哈尔明碱的新应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了哈尔明碱的新应用，该药物无论在体内和体外都能促进白色脂肪细胞褐色化，并能抵抗高脂饮食诱导的肥胖以及葡萄糖不耐受和胰岛素不敏感。
【专利说明】哈尔明碱的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别是涉及一种哈尔明碱的新应用。
【背景技术】
[0002] 长期W来，一直被认为脂肪细胞的主要功能是储存能量。但随着对脂肪细胞的深 入研究，脂肪细胞其它方面的功能也逐渐显露出来。研究表明脂肪细胞在免疫反应、高血 压、服胖、膜岛素抵抗等代谢疾病中都起着重要的作用。
[0003] 最初，脂肪细胞被分为两类；白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。白色脂肪细胞内含有 一个巨大的圆形脂滴，细胞核呈扁平状且位于细胞边缘。脂滴几乎占据了细胞的99%的空 间。白色脂肪细胞主要是通过甘油H醋和胆固醇的形式，将能量储存于脂滴当中。但是白 色脂肪细胞不仅可W储存能量，它还可W分泌脂肪细胞因子如；脂联素、瘦素、抵抗素、肿瘤 坏死因子a等等。该些脂肪细胞因子在能量代谢调节、免疫反应等多种生理现象中发挥着 重要作用。
[0004] 褐色脂肪细胞的外形呈多边形，细胞核为圆形，且细胞内的脂滴呈多室分布于整 个细胞中。褐色脂肪细胞含有大量的细胞质基质，并且细胞内的线粒体含量很高。因为线粒 体内的细胞色素含有铁原子，所W含有大量线粒体的褐色脂肪细胞的颜色为褐色。褐色脂 肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是：线粒体内膜上的解偶联蛋白1的表达量很高。 所W，褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCPl (解偶联蛋白1)来产热从而消耗能量而不产 生ATP ;即褐色脂肪细胞可W通过UCPl，将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联，进而 通过氧化磯酸化解偶联呼吸，将脂肪酸目氧化产生的能量W热量的形式散失掉。褐色脂肪 细胞的非颤栗性产热功能，可W维持体温恒定，也可W W热能的方式消耗机体摄入的能量， 从而降低服胖发生。近年的研究表明，移植了褐色脂肪组织的小鼠能够有效的抵抗高脂饮 食诱导的服胖和膜岛素抵抗。
[0005] 随着研究的不断深入，发现晒齿动物腹股沟部位的白色脂肪组织内也存 在高表达UCPl的和线粒体较多的类似于褐色脂肪细胞的细胞，该类细胞被称之为 beige化rown-in-white，brite)细胞的发现。褐色脂肪细胞又可W被细分为两类；经典的 褐色脂肪细胞与brite/beige脂肪细胞，两种褐色脂肪细胞的分布是不同的，经典的褐色 脂肪细胞主要分布于晒齿动物的肩肿骨区域，而Beige脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的 皮下脂肪组织中。对于人类来说，褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内，但是目前研究发现， 成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞，且它们与晒齿动物的beige脂肪细 胞相似。除了分布差异外，两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉 细胞同源。但是beige脂肪细胞存于白色脂肪组织中。研究证明该类型细胞可由白色脂肪 细胞转分化而来，此过程被称为白色脂肪细胞褐色化。促进白色脂肪细胞褐色化的细胞因 子FGF21等可W有效的抵抗服胖等疾病的发生。
[0006] 因此寻找能够促进白色脂肪细胞褐色化的药物成为了研究热点，此类研究对于人 类服胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。
【发明内容】
[0007] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种哈尔明碱化armine，Cas号：442-51-3,分 子式C13H12N2O,分子量212. 25,用途为中枢神经系统兴奋剂）的新应用，其可W促进白色脂 肪细胞褐色化，从而用于治疗服胖等相关疾病。
[0008] 为实现W上目的，技术方案如下：
[0009] 哈尔明碱在制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。
[0010] 本发明还公开了哈尔明碱在制备治疗服胖的药物中的应用。
[0011] 本发明还公开了哈尔明碱在制备抵抗高脂饮食诱导的葡萄糖不耐受的药物中的 应用。
[0012] 本发明还公开了哈尔明碱在制备抵抗高脂饮食诱导的膜岛素不敏感的药物中的 应用。
[0013] 本发明相对于现有技术的优点和有益效果为：
[0014] 本发明探索出了哈尔明碱在制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用，该药 物无论在体内和体外都能促进白色脂肪细胞褐色化，在体外能够促进原代的白色脂肪细胞 褐色化，增强褐色脂肪细胞标志基因解偶联蛋白1的表达，在体内能够促进腹股沟的白色 脂肪组织中的beige脂肪细胞的增多和解偶联蛋白1的表达；并能抵抗高脂饲料诱导的服 胖W及葡萄糖不耐受和膜岛素不敏感。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是哈尔明碱在体外剂量依赖性的促进白色脂肪细胞的解偶联蛋白1的表达， 显示不同浓度的哈尔明碱对UCPl表达的影响；
[0016] 图2是哈尔明碱在小鼠体内促进白色脂肪细胞的解偶联蛋白1的表达，显示哈尔 明碱促进白色脂肪组织中的UCPl表达；
[0017] 图3是哈尔明碱在小鼠体内抵抗高脂饲料诱导的服胖，显示哈尔明碱能抵抗高脂 饲料诱导的小鼠的服胖；
[0018] 图4是哈尔明碱在小鼠体内抵抗高脂饲料诱导的葡萄糖不耐受，显示哈尔明碱处 理的小鼠表现出更好的葡萄糖耐受；
[0019] 图5是哈尔明碱在小鼠体内抵抗高脂饲料诱导的膜岛素抵抗，显示哈尔明碱处理 的小鼠表现出更好的膜岛素敏感。
【具体实施方式】
[0020] W下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0021] 如无特殊说明，W下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常 规操作方法。
[0022] 实施例1哈尔明碱在体外呈剂量依赖性促进白色脂肪细胞褐色化
[0023] 腹股沟的白色脂肪的原代脂肪间充质细胞的分离
[0024] 1)取一只巧7BL/6小鼠（购于北京维通利华实验动物技术有限公司），断颈处死， 在75%的酒精中浸泡5分钟，然后转移到操作台中，取出腹股沟的白色脂肪；
[00巧]2)用PBS清洗3次，用剪刀将脂肪组织剪碎，Ig脂肪组织加入IOml胶原酶I溶液 (用D-Hanks溶液配制，IOOml加入0. Ig胶原酶I)，放置37C消化40分钟；
[0026] 3)用250 ym滤膜过滤，加入细胞培养液，然后转移到离也管中，10(K)rpm离也3分 钟；
[0027] 4)第一次离也后的底部细胞为脂肪间充质细胞，弃除上清后，用新鲜的培养液息 起，铺到培养板中，第二天换液；
[002引 W获得的脂肪间充质细胞在添加10%胎牛血清曲clone)高糖的DMEM曲clone) 的培养液生长至满；
[0029] 6)更换培养液为添加了 MDIR(0. 5mM异下基黄嘿岭，1 U M地塞米松，87nM膜岛素和 0.5111罗格列丽：111^(+06义+1]13111；[]1+1'〇31肖1；[1320]16)的诱导培养液（添加10%胎牛血清 高糖的DMEM的培养液），培养2天；
[0030] 7) 2天后，培养液更换为只添加IR(87nM膜岛素和0. 5 y M罗格列丽： Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液（添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培养液），每两 天更换一次，直到细胞完全分化为脂肪细胞；
[0031] 8)将培养基更换为正常的培养基（添加10%胎牛血清高糖的DMEM的培养液），同 时添加不同浓度的哈尔明碱化1,0. 5，l，5，10yM)刺激两天。两天后，裂解细胞，实时英光 定量PCR检测UCPl的mRNA表达。
[0032] 脂肪细胞的基因表达鉴定
[003引 RNA提取；利用Trizol法提取，具体操作如下：
[0034] 1)将分化后的细胞取出，移除培养基，用PBS洗涂一次，然后加入Iml Trizol,裂 解30分钟，然后转移到EP管中；
[00对。加入200 ill氯仿/ml Trizol,用力振荡混匀15砂，室温放置3分钟，4。 12, OOOg离也15分钟；
[0036] 3)溶液分成H层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相，小也 吸取上清至新的离也管；
[0037] 4)加入500 ill异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，4°C，12, OOOg离也10分钟；
[0038] 5)小也去除上清，加入lml75%己醇值EPC水配制），轻轻混匀，息浮沉淀，4C， 7500g离也5分钟；
[003引 6)去除上清，自然烘干5分钟左右，加入40 y 1 DEPC水溶解RNA沉淀；
[0040] 7)取5 y 1进行电泳检测提取RNA的质量，28S条带亮度是18S条带两倍的RNA是 质量较好的RNA，凝胶与电泳缓冲液需新鲜配制；
[00 川 8)取 2 ill 测定 RNA 浓度，RNA 的浓度=ODseoX 稀释倍数 XO. 04 y g/ y L，00260?/ 0028。"在1. 8?2. 0视为抽提的RNA的纯度很高。
[0042] RNA逆转录：利用SuperScriptTM II RT逆转录试剂盒合成cDNA ;
[0043] 英光实时定量 PCR ;采用 Takara 公司 SYBR饭 RT-PCR KiUPerfect Real Time) 定量PCR试剂盒，根据说明进行定量PCR反应。
[0044] 反应条件：
[004引 预变性；95 °C 20砂；
[0046]变性；95°C，10 砂；
[0047]退火；6(TC，20 砂；
[004引赔育；70 C 1砂；
[0049] 根据基因的表达量重复38?45个循环，65?95C做溶解曲线，每0. 5C读一次 板，时间为1砂。
[0050] 由图1可知，UCPl的实时定量qPCR结果显示随着哈尔明碱药物浓度的提高，白色 脂肪细胞中的UCPl的表达量也随之上升，说明UCPl的表达对药物呈剂量依赖性。
[00川 实施例2
[0052] 8周龄的小鼠分为两组，每组9只，对照组和给药组。对照组为高脂饲料（60%化t， D12492, Research Diets)喂养并灌胃生理盐水（每天灌胃一次），给药组在与对照组同样 的高脂饲料喂养下并灌胃哈尔明碱巧Omg/kg，每天灌胃一次，生理盐水作为溶剂）。给药8 周后，检测体内腹股沟和附睾的白色脂肪组织褐色化和体重称量。
[0053] 脂肪组织的基因表达鉴定
[0054] RNA提取；利用Trizol法提取，具体操作如下：
[005引将小鼠分离的脂肪组织称取lOOmg，然后加入Iml的Trizol,用研磨棒研磨30分 钟，然后转移到EP管中；其余步骤与实施例1中RNA提取的步骤2?8相同。脂肪细胞的 UCPl基因表达鉴定方法也与实施例1相同。
[0056] 分别取给药8周后的对照组和给药组的小鼠的白色脂肪组织附睾脂肪和腹股沟 皮下脂肪，实时定量qPCR检测UCPl的mRNA表达水平，发现给药组的UCPl的表达量上升， 结果见图2。
[0057] 在给药期间，每周进行小鼠的体重称量，从给药第四周后，给药组的小鼠体重低于 对照组。结果见图3。
[00则 实施例3
[005引 8周龄的小鼠分为两组，每组9化对照组和给药组。对照组为高脂饲料（60%化t， D12492, Research Diets)喂养并灌胃生理盐水（每天灌胃一次），给药组用与对照组同样 的高脂饲料喂养并灌胃哈尔明碱巧Omg/kg，每天灌胃一次，生理盐水作为溶剂）。给药8周 后，进行葡萄糖耐受实验或膜岛素耐受实验。
[0060] 葡萄糖耐受实验
[0061] 实验方法：用生理盐水配制20%的葡萄糖溶液，然后按照2g葡萄糖Ag体重的剂 量注射小鼠，腹腔注射经12小时禁食（晚上9点?次日早上9点）的小鼠。W血糖仪监测 注射前（0分钟）W及注射后小鼠在不同时间点的血糖浓度（15分钟、30分钟、60分钟、120 分钟），时间误差控制在5砂W内。
[0062] 用上述实验方法对给药8周后的对照组和给药组小鼠进行葡萄糖耐受实验，给药 组小鼠在实验中的30分钟，60分钟和120分钟的血糖浓度明显低于对照组小鼠，实验结果 证明给药组小鼠对葡萄糖表现出更加明显的耐受，结果见图4。
[0063] 膜岛素耐受实验
[0064] 实验方法：用生理盐水配制0. 05单位每毫升的膜岛素溶液，然后按照0. 5单位膜 岛素Ag体重的剂量注射小鼠，腹腔注射经6小时禁食（早上9点?下午3点）的小鼠，W 血糖仪监测注射前（0分钟）W及注射后小鼠在不同时间点的血糖浓度（15分钟、30分钟、 60分钟、120分钟），时间误差控制在5砂W内。
[0065] 用上述实验方法对给药8周后的对照组和给药组小鼠进行膜岛素耐受实验，给药 组小鼠的血糖在实验中的15分钟，30分钟，60分钟和120分钟明显低于对照小鼠。实验结 果证明给药组小鼠对膜岛素表现出更加明显的敏感性，结果见图5。
[0066] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，该些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【权利要求】
1. 哈尔明碱在制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。
2. 哈尔明碱在制备治疗肥胖的药物中的应用。
3. 哈尔明碱在制备抵抗高脂饮食诱导的葡萄糖不耐受的药物中的应用。
4. 哈尔明碱在制备抵抗高脂饮食诱导的胰岛素不敏感的药物中的应用。
【文档编号】A61P5/50GK104224780SQ201410523222
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】吴东海, 聂涛, 毛刘锋, 惠晓艳, 聂宝明, 李鹏, 徐爱民 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院