专利名称：一种喜树碱及其衍生物的纯化方法
技术领域：
本发明涉及医药及化工技术领域，具体设计喜树碱及其衍生物的纯化方法。
背景技术：
喜树碱及其衍生物具有下面的五环母体结构
一般由下列几类方法纯化 重结晶
喜树碱类化合物游离状态时一般水溶性、脂溶性均较差，故给一般溶剂体系的重结晶带 来很大难度。通常以有机酸醋酸、极性非质子溶剂DMF,DMSO等进行反复重结晶，效果粗略，
不能准确做到对特定杂质有针对性地分离纯化，亦难以通过控制纯化条件得到不同质量规
格的精制品。且母液中的样品与溶剂均不易回收套用。
化学纯化
2002年专利CN1491228A报道，通过3步化学方法进行喜树碱的纯化将喜树碱溶解于 碱溶液，使其内酯开环，再催化加氢还原，最后酸化水相使喜树碱结晶析出。此方法仅针 对喜树碱粗原料中的特殊杂质，通用性有限，且需要特殊的加氢设备和贵金属催化剂，成 本较高。 色谱纯化
利用制备或半制备色谱柱进行纯化，能够针对粗原料和杂质的特性优化色谱条件，以获得较好的分离度和洗脱效果，尽量减少主成分与杂质的交汇；同时可以通过跟踪监测洗脱 产品的色谱峰形来分类、分段收集不同规格的产品，或富集杂质。较好的色谱系统可以实 现快速、高效的分离，能够快速再生、循环使用；交汇部分的产品以及常规的有机洗脱剂 均能回收套用。
较常见的色谱方法是正相硅胶柱分离，以氯仿/甲醇洗脱(安辉，7-乙基-10-羟基喜树 碱的合成，中国医药工业杂志，2005, 36(5) 264-265)。此法常用于研发，大生产时大量 使用氯仿毒性过大，且溶剂价格昂贵。硅胶柱难以重复利用，分离速度慢。
2005年的专利CN1834097A[3]，利用正相硅胶柱进行HCPT的分离，使用大量DMF， DMS0 等强极性溶剂洗脱，在硅胶柱中易产生拖尾，且价格较高，通用性不强。
2005年的专利CN1760195A[4]，用硅胶柱分离9一硝基喜树碱，乙酸乙酯/正己烷洗脱， 此体系对大多数喜树碱类物质溶靜性很差，无法推广。
因此，增加喜树碱类物质在洗脱体系中的溶解性，优化洗脱条件，是提高色谱分离效率 的关键。
发明内容
本发明的目的是以精密、稳定的方法实现喜树碱及其衍生物的快速、连续分离纯化，显 著提高收率和产品质量，降低成本，使之更适应于工业生产。高质量、高收率的喜树碱系 列中间体是满足喜树碱类药物生产要求和进出口需要的有力保障。
为达到精细分离，保证一次分离精品纯度99%以上并保证收率，本发明采用了制备色谱 纯化方法。但是，由于喜树碱类物质的低脂溶性， 一般正相洗脱剂溶解性差，如使用氯仿/ 甲醇体系，大量使用氯仿毒性高，且溶剂价格贵，回收不易。研究发现，喜树碱类物质在 中性至碱性环境下，内酯环易开环失活，稳定性差；而在酸性条件下结构稳定，且溶解性 增加。此外，进一步的研究亦发现，用酸性水/醇体系的反相高效液相条件对喜树碱类物质 进行微量纯度分析，通常有更好的分离效果。根据上述性质和发现，本发明在反相制备液 相的醇/水或乙腈/水洗脱剂基础上引入缓冲体系，调节PH值至酸性，以助溶并起稳定喜树 碱内酯环结构的作用，必要时加入离子对试剂优化分离效果，最终获得了良好的纯化效果。
本发明公开了一种喜树碱及其衍生物的纯化方法，为利用制备色谱柱进行分离纯化，包 括样品溶解、上柱、洗脱及组分收集，其中，色谱柱洗脱采用的洗脱液为醇/水体系(即醇 与水相混合后的体系)或乙腈/水体系(即乙腈与水相混合后的体系)，在醇/水体系中，醇
选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或丁醇等C5以下的醇，且水相pH为2-5，优选2.5-3.7。 上述样品溶解的溶剂即为洗脱液。
上述制备色谱柱为常压、中压或高压制备色谱柱，其固定相填料可选自大孔树脂、反相 硅填料或酸性氧化铝，其中反相硅填料为球形或无定形的C18填料、C8填料、苯基填料或 氰基填料。
上述醇/水体系中，水相为酸性缓冲溶液，其中，配制缓冲溶液的酸选自盐酸、磷酸、 硼酸、甲酸、醋酸、三氟醋酸、邻苯二甲酸或酒石酸中的一种或多种；配制缓冲溶液的盐 选自磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硼砂、碳酸氢钠、碳酸钠、甲 酸钠、甲酸铵、醋酸钠、醋酸铵、三氟醋酸钠、三氟醋酸铵、邻苯二甲酸氢钠、邻苯二甲 酸二钠、邻苯二甲酸氢钾、邻苯二甲酸二钾、酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、酒石酸氢钾、酒 石酸二钠或酒石酸二钾中的一种或多种。如水相中含有甲酸-甲酸铵、醋酸-醋酸钠或醋酸 铵、磷酸一磷酸二氢钠或磷酸二氢钾，或三氟醋酸一三氟醋酸铵等缓冲对。
必要时，上述洗脱液中还可再添加微量C4-C20的烷基磺酸钠等离子对试剂，以增加保 留，改善分离效果，其中，C4-C20的烷基磺酸钠在洗脱液中的重量百分含量为万分之零点 二 万分之二十。
较佳的，上述醇/水或乙腈/水体系中，有机相与水相的体积比为9: 1 1: 9之间，优 选7: 3 3: 7。
组分收集时，可分段收集洗脱液，以做到分离不同组分或得到不同纯度水平的产品。 收集的中段洗脱液经浓缩蒸除大部分醇或乙腈，并加水稀释，所收集的醇或乙腈可回收 套用。水相调PH至中性后，直接析出产品晶体；或以常用二卤、三卣代烃(如二氯甲烷、 1， 2 —二氯乙垸、三氯甲烷等)萃取，浓縮后得到产品晶体。所得晶体经不良溶剂如甲醇、
乙醇、乙酸乙酯、正己垸、丙酮等洗涤后，即得到99%以上的精品。 一次收率60—95%左 右。含有产品的前、后段洗脱液可合并收集，作为新的批次循环纯化，以进一步提高收率， 避免浪费。
当喜树碱衍生物是盐的形式时，经分离及收集、后处理后成为游离碱。可以采用通用的 成盐方法使其重新成盐。如将产物溶解或混悬于甲醇、乙醇等溶剂，搅拌下通入氯化氢气 体，使其成为盐酸盐后，过滤，丙酮洗涤即可。
本发明中，喜树碱及其衍生物在喜树碱五环结构母体基础上，Rl代表H, C1-C20的烷基、 C1-C20的取代垸基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮，羧基，酯基，羟基，苄基或取代 苄基，氰基，硝基，卤素原子，杂环取代基等，
R2代表H， CI-C20的烷基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，卤素原子，杂环取代基等，
R3代表H， CI-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，哌啶基哌啶，以及其它杂 环取代基等，
R4代表H, C1-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，杂环取代基等，
R5代表H， CI-C20的垸基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，杂环取代基等，
R6选自H， C1-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，酰基等，
R7选自H， C1-C20的垸基，Q-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，或杂环取代基， 以及上述物质可能的盐形式。
上述喜树碱及其衍生物包括但不限于喜树碱、7—乙基喜树碱、5—羟基喜树碱、10— 羟基喜树碱、IO—甲氧基喜树碱、5， IO—二羟基喜树碱、5—羟基一9一溴一10—甲氧基喜 树碱、7—乙基—IO—羟基喜树碱、7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜树碱、9一氨基喜 树碱、12 —硝基喜树碱、12 —氨基喜树碱、9一硝基一10—羟基喜树碱、9-硝基-10-烯丙基 喜树碱、9一硝基一10—炔丙基喜树碱、9一烯丙基喜树碱、9一炔丙基喜树碱、9一烯丙基 一10—羟基喜树碱、9一炔丙基一10—羟基喜树碱、10_ (3—烯丙氧基)喜树碱、IO— (3 一炔丙氧基)喜树碱、20—乙酰氧基喜树碱。
本纯化方法能够针对产品和杂质的特性优化色谱条件， 一次分离纯度可达99%以上，即 能够做到精密地分离主产物和杂质。 一次收率可高达90%以上，交汇和杂质部分均能够分 段收集、循环纯化，避免浪费。所用色谱柱能够重复使用，洗脱剂低毒价廉，其中有机相 可以回收套用，经济环保。分离周期短，能够快速稳定进行规模化生产。
图1:喜树碱及其衍生物的纯化的工艺流程图
具体实施例方式
以下列举具体实施例以进一步阐述本发明，应理解实施例并非用于限制本发明的保护范围。
下述实施例的工艺流程图均如图1所示。
实施例1
洗脱液配制
将250克甲酸铵溶解于25L水，加入甲酸调节PH值至3，再加入2. 5克庚垸磺酸钠， 溶解至澄清。取此缓冲液与甲醇按照体积比40/60混合得到30L洗脱液，超声10分钟待用。 色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1.5KG C18球形反相硅填料(10—20 um， 120A),加入4. 5L甲 醇，搅拌成匀浆，超声后装填入直径为10cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰， 以600ml/min流速，泵入洗脱液，30分钟后，柱内甲醇被替换完全并活化。将柱压调至53bar， 再以400ml/min流速活化1小时。 样品分离
取7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜树碱盐酸盐粗原料(含量89.9%) 20克，溶解 在300ml洗脱液中，过滤，以300ml/min流速泵入柱内，以400ml/min流速等度洗脱，在 紫外检测器下用350nm波长监测，38min时，7-乙基-10-(4'-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜树碱峰 出现并上升，收集组分I，直至48min时，主峰逐渐下降至峰高的1/3处。继续收集组分 II，直至7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜树碱成分完全流出。整个分离过程约60分 钟。
后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收甲醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至6—7，以二氯 甲垸萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至干， 得黄色固体。最后以正己垸100ml洗涤并过滤，得7-乙基-10- (4'-哌啶基哌啶-)羰酰氧基喜 树碱精品16.4克，HPLC检测，纯度99.4%，最大单一杂质0.08%，收率91.2%。洗脱液 II同法处理，蒸除二氯甲烷后得固体约1.42克，待分离15批后，合并所有组分II为新一 批粗品，进行再次纯化。
收集所得产品均已转化为游离碱形式。将10克该游离碱溶解于80ml乙醇，搅拌下通入 干燥的氯化氢气体，渐渐析出黄色固体。4小时后，成盐完毕，过滤，以30ml丙酮洗涤滤 饼。滤饼6(TC真空干燥4小时，即得到7-乙基-10- (4，-哌啶基哌啶-)羰酰氧基喜树碱盐酸盐。
实施例2 洗脱液配制-
取无水醋酸钠600克，加水9L溶解后，加入冰醋酸2. 1L，再加水稀释至30L，溶液PH 值为3.7。再将此缓冲液与乙醇按照体积比50/50混合为30L洗脱液，超声10分钟待用。 色谱柱装填
在10L的大烧杯内，称取已经盐酸、乙醇预处理的1.5KG弱极性大孔树脂，加入6L乙 醇，搅拌均匀后装填入直径为10cra的中压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 400ml/min流速，泵入洗脱液，30分钟后，柱内乙醇被替换完全。将柱压调至30bar，再以 300ml/min流速活化1小时。 样品分离-
取7—乙基一10—羟基喜树碱粗原料20克(含量87.7%)，溶解在400ml洗脱液中，过 滤，以200ml/min流速泵入柱内，以300ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用348nm 波长监测，28min时，7—乙基一10—羟基喜树碱峰出现并上升，收集为组分I，直至42min 时，主峰逐渐下降至峰高的1/2处。继续收集，合并为组分II，直至7—乙基一10—羟基 喜树碱成分完全流出。整个分离过程约50分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收大部分乙醇，再加入1L水稀释，以饱和小苏打溶液调节 水相PH值至6—7。析出黄色固体。过滤，固体以甲醇30ml洗涤，干燥，得16.1克精品， HPLC检测，纯度99.2%,最大单一杂质O. 10%，收率91.8%。洗脱液II同法处理，过滤 后得固体约1.2克，待分离17批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
实施例3 洗脱液配制
取磷酸二氢钾3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸调节pH值至2. 5，以水稀释至30L。再将 此缓冲液与甲醇按照体积比50/50混合为60L洗脱液，超声10min待用。 色谱柱装填-
在10L的大烧杯内，称取2.5KG酸性氧化铝填料，加入6L甲醇，搅拌成匀浆，超声后 装填入直径为12cm的中压不锈钢色谱柱内，抽取液体。配制盖上法兰，以200ml/min流速， 泵入洗脱液，30分钟后，柱内甲醇被替换完全，再以200ml/min流速冲洗30分钟。
样品分离
取IO—羟基喜树碱粗原料40克(含量72.3%)，溶解在800ml洗脱液中，过滤，以 100ml/min流速泵入中压制备柱内，以100ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用267nm 波长监测，95min时，IO —羟基喜树碱逐渐出现并上升，收集组分I。至llOmin分钟，开 始收集组分II。直至180min时，主峰逐渐下降至峰高的1/4处。继续收集组分III，直至 10—羟基喜树碱成分完全流出。整个分离过程约240分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液n蒸除并回收甲醇，再加入2L水稀释，以饱和小苏打溶液调节水相ra
值至6_7。析出黄色固体。过滤，固体以甲醇400ml洗涤，干燥，得23.4克精品，HPLC 检测，纯度99. 1%，最大单一杂质O. 10%，收率80.9%。洗脱液I、 III同法处理，过滤 后得固体约4.2克，待分离10批后，合并所有组分I和组分III为新一批粗品，进行再次 纯化。
实施例4
将200克三氟醋酸铵溶解于25L水，加入三氟醋酸酸调节PH值至3. 7，再加入2. 0克十 二烷磺酸钠，溶解至澄清。取此缓冲液与异丙醇按照体积比40/60混合得到30L洗脱液， 超声10分钟待用。 色谱柱装填-
在5L的大烧杯内，称取1KG C8球形反相硅填料(10—20um， 200A)，加入4. 5L异丙 醇，搅拌成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰， 以400ml/min流速，泵入洗脱液，15分钟后，柱内异丙醇被替换完全并活化。将柱压调至 55bar，再以300ml/min流速活化20分钟。 样品分离
取9-烯丙基-10-羟基喜树碱粗原料(含量65. 0%) 20克，溶解在300ml洗脱液中，过滤， 以250ml/min流速泵入柱内，以250ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用267nm波长 监测，28min时，9-烯丙基-10-羟基喜树碱出现并上升，收集组分I，直至48min时，主峰 逐渐下降至峰高的1/3处。继续收集组分II，直至9-烯丙基-10-羟基喜树碱成分完全流出。 整个分离过程约65分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收异丙醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至6—7，以三
氯甲垸萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至 干，得黄色固体。最后以丙酮80ml洗涤并过滤，得9-烯丙基-10-羟基喜树碱精品9.8克， HPLC检测，纯度99.2%，最大单一杂质O. 15%，收率75.3%。洗脱液II同法处理，蒸除 三氯甲烷后得固体约2.6克，待分离8批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯 化。
实施例5
洗脱液配制
取磷酸二氢钠3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸调节pH值至2.5,以水稀释至30L。再将 此缓冲液与甲醇按照体积比45/55混合为60L洗脱液，超声10min待用。 色谱柱装填
在10L的大烧杯内，称取1.5KG C18球形反相硅填料(20 — 50 um， 200A)，加入4. 5L 甲醇，搅拌成匀浆，超声后装填入直径为10cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法 兰，以600ml/min流速，泵入洗脱液，20分钟后，柱内甲醇被替换完全并活化。将柱压调 至53bar，再以400ml/min流速活化30分钟。 样品分离
取喜树碱粗原料30克(含量65. 5%)，溶解在1000ml洗脱液中，过滤，以400ml/min 流速泵入中压制备柱内，以300ml/niin流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm波长监测， 35min时，喜树碱逐渐出现并上升，收集组分I。至42min分钟，开始收集组分II。直至 70min时，主峰逐渐下降至峰高的1/3处。继续收集组分III，直至喜树碱成分完全流出。 整个分离过程约90分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收大部分甲醇，再加入1L水稀释，以饱和小苏打溶液调节 水相ra值至6。析出黄色固体。过滤，固体分别以甲醇30ni1,丙酮60ml洗涤，干燥，得 14.0克精品，HPLC检测，纯度99.2%，最大单一杂质0.38%，收率71.2%。洗脱液I和 III同法处理，过滤后得固体约5.2克，待分离6批后，合并所有组分I和III为新一批粗 品，进行再次纯化。
实施例6
洗脱液配制
取醋酸铵500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀释至30L，并以冰醋酸调 节溶液PH值为5. 0。再将此缓冲液与乙醇按照体积比40/60混合为60L洗脱液，超声10分 钟待用。 色谱柱装填
在10L的大烧杯内，称取己经盐酸、乙醇预处理的1.5KG弱极性大孔树脂，加入6L乙 醇，搅拌均匀后装填入直径为10cm的中压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 400ml/min流速，泵入洗脱液，15分钟后，柱内乙醇被替换完全。将柱压调至30bar，再以 300ml/min流速活化20分钟。
取20—乙酰氧基喜树碱粗原料20克(含量90.0%)，溶解在350ml洗脱液中，过滤， 以300ml/min流速泵入柱内，以300ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm波长 监测，25min时，20—乙酰氧基喜树碱峰出现并上升，收集为组分I，直至40min时，主峰 逐渐下降至峰高的l/4处。继续收集，合并为组分II，直至20—乙酰氧基喜树碱成分完全 流出。整个分离过程约50分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收异丙醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至7，以三氯 甲烷萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至干， 得黄色固体。过滤，固体分别以丙酮30ml，正己垸30ml洗涤，干燥，得16.2克精品，HPLC 检测，纯度99.7%，最大单一杂质0.04%，收率90.0%。洗脱液II同法处理，过滤后得 固体约1.68克，待分离12批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
实施例7 洗脱液配制
将200克三氟醋酸铵溶解于25L水，加入三氟醋酸酸调节PH值至2.3，溶解至澄清。取 此缓冲液与甲醇按照体积比30/70混合得到60L洗脱液，超声IO分钟待用。
在10L的大烧杯内，称取2.5KG酸性氧化铝填料，加入6L甲醇，搅拌成匀浆，超声后 装填入直径为12cm的中压不锈钢色谱柱内，抽取液体。配制盖上法兰，以200ml/min流速， 泵入洗脱液，30分钟后，柱内甲醇被替换完全，再以200ml/min流速冲洗30分钟。 样品分离-取IO—甲氧基喜树碱粗原料30克(含量85. 3%)，溶解在800ml洗脱液中，过滤，以 100ml/min流速泵入中压制备柱内，以100ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254咖 波长监测，75min时，IO—甲氧基喜树碱逐渐出现并上升，收集组分I。直至120min时， 主峰逐渐下降至峰高的1/3处。继续收集组分II，直至10—甲氧基喜树碱成分完全流出。 整个分离过程约200分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收甲醇，再加入2L水稀释，以饱和小苏打溶液调节水相PH 值至6 — 7。析出黄色固体。过滤，固体以甲醇100ml洗涤，干燥，得22.0克精品，HPLC 检测，纯度99.3%，最大单一杂质0.10%，收率86.0%。洗脱液II同法处理，过滤后得 固体约2.4克，待分离12批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
实施例8 洗脱液配制-
取醋酸铵500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀释至30L，并以冰醋酸调 节溶液PH值为5.0。再将此缓冲液与甲醇按照体积比50/50混合为50L洗脱液，超声10分 钟待用。 色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1.2KGC18球形反相硅填料(10—20um， 120A)，加入6L甲醇， 搅拌成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 400ml/min流速，泵入洗脱液，20分钟后，柱内甲醇被替换完全并活化。将柱压调至50bar， 再以300ml/min流速活化30分钟。 样品分离
取9-氨基喜树碱粗原料(含量72.0% )30克，溶解在500ml洗脱液中，过滤，以300ml/min 流速泵入柱内，以300ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm波长监测，23min时， 9-氨基喜树碱出现并上升，收集组分I，直至48min时，主峰逐渐下降至峰高的1/3处。继 续收集组分II，直至9一氨基喜树碱成分完全流出。整个分离过程约60分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收甲醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至7，以三氯甲垸 萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至干，得
黄色固体。最后以丙酮80ml洗涤并过滤，得9-氨基喜树碱精品19.8克，HPLC检测，纯度 99.5%,最大单一杂质O. 13%，收率91.67%。洗脱液II同法处理，蒸除三氯甲烷后得固 体约1.6克，待分离19批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
实施例9 洗脱液配制
.取磷酸二氢钠3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸调节pH值至2.5,以水稀释至60L。再将 此缓冲液与甲醇按照体积比30/70混合为60L洗脱液，超声lOmin待用。 色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1.5KG C8无定形反相硅填料(10—20um)，加入6L甲醇，搅 拌成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 400ml/min流速，泵入洗脱液，20分钟后，柱内甲醇被替换完全并活化。将柱压调至50bar， 再以300ml/min流速活化30分钟。 样品分离
取12-硝基喜树碱粗原料(含量82. 7% )40克，溶解在900ml洗脱液中，过滤，以300ml/min 流速泵入柱内，以300ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm波长监测，20min时， 12—硝基喜树碱出现并上升，收集组分I，直至40min时，主峰逐渐下降至峰高的1/4处。 继续收集组分II，直至12—硝基喜树碱成分完全流出。整个分离过程约60分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收甲醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至6，析出棕黄色 固体。过滤，固体以甲醇100ml洗涤，干燥，得26. 5克精品，HPLC检测，纯度99. 3%， 最大单一杂质0.20%，收率80.0%。洗脱液II同法处理，过滤后得固体约4.9克，待分 离10批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
实施例10
将200克三氟醋酸铵溶解于25L水，加入三氟醋酸酸调节PH值至3.4，再加入1.5克十二 烷磺酸钠，溶解至澄清。取此缓冲液与异丙醇按照体积比50/50混合得到40L洗脱液，超
声io分钟待用。
色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1KG氰基无定形反相硅填料(20—50ixm)，加入5L异丙醇，搅 拌成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 400ml/min流速，泵入洗脱液，15分钟后，柱内异丙醇被替换完全并活化。将柱压调至55bar， 再以300ml/min流速活化20分钟。 样品分离
取5_羟基一9_溴_10—甲氧基喜树碱粗原料(含量95.0%) 10克，溶解在200ml洗 脱液中，过滤，以250ml/min流速泵入柱内，以250ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器 下用267nm波长监测，28rnin时，5—羟基一9一溴一10—甲氧基喜树碱出现并上升，收集组 分I，直至50min时，主峰逐渐下降至峰高的1/4处。继续收集组分II,直至5—羟基一9 一溴一10—甲氧基喜树碱成分完全流出。整个分离过程约65分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收异丙醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至6—7，以l， 2 — 二氯乙垸萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓 縮至干，得黄色固体。最后以丙酮30ml洗涤并过滤，得5 —羟基一9一溴一IO—甲氧基喜树 碱精品9.2克，HPLC检测，纯度99.5%，最大单一杂质O. 15%，收率96.8%。洗脱液II 同法处理，蒸除二氯甲烷后得固体约0.22克，待分离50批后，合并所有组分II为新一批 粗品，进行再次纯化。
实施例11 洗脱液配制
取醋酸铵500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀释至30L，并以冰醋酸调 节溶液PH值为5.0。再将此缓冲液与甲醇按照体积比50/50混合为50L洗脱液，超声10分 钟待用。 色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1.2KG苯基球形反相硅填料(10 — 20^m， 200A)，加入6L甲醇， 搅拌成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以 300ml/min流速，泵入洗脱液，20分钟后，柱内甲醇被替换完全并活化。将柱压调至60bar， 再以200ml/min流速活化30分钟。 样品分离
取10— (3—炔丙氧基)喜树碱(粗原料(含量92. 0%) 20克，溶解在350ral洗脱液中，
过滤，以200ml/min流速泵入柱内，以200ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm 波长监测，16min时，IO— (3—炔丙氧基)喜树碱出现并上升，收集组分I，直至28min 时，主峰逐渐下降至峰高的1/3处。继续收集组分II，直至10— (3—炔丙氧基)喜树碱 成分完全流出。整个分离过程约45分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收甲醇，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至6.5，以二氯甲 烷萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至干， 得黄色固体。最后以丙酮30ml洗涤并过滤，得10— (3—炔丙氧基)喜树碱精品16.4克， HPLC检测，纯度99.5%，最大单一杂质O. 12%，收率89. 1%。洗脱液II同法处理，蒸除 三氯甲烷后得固体约1.6克，待分离12批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次 纯化。
实施例12
将100克邻苯二甲酸二钠溶解于25L水，加入邻苯二甲酸调节PH值至5，再加入1.0克己 垸磺酸钠，溶解至澄清。取此缓冲液与乙腈按照体积比35/65混合得到40L洗脱液，超声 IO分钟待用。 色谱柱装填
在5L的大烧杯内，称取1KG C18无定形反相硅填料(10—20!im)，加入5L乙腈，搅拌 成匀浆，超声后装填入直径为8cm的高压不锈钢色谱柱内，抽取液体。盖上法兰，以400ml/min 流速，泵入洗脱液，15分钟后，柱内乙腈被替换完全并活化。将柱压调至60bar，再以 300ml/min流速活化20分钟。 样品分离
取20—乙酰氧基喜树碱粗原料(含量93.0%) 15克，溶解在200ral洗脱液中，过滤， 以250ml/min流速泵入柱内，以250ml/min流速等度洗脱，在紫外检测器下用254nm波长 监测，28min时，20—乙酰氧基喜树碱出现并上升，收集组分I，直至45min时，主峰逐渐 下降至峰高的l/3处。继续收集组分II，直至20—乙酰氧基喜树碱成分完全流出。整个分 离过程约65分钟。 后处理
减压浓縮洗脱液I蒸除并回收乙腈，以饱和小苏打溶液调节水相PH值至7，以三氯甲烷 萃取3次，合并有机相，水洗1次，无水硫酸钠干燥4小时。滤除干燥剂，浓縮至干，得
黄色固体。最后以正己烷30ml洗涤并过滤，得20—乙酰氧基喜树碱精品12.3克，HPLC检 测，纯度99.5%，最大单一杂质0.13%，收率88. 1%。洗脱液II同法处理，蒸除三氯甲 烷后得固体约0.58克，待分离25批后，合并所有组分II为新一批粗品，进行再次纯化。
权利要求
1. 一种喜树碱及其衍生物的纯化方法，为利用制备色谱柱进行分离纯化，包括样品溶解、上柱、洗脱及组分收集，其特征在于，色谱柱洗脱采用的洗脱液为醇/水体系或乙腈/水体系，水相pH为2-5，在醇/水体系中，醇选自C5以下的醇。
2. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述醇/水体系中的醇 选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或丁醇。
3. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述制备色谱柱为常压、 中压或高压制备色谱柱。
4. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述制备色谱柱的固定 相填料选自大孔树脂、反相硅填料或酸性氧化铝。
5. 如权利要求4所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述反相硅填料选自C18 填料、C8填料、苯基填料或氰基填料。
6. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述醇/水或乙腈/水体 系中，水相为酸性缓冲溶液，其中，配制缓冲溶液的酸选自盐酸、磷酸、硼酸、甲酸、 醋酸、三氟醋酸、邻苯二甲酸或酒石酸中的一种或多种；配制缓冲溶液的盐选自磷酸氢 二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硼砂、碳酸氢钠、碳酸钠、甲酸钠、甲 酸铵、醋酸钠、醋酸铵、三氟醋酸钠、三氟醋酸铵、邻苯二甲酸氢钠、邻苯二甲酸二钠、 邻苯二甲酸氢钾、邻苯二甲酸二钾、酒石酸氢钾、酒石酸氢钠、酒石酸氢钾、酒石酸二 钠或酒石酸二钾中的一种或多种。
7. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述洗脱液中含有C4-C20 的烷基磺酸钠。
8. 如权利要求7所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述C4-C20的烷基磺 酸钠在洗脱液中的重量百分含量为万分之零点二 万分之二十。
9. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述醇/水或乙腈/水体 系中，有机相与水相的体积比在9: 1 1: 9之间，有机相即为醇或乙腈。
10. 如权利要求I所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述组分收集为分段收 集洗脱液。
11. 如权利要求l所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，组分收集后还包括将收 集的中段洗脱液浓縮蒸除大部分醇或乙腈，并加水稀释，水相调节pH至中性后，直接 析出产品晶体。
12. 如权利要求1所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，组分收集后还包括将收 集的中段洗脱液以二卤代烃或三卤代烃萃取，浓縮后得到产品晶体。 13.如权利要求1-12中任一权利要求所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述喜树碱及其衍生物具有下面的五环母体结构其中，Rl选自H, C1-C20的烷基，C1-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛 基，酮基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子或杂环取代基， R2选自H， C1-C20的垸基，CI-C20的取代垸基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，卤素原子或杂环取代基， R3选自H， C1-C20的烷基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，哌啶基哌啶，或其 它杂环取代基，R4选自H, CI-C20的垸基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子或杂环取代基， R5选自H， C1-C20的垸基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子或杂环取代基， R6选自H， Cl-C20的烷基，C1-C20的取代烷基，酰基，R7选自H, C卜C20的垸基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羟基，苄基或取代苄基，氰基，硝基，卤素原子，或杂环取代基， 以及上述物质可能的盐形式。 14.如权利要求13所述喜树碱及其衍生物的纯化方法，其特征在于，所述喜树碱及其衍生 物选自喜树碱、7—乙基喜树碱、5—羟基喜树碱、5—羟基一9一溴一10—甲氧基喜树碱、 IO—羟基喜树碱、IO—甲氧基喜树碱、5， IO—二羟基喜树碱、7—乙基一10—羟基喜树 碱、7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜树碱、9一氨基喜树碱、12 —硝基喜树碱、12 一氨基喜树碱、9一硝基—IO—羟基喜树碱、9-硝基-10-烯丙基喜树碱、9一硝基一10 — 炔丙基喜树碱、9一烯丙基喜树碱、9一炔丙基喜树碱、9一烯丙基一10—羟基喜树碱、9 一炔丙基一10—羟基喜树碱、10— G—烯丙氧基)喜树碱、10— (3—炔丙氧基)喜树 碱、20—乙酰氧基喜树碱。
全文摘要
本发明公开了一种喜树碱及其衍生物的纯化方法，为利用制备色谱柱进行分离纯化，包括样品溶解、上柱、洗脱及组分收集，其中，色谱柱洗脱采用的洗脱液为醇/水体系或乙腈/水体系，水相pH为2-5，在醇/水体系中，醇选自C5以下的醇。本发明的方法能够针对产品和杂质的特性优化色谱条件，一次分离纯度可达99％以上，且经济环保，分离周期短，能够快速稳定进行规模化生产。
文档编号C07D491/22GK101376659SQ200810200658
公开日2009年3月4日 申请日期2008年9月27日 优先权日2008年9月27日
发明者婧 孙, 康立涛, 平 张, 张五军, 倩 李 申请人:上海北卡医药技术有限公司