分别收取细胞，免 疫荧光，Western Blot以及real-time RT-PCR等具体实验操作如同实施例2。其中胰岛素 购自若和诺德公司，转铁蛋白购自Sigma公司。
[0065] 结果：如图3E，3F，Χ，3Η所示，转染Linc-RAM高表达的质粒的MyoD 0E C3H10T1/2 细胞中，MHC mRNA以及蛋白表达量显著多于对照组，并且MHC阳性的多核细胞显著多于对 照组；而转染Linc-RAM shRNA质粒的MyoD 0E C3H10T1/2细胞中，MHC mRNA以及蛋白表达 量显著少于对照组，并且MHC阳性的细胞显著少于对照组，结果提示Line-RAM协助MyoD将 成纤维细胞转变为成肌细胞。
[0066] 实施例5 Linc-RAM对肌肉损伤再生的作用 [0067] 1、动物处理
[0068]从维通利华公司购买8周龄左右的雄性CS7BL/6小鼠，向其后肢左腿和右腿胫 骨前肌注射2〇微升蛇毒细胞毒素（CTX，cardiotoxin，溶于PBS (稀释至终浓度为?ο μ Μ ; Sigma)造成肌肉急性损伤-再生修复模型,22小时后注射20ul 5U透明质酸，两个小时后 再向右腿胫骨前肌注射20ul 25ug Linc-RAM高表达质粒（pvirus-Linc-_)，左腿注射 control质粒作为对照组，剔除小鼠腿部的毛，用电极（BTX，10mm) 15v/mm电压，8个脉冲，每 个脉冲20毫秒电击胫骨前肌处肌肉。
[0069] 2、肌肉组织收集
[0070] 肌肉损伤3· 5,5_ 5和7· 5天后断颈处死小鼠，用剪刀将后肢左右两腿皮毛剪开，找 到小腿胫骨，用钝镊子撕开胫骨外侧胫骨前肌表面的肌膜，从肌腱处剪断取下整块胫骨前 肌。
[0071] 3、石蜡包埋及苏木素和伊红（HE)染色
[0072] 1)将取下的胫骨前肌固定在10°%福尔马林（甲醛溶液1:10溶于PBS(如上所述 配制））中24-48小时；
[0073] 2)固定后经70 %、S0 %、％ %、100 %乙醇各浸泡1小时至完全脱水；
[0074] 3)脱水后转移至二甲苯透明两次各半小时；
[0075] 4)在50_6〇度透蜡和包埋（Leica EG1150全自动包埋机）；
[0076] 5)修整蜡块样品，切片3-4微米（Leica RM2255全自动轮转切片机）；
[0077] 6)将切片分割开，投入到40度的温水浴中展片（Leica HI1220摊片机）后贴片至 载玻片上，在烫板（Leica HI 1210烤片机）上60°C烤干；
[0078] 7)将组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡1〇分钟。无水乙 醇中浸泡5分钟；95%乙醇中浸泡5分钟；70%乙醇中浸泡5分钟；最后入蒸馏水浸泡2分 钟；
[0079] 8)将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5分钟。酸水及氨水中分色， 各5-10秒钟。流水冲洗5分钟后入蒸馏水片刻。入70%和90%酒精中脱水各5分钟。入 酒精伊红染色液染色2?3分钟。
[0080] 9)染色后经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，用中性树胶封片。
[0081] 4、照相及数据统计
[0082] 正置显微镜（Olypums BX 53) X 20倍镜下照片，手动利用Image-pro Plus 5. 1软 件计数损伤区域上新形成的核在中央的肌纤维面积。
[0083] 结果：如图4A-1和4A-2所示，RT-PCR检测Linc-RAM在胫骨前肌中高表达；CTX损 伤7. 5天HE染色结果显示注射Linc-RAM组的胫骨前肌中新形成的核在中央的肌纤维面积 显著大于对照组（如图48,40;0^损伤3.5天1^ &1-^1^1?1'-?〇?检测损伤修复相关基因 的表达，如图4D-1至4D-3所示注射Line-RAM组的胫骨前肌中MyoD，MyoG, eMHC mRNA的表 达多于对照组，结果提示Linc-RAM促进骨骼肌再生。
[0084] 实施例6 Linc-RAM促进RD细胞（一种横纹肌肉瘤细胞系）分化的作用
[0085] 如实施例 1 所不 BL0CK-It Lentiviral RNAi Expression System，构建 Line-RAM 高表达的RD细胞系，其RD细胞系购自中国医学科学院细胞中心。
[0086] Linc-RAM促进RD细胞分化
[0087] 如同实施例2,分别将2X 104个Linc-RAM高表达的RD细胞培养于12孔板中，培 养12h换分化培养基（DMEM培养基，包含10ug/mL胰岛素，10ug/mL转铁蛋白，1%青霉素， 1 %链霉素，1 %谷氨酰胺），分化48h后收取细胞，免疫荧光，RT-PCR等具体实验操作如同实 施例1，2。
[0088] 结果：如图5A显示细胞系构建成功。5B，5C显示Linc-RAM高表达的RD细胞中 MHC阳性细胞个数显著多于对照组。1至5D-2所示Linc-RAM高表达的RD细胞中MyoD， MyoG mRNA的表达多于对照组，结果提示Linc-RAM促进RD细胞分化。
[0089] 实施例7 Linc-RAM可能参与人类肌营养不良疾病的发生发展 [0090] 取自肌营养不良病人的组织样品，提取总RNA，real-time RT-PCR检测 human-Linc-RAM-variant l，human-Linc-RAM_variant2 的表达，以及 MyoD, MyoG mRNA 表 达量。
[0091] 结果：5E显示根据小鼠 Linc-RAM在基因组中的位置，通过同源线性区域分析人类 基因组中human-Linc-RAM的位置，包括两种变体；如图5F-1至5F-4所示，相对于正常肌肉 组织，human-Linc-RAM-variant 1 和 human-Linc-RAM-variant 2 在病人组织中表达量下 调，且MyoD，MyoG mRNA表达量下调，结果提示human-Linc-RAM可能参与肌营养不良的发生 发展（A表示正常肌肉组织；B表示肌营养不良组织）。
[0092] 实施例8 Linc-RAM作为MyoD的共激活子，调节肌源性基因的表达 [0093] 分别将1. 2X 104个Linc-RAM高表达和敲除的C2C12细胞培养于6孔板中，更换 分化培养基12小时后收取细胞总RNA，RNA-seq检测差异表达基因；根据已知的受MyoD调 控的基因，利用生物信息学分析受MyoD和Linc-RAM共同调节的基因；MyoD和Linc-RAM高 表达的质粒分别转染C3H10T1/2细胞，48小时后收取RNA，检测MyoG基因的表达；不同剂量 (〇,〇· 6ug，1. 〇ug)的Linc-RAM高表达质粒与0. 4ug MyoD高表达质粒共转染C3H10T1/2细 胞，灭光素酶报告基因检测MyoG启动子（MyoG基因转录起始位点上游-470bp?+130bp) 活性；如同实施例1，甲醛固定Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞，超声破碎后分别用 MyoD，H3K4Me3和Pol II抗体染色质免疫共沉淀，real-time分别检测这三种蛋白在MyoG 和miR-206(远端）启动子区域的富集程度。
[0094] 结果：如图6A显示Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞分化12小时，RNA-seq 检测差异表达的基因，Heat map显示差异表达（fold>2)的基因；6B显示GO基因注释的 结果，差异表达的基因主要富集于核小体组装及肌源性基因的转录调节；6C显示MyoD和 Linc-RAM共同调节的基因；6D显示MyoD和Linc-RAM共同调节与肌细胞增殖，分化和结构 相关的基因；6E显示RT-PCR进一步确定MyoD和Linc-RAM共同调节的基因在Linc-RAM高 表达和敲低的C2C12细胞分化12小时后的表达变化；6F显示不同剂量（〇,〇.6ug，l.Oug)的 Linc-RAM高表达质粒与0. 4ug MyoD高表达质粒共转染C3H10T1/2细胞，荧光素酶报告基 因结果显示Linc-RAM呈剂量依赖性促进MyoD调节MyoG启动子的活性；6G显示C3H10T1/2 细胞转染MyoD高表达质粒分化48小时后，real-timePCR结果显示MyoD诱导MyoG的表 达；6H-1至6H-3结果显示相对于正常组，Linc-RAM高表达的C2C12细胞中，更多的MyoD, H 3K4Me3和Pol II富集于MyoG和miR_2〇6 (远端）启动子区域，而Linc-RAM敲低的C2C12 细胞中，这些蛋白的富集减少，结果提示Linc-RAM作为MyoD的共激活子，调节肌源性基因 的表达。
[0095] 实施例9 Linc-RAM以p38a依赖的方式通过与MyoD相互作用，介导 MyoD-Baf60c_Brgl复合物的形成
[0096] 提取RNase-free的C2C12细胞裂解液，利用MyoD抗体免疫共沉淀，Western Blot检测MyoD蛋白，RT-PCR检测Linc-RAM ;提取RNase-free的C2C12细胞裂解液，分别 利用 MyoD, Baf60c 和 Brgl 抗体免疫共沉淀，RT-PCR 检测 Linc-RAM ;real-time PCR 检测 Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞中Baf60c和Brgl mRNA的表达量；分别提取Linc-RAM 高表达和敲低的C2C12细胞RNase-free裂解液，利用MyoD抗体免疫共沉淀，Western Blot 检测MyoD，Baf60c和Brgl蛋白；甲醛固定Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞，超声破碎 后分别用MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac抗体染色质免疫共沉淀， real-time PCR分别检测 这四种蛋白在MyoG启动子区域的富集程度；10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12 细胞分化36小时后，免疫荧光，real-time PCR及ChIP-PCR检测如同实施例2。
[0097] 结论：图7A显示在MyoD抗体的免疫共沉淀产物中检测到Linc-RAM，提示 Linc-RAM和MyoD结合在一起；7B结果显示Linc-RAM与MyoD结合，而没有与Baf60c和Brgl 结合；7C显示Linc-RAM高表达和敲低的C2C12细胞中Baf60c和Brgl mRNA的表达量没有 差异；7D显示相对于对照组，Linc-RAM高表达的细胞中，Baf60c和Brgl蛋白在MyoD抗体 的免疫共沉淀产物中富集增多，而Linc-RAM敲低的细胞中，Baf60c和Brgl蛋白在MyoD抗 体的免疫共沉淀产物中富集减少；7E-1至7E-4显示相对于对照组，Linc-RAM高表达的细胞 中，更多的MyoD，Baf60c，fcg 1和H3K9ac蛋白富集于MyoG启动子区域，Linc-RAM高敲低的 细胞中，MyoD，Baf60c，Brgl和H3K9ac蛋白在MyoG启动子区域的富集减少；7F，7G，7H显示 10uM SB203580处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分36小时，MHC阳性细胞的个数显著低 于没有处理的Line-RAM高表达细胞组，且MHC mRNA的表达量降低；71显示10uM SB203580 处理Linc-RAM高表达的C2C12细胞分化18小时后，Linc-RAM的表达量没有改变；7J显示 SB203580处理Line-RAM高表达的C2C12细胞18小时后，Brgl在MyoG启动子区域的富集减 少，结果提示Linc-RAM以p38a依赖的方式通过与MyoD相互作用，介导MyoD-Baf60c-Brgl 复合物的形成。
[0098] 实施例10 bFGF通过Ras/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信号通路在肌细胞分化过程中调 节Linc-RAM的表达和功能
[0099] l〇ng/mL bFGF (Sigma)处理 C2C12 细胞分化 6,12, 24 小时后，收取 RNA，real-time RT-PCR检测Linc-RAM的表达水平（如图5-A所示）；10ng/mL bFGF处理C2C12细胞分化 24小时，荧光素酶报告基因检测Linc-RAM启动子的活性；i〇uM PD98059预处理C2C12细胞 1小时后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小时检测p-Erk，t-Erk，p-MEK，t-MEK蛋白的表 达情况；PD98059预处理C2C12细胞1小时后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小时检测 MyoD，Linc-RAM和MyoG的表达情况；10uM PD98059预处理C2C12细胞1小时后再用bFGF 处理C2C12细胞分化24小时，天光素酶报告基因检测Linc-RAM-WT和Line-RAMHVIutant启 动子的活性；5uM FTA预处理C2C12细胞30分钟后再用bFGF处理C2C12细胞分化24小 时，检测MyoD, Linc-RAM和MyoG的表达情况；2. 5uM GW预处理C2C12细胞30分钟后再用 bFGF处理C2C12细胞分化24小时后，检测MyoD，Line-RAM和MyoG的表达情况；bFGF处理 C2C12-NC和C2C12-Linc-RAM-0E细胞分化24,36小时后Myogenin和MHC免疫荧光染色， real-time PCR检测如同实施例2。
[0100] 结论：8A显示bFGF处理C2C12细胞分化6,12,24小时后，Linc-RAM的表达下调； 8B显示bFGF处理C2C12细胞分化24小时，荧光素酶报告基因结果显示Linc-RAM启动子 的活性降低；8C显示PD98059预处理后，能够部分弥补由于bFGF引起的p-Erk和p-MEK蛋 白表达量的增加；8D-1至8D-3,8E显示PD98059预处理后，能够部分弥补由于bFGF引起的 Linc-RAM表达量的降低；8F，8G显示FTA和GW分别部分弥补由bFGF引起的Line-RAM表达 量的降低；8H, 81，8J显示bFGF降低了 Linc-RAM对C2C12细胞的促分化作用，提示bFGF通 过Ras/Raf/Mek/Erkl/2/MyoD信号通路在肌细胞分化过程中调节Line-RAM的表达和功能。 [0101] 随着ENCODE计划的公布，目前在人类基因组上发现至少存在9640个位点转录成 lncRNAs,这些IneRNAs势必参与了生物学的各个过程，然而目前仅对不到0. 1 %的IneRNAs 进行了功能性研究，因而研究IneRNAs生物学过程中功能成为新的研究热点。本发明人发 现一个受MyoD调控的IneRNA，命名为Linc-RAM，Linc-RAM在肌生成过程中表达上调，显 著促进C2C12细胞分化，促进肌肉损伤修复，能够单独或者协助MyoD将成纤维细胞转换 为成肌细胞，并且促进横纹肌肉瘤细胞分化，进一步的实验结果表明bFGF通过Ras/Raf/ Mek/Erk信号通路在肌细胞分化过程中调节Linc-RAM的表达。其发挥功能的分子机制是 Line-RAM以p38a依赖的方式通过与MyoD相互作用，介导MyoD-BafOOc-Brgl复合物的形 成，从而调节肌源性基因的表达。这些研究结果提示Linc-RAM在骨骼肌发育进程中具有重 要的调节作用，可以为人类疾病提供临床治疗作用。
【权利要求】
1· 一种长链非编码RNA分子在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途，所述长链非编码 RNA分子选自Linc-RAM。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。
3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
4. 一种长链非编码RNA分子在制备促进肌肉干细胞分化或促进成纤维细胞转分化或 促进横纹肌肉瘤细胞分化的药物中的用途，所述长链非编码RNA分子选自Linc-RAM。
5. -种含有编码Line-RAM的核苷酸的载体用于治疗肌肉疾病的药物中的用途。
6. 根据权利要求5所述的用途，其中所述肌肉疾病选自肌肉损伤或横纹肌肉瘤。
7. 根据权利要求5或6所述的用途，其中所述肌肉损伤为急性肌肉损伤。
【文档编号】A61P21/00GK104189921SQ201410446245
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】朱大海, 于潇华, 张勇, 李婷婷 申请人:中国医学科学院基础医学研究所