一株弯曲乳杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株弯曲乳杆菌及其应用。本发明公开一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为CGMCC No.9388。本发明公开的弯曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)IMC-12，具有较强的产生H2O2的能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长，同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植，弯曲乳杆菌IMC-12在泌尿生殖道感染防治方面具有一定的应用前景。
CGMCC No.9388
2014.06.27
【专利说明】一株弯曲乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株弯曲乳杆菌及其应用，属于微生物领域。
【背景技术】
[0002] 泌尿生殖道感染为妇女最为常见但又未受到重视的多发病，发病率仅次于呼吸 道感染，可高达40% ;女性泌尿生殖道感染是尿路感染和生殖道感染的总称，它不仅直接影 响妇女的身心健康，而且也会影响众多家庭的幸福和稳定，进而影响全社会的人口质量和 经济发展。女性尿路感染常见的病原是革兰氏阴性杆菌，其中以大肠埃希菌最多见，葡萄 球菌次之；这些多数为人体肠道及皮肤黏膜上的正常菌群，由于机体免疫力下降，这些细 菌可由肠道及皮肤粘膜等寄居部位迁移至泌尿系统并大量繁殖引起尿路感染。女性常见的 生殖道感染病原包括滴虫、霉菌和衣原体等，生殖道感染绝大多数先由阴道感染而起；因病 情迁延扩散可引起盆腔炎，并导致不孕症。泌尿生殖道感染是"小疾病，大麻烦"，还可增加 艾滋病和淋病等性病的危险；患者生活质量明显下降，精神负担很重。妊娠妇女可出现一系 列妊娠并发症，如早产及绒毛膜羊膜炎等不良妊娠结局；分娩时由产道还可直接使新生儿 受同类病原体感染而致病。
[0003] 目前，泌尿生殖道感染的治疗主要依靠各种抗生素，但治疗效果不佳，治愈率在 40%以下，而且复发的比例很高，可达40%以上。原因主要是患者生殖道内耐药性病原菌的 存在致使抗生素失效；另外，抗生素治疗即使可以杀死病原菌，但同时也杀死了有益菌（益 生菌），因此，难以恢复健康状态下的泌尿生殖道优势菌群。
[0004] 健康育龄妇女泌尿生殖道内存在着大量的细菌，总称为泌尿生殖道菌群，其中包 括多种不同种类的细菌，可粗略分为"有益菌"和"致病菌"两大类，其中乳酸杆菌是维持泌 尿生殖道健康最常见和最重要的有益菌（"正义菌"），大肠埃希菌、葡萄球菌、滴虫、霉菌和 衣原体则为致病菌（"邪恶菌")。某些因素导致某一种致病菌异常增殖，引起泌尿生殖道感 染。阴道内细菌种类的变化与妇女和胎儿的健康密切相关，其中的弯曲乳杆菌和詹氏乳酸 杆菌是维持阴道健康微生态环境的主要优势"正义菌"，可占健康泌尿生殖道菌群细菌总量 的90%以上。它们主要通过抑制外来的病原菌和其他条件致病菌（"邪恶菌"）的生长和 侵入来维持泌尿生殖道菌群的健康环境，"正义菌（有益菌）"战胜"邪恶菌"的作用机制主 要包括以下几方面：（1)通过分解阴道黏膜上皮中贮存的糖原产生乳酸、乙酸等酸性物质， 维持阴道的酸性环境，以抑制病原菌的的生长；（2)产生过氧化氢和乳酸菌素等多种抑菌 物质，用以杀死入侵的病原菌；（3)乳酸杆菌类有益菌通过在阴道黏膜上皮定植后，会形 成先入为主的占位保护作用，阻止病原微生物的入侵。
[0005] 育龄妇女随年龄增长，阴道内弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌数量会逐渐减少。绝经 后，卵巢雌激素分泌逐渐停止，阴道上皮细胞糖原储备缺乏，阴道pH上升，弯曲乳杆菌 或詹氏乳酸杆菌会进一步减少，致病菌因而增多。所以，弯曲乳杆菌或詹氏乳酸杆菌对老 年妇女的泌尿生殖健康也具有重要作用。
[0006] 微生态学理论认为，通过生态制剂调整疗法，扶正和保护阴道内的优势菌群的组 成和比例，可以驱除外来"邪恶的"致病菌的侵扰，提高妇女本身固有的"扶正祛邪"的自 我保护作用。乳杆菌是健康妇女阴道菌群的优势菌群，占阴道细菌总量90%以上，泌尿生殖 道感染患者阴道乳酸杆菌明显减少，有的甚至完全检测不到，因此，丧失了抵御外来病原菌 感染的能力。而通过补充缺失的乳杆菌，则有利于重建女性泌尿生殖道的优势菌群，恢复其 固有的"扶正祛邪"的保护作用。
[0007] 泌尿生殖道感染是妇女的常见病、多发病、易于复发，用抗生素虽有较好的短期 疗效，但却有40%的复发率。研究证明：有保护作用的优势菌株一弯曲乳杆菌或詹氏乳酸 杆菌的制剂将更容易在阴道内定居和增殖，并产生抗菌物质，发挥持久的作用。因此，开 发适应我国妇女特点的特异性阴道乳杆菌制剂市场前景广阔，改变以往在治疗泌尿生殖道 感染上的纯粹杀菌的用药指导思想，避免由于大量应用抗生素作为治疗所带来的一系列不 良反应和弊端，有利于恢复女性泌尿生殖道的优势菌群并重建其微生态平衡；从而有效降 低泌尿生殖道感染的复发率，真正治愈女性泌尿生殖道感染。
[0008] 目前，国内女性泌尿生殖道感染用益生菌菌剂只有一种，其主要成分是德氏乳杆 菌活菌。虽然它是从健康妇女阴道分离出来的一种乳杆菌，但不是我国妇女阴道菌群中的 主要有益菌，我国健康妇女阴道细菌以弯曲乳杆菌为主。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一株弯曲乳杆菌及其应用。
[0010] 本发明提供一株弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为CGMCC No.9388 ；
[0011] 所述弯曲乳杆菌的菌落直径大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落边 缘整齐、较湿润，大小形态稳定；革兰染色阳性；处于对数生长期的所述弯曲乳杆菌经鉴定 为无芽胞的杆菌，无鞭毛；兼性厌氧，生长最适温度37-42°C，最适pH5. 8-6. 2,可发酵葡萄 糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
[0012] 一种菌剂也属于本发明的保护范围，含有上述弯曲乳杆菌和/或上述弯曲乳杆菌 的发酵物。
[0013] 上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备维持酸性环境的产品中的应用也属于本发明 的保护范围；
[0014] 所述酸性环境具体为泌尿生殖道的酸性环境，再具体为人的泌尿生殖道的酸性环 境；
[0015] 所述泌尿生殖道具体为阴道。
[0016] 上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备抑制病原菌和/或条件致病菌的生长和/或繁 殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
[0017] 所述病原菌和/或条件致病菌具体为泌尿生殖道的病原菌和/或条件致病菌，再 具体为人的泌尿生殖道的病原菌和/或条件致病菌；
[0018] 所述泌尿生殖道具体为阴道。
[0019] 上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备对泌尿生殖道的上皮细胞具有粘附定植能力 的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染的产品中的 应用也属于本发明的保护范围。
[0021] 上述弯曲乳杆菌或上述菌剂在制备预防和/或治疗泌尿生殖道感染进而引发的 疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0022] 上述任一所述的应用中，所述泌尿生殖道为阴道。
[0023] 本发明提供的弯曲乳杆菌（Lactobacillus, crispatus) IMC-12,具有较强的产生 H202的能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长，同时又具有较强的对阴道 上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。弯曲乳杆菌頂C-12在泌尿生殖道感 染防治方面具有一定的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为弯曲乳杆菌MC-12菌落。
[0025] 图2为弯曲乳杆菌MC-12与阴道上皮细胞的粘附作用。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 健康妇女阴道分泌物样品由瀚思维康健康管理机构提供。
[0029] MRS液体培养基的制备：将蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母膏5. 0g，柠檬酸 氢二铵2. 0g，葡萄糖20. 0g，吐温801.0mL，乙酸钠（CH3C00Na · 3H20)5. 0g，磷酸氢二钾 (Κ2ΗΡ04 · 3Η20)2· 0g，硫酸镁（MgS04 · 7Η20)0· 58g，硫酸锰（MnS04 · Η20)0· 25g 溶于蒸馏水， 并用蒸馈水定容至l〇〇〇mL，调至pH至6· 2-6. 6。
[0030] 实施例1、弯曲乳杆菌菌株的分离和鉴定
[0031] 一、弯曲乳杆菌菌株的分离
[0032] 将收集的200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品依次 编号，并接种于MRS液体培养基，37°C厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。将分离到的数百株细菌分别进行菌种 鉴定、产过氧化氢及与阴道上皮细胞粘附作用的检测，把其中一株具有较强粘附作用且产 过氧化氢的弯曲乳杆菌命名为頂C-12。
[0033] 二、弯曲乳杆菌菌株的鉴定
[0034] (一）形态学鉴定
[0035] 在MRS乳酸杆菌培养基平板上，上述步骤一分离得到的菌株MC-12表现为菌落 直径大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定 (如图1所示）。
[0036] 处于对数生长期的所述弯曲乳杆菌经鉴定为：革兰染色阳性，无芽胞的杆菌，无鞭 毛。
[0037] (二）生理生化特征分析
[0038] 菌株頂C-12兼性厌氧，生长最适温度37-42°C，最适ρΗ5· 8-6. 2。根据API细菌鉴 定标准，利用API 50 CHL培养基和API 50 CH试剂条（购自bioMe' rieux，Inc.，Marcy Γ Etoile，France)对检测菌株頂C-12进行糖发酵反应判读检测菌株頂C-12的生理生化 特征。API 50 CHL是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CH试验条组成的简易培养基。 以检测菌株IMC-12制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产 酸，pH下降，使指示剂变色。
[0039] 结果显示，菌株MC-12可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
[0040] (三）16s rDNA序列同源性分析
[0041] 提取菌株MC-12的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增， 得到含有菌株MC-1216S rRNA基因保守区的片段。
[0042] 27f (上游引物）：5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，（SEQ ID No. 1);
[0043] 1492r (下游引物）：5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' （SEQ ID No. 2)。
[0044] PCR体系（25 μ L) :PCR扩增缓冲液，终浓度为200 μ mol/L dNTPs，终浓度均为 0· 2 μ mol/L的上游及下游引物，1 U Taq DNA聚合酶，1 μ L模板DNA，余量为ddH20。
[0045] PCR 条件：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 40s，72°C延伸 30s，共 25 个 循环；72°C延伸lOmin。
[0046] PCR扩增得到的菌株頂C-12的16s rDNA的序列如SEQ ID No. 3所示。
[0047] 菌株IMC-12的分类命名为弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)，该菌株已于 2014年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC No. 9388。
[0048] 实施例2、弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12的功能分析
[0049] 一、弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus) IMC-12 产 H202 的检测
[0050] ( -）H202标准曲线的制作：首先用浓度为100mmol/L的哌嗪-N，Ν' -二-乙磺酸 (Piperazine_N，N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)的水溶液将体积百分含量为 30% 的H202水溶液（相当于9. 128mol/L)储存液稀释成lmol/L，再用lOOmmol/LPIPES的水溶液 将上述 lmol/L 的 H202 分别稀释成 20 μ mol/L、40 μ mol/L、60 μ mol/L、80 μ mol/L、100 μ mol/ L，将上述各稀释液以及100mm〇l/L PIPES的水溶液记作H202工作液；然后分别取100μ L 上述H202工作液与100 μ L浓度为20mmol/L的TMB (四甲基联苯胺）的水溶液、2 μ L浓度 为lmg/mL的辣根过氧化物酶（购自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min，测量0D63Q值。以 H202的浓度（单位：μ mol/L)为横坐标，0D63(I为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式 y = 0. 0033X-0. 0496, R2 = 0. 992。
[0051] (二）弯曲乳杆菌IMC-12液体培养H202浓度检测：挑取弯曲乳杆菌IMC-12菌落， 将其接种于MRS液体培养基，在厌氧条件下进行培养48h，取lmL接种于10mL MRS液体培养 基中，使培养液中菌的浓度为l〇5cfu/ml，于厌氧环境下，37°C静置培养21h后，转换为37°C 振荡培养3h，转速为220r/min，旋转半径为2. 54cm。培养结束后，收集培养液，12000r/min 离心2min，得上清。取100 μ L上清与100 μ L浓度为20mmol/L的TMB (四甲基联苯胺）的 水溶液、2 μ L浓度为lmg/mL的辣根过氧化物酶（购自TaKaRa公司）混合，16°C孵育10min， 测量(》63(|值，将其带入步骤（一）得到的标准曲线公式，计算上清中的H 202浓度。实验重 复三次，结果取平均值。
[0052] 结果如表1所示。
[0053] 表1弯曲乳杆菌頂C-12产生H202的能力检测
[0054]
【权利要求】
1. 一株弯曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)，其保藏编号为 CGMCC No. 9388。
2. -种菌剂，含有权利要求1所述的弯曲乳杆菌和/或权利要求1所述的弯曲乳杆菌 的发酵物。
3. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备维持酸性环境的产品 中的应用。
4. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备抑制病原菌和/或条 件致病菌的生长和/或繁殖的产品中的应用。
5. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备对泌尿生殖道的上皮 细胞具有粘附定植能力的产品中的应用。
6. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备预防和/或治疗泌尿 生殖道感染的产品中的应用。
7. 权利要求1所述的弯曲乳杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备预防和/或治疗泌尿 生殖道感染进而引发的疾病的产品中的应用。
8. 根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于：所述泌尿生殖道为阴道。
【文档编号】A61P13/00GK104232537SQ201410446067
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】朱宝利, 张瑞芬, 李晶, 王江 申请人:中国科学院微生物研究所