一种长链非编码rna在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，本发明在研究卵巢癌发生发展机制过程中发现LOC101929219是一种主要表达于卵巢癌细胞的长链非编码RNA，在其他组织、细胞中完全不表达或仅有少量表达，本发明首次发现了LOC101929219的功能及其应用价值。本发明还进一步提供了LOC101929219在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用。
【专利说明】一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，具体涉及一种长链非编码RNA在制备卵巢 癌诊断或治疗药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌（Ovarian Cancer)是目前第六大常见肿瘤，在女性生殖器官常见恶 性肿瘤中卵巢癌位居第三，致死率占各类妇科肿瘤之首（Jemal，A.，et al. ,Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2002. 52(1) :ρ· 23-47·)，其发病十分隐匿，转移前常 无症状，手术不能完全清除病灶，再加上术后化疗作用局限，术后复发率高、预后差，卵巢恶 性肿瘤组织类型繁多，其中上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer, E0C)最常见，约 占80-90%，是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，高达70%。（Luesley，D.，et al·，Failure of second-look laparotomy to influence survival in epithelial ovarian cancer. Lancet. 1988,2(8611) :599-603.)。卵巢癌的病因至今尚不明了，一直是妇科肿瘤学家面临 的最严峻挑战之一。
[0003] 长链非编码RNA (Long noncoding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个碱基的功 能性RNA分子，占人类基因组4-9 %。LncRNA缺乏编码蛋白的能力，但能够在多种层面上调 控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。由于自身分子长度，LncRNA具有一定的调控 特色：既可以通过核酸序列一级结构与其他基因结合，又可以通过复杂的高级空间结构与 蛋白因子相互作用；另外它们整体保守性较差，有利于维持自身功能的长期存在。目前许多 研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性 肿瘤的发生发展密切相关（Lee, J.T·· Epigenetic regulation by long noncoding RNAs. Science. 2012. 338(6113):1435-1439.)。
[0004] L0C101929219 转录的 cDNA 序列如 SEQ ID NO: 11 所示。
[0005] 目前有关L0C101929219的功能尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于寻找到能够有效用于卵巢癌诊断、卵巢癌治疗的一种长链非编 码 RNA。
[0007] 本发明的另一目的在于提供长链非编码RNAL0C101929219的新的医药用途，即在 制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用。
[0008] 本发明人在研究卵巢癌发生发展机制过程中发现L0C101929219是一种主要表达 于卵巢癌细胞的长链非编码RNA，在其他组织、细胞中完全不表达或仅有少量表达，本发明 首次发现了 L0C101929219的功能及其应用价值。
[0009] 本发明的主要技术方案如下：0VCAR-3和SK0V-3均是卵巢癌细胞系，且0VCAR-3 比SK0V-3恶性程度高，本发明采用Taq-Man荧光定量PCR研究发现：L0C101929219在卵巢 癌细胞系中特异性高表达，且在恶性程度高的细胞系中呈高表达状态。另外，卵巢癌组织中 L0C101929219的表达也远远高于卵巢癌癌旁组织。进一步的，本发明应用RNA干扰技术来 研究高表达基因功能，以L0C101929219的特异性siRNA干扰其表达，通过transwell和荷 瘤实验研究该基因在卵巢癌细胞转移中的作用及其在卵巢癌治疗上的应用。
[0010] 本发明提供了一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，所述 的长链非编码RNA是L0C101929219。
[0011] 本发明所述的L0C1019292191在制备卵巢癌诊断药物中的应用，该诊断药物是诊 断卵巢癌的试剂或试剂盒。
[0012] 所述的试剂，为检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂。
[0013] 所述的试剂盒，包含检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂。
[0014] 所述的检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂，选自：对L0C1019292191具 有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
[0015] 所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组 织或细胞、血液或体液。
[0016] 本发明所述的L0C1019292191在制备卵巢癌治疗药物中的应用，该治疗药物是指 抑制（降低）L0C1019292191表达量的试剂。
[0017] 所述的抑制（降低）L0C1019292191表达量的试剂，包括但不限于：siRNA、shRNA。
[0018] 在本发明的一个优选实施例中，本发明提供了 L0C1019292191在制备卵巢癌治疗 药物中的应用，该治疗药物是siRNA，序列如下：
[0019] CUGAGAAACUCUGCUUCUAII UAGAAGCAGA⑶UUCUCAGII
[0020] siRNA 4
[0021] (SEQ ID NO:7) (SEQ ID NO:8)
[0022] GGGAAUCUCAAUACUUGGAII UCCAAGUAUUGAGAUUCCCTT
[0023] siRNA 5
[0024] (SEQ ID NO:9) (SEQ ID NO: 10)
[0025] 上述序列中，3'端加 Π 是为了加强siRNA的稳定性。
[0026] 本发明经实验证明：
[0027] I. L0C101929219对卵巢癌细胞体外浸润能力的影响：将0VCAR-3细胞接种到6 孔板中，24h后，用lipofectamine2000分别转染L0C101929219特异性siRNA和阴性对照 siRNA，24h后分别将两组细胞用胰酶消化下来，1500rpm离心5min，去上清，PBS洗一遍， 用无血清的培养液重悬细胞，计数，使用24-Well Cell Invasion Assay，在上室孔中准确 接种0VCAR-3细胞，IO5细胞/孔，48h后固定、染色、计数发现：穿膜的L0C101929219特异 性siRNA干扰组细胞数量显著少于对照组。上述结果说明：L0C101929219可以显著地促进 0VCAR-3细胞的体外浸润能力。
[0028] 2. L0C101929219对卵巢癌细胞体内转移能力的影响：选择4-6周的雌性裸鼠，腹 腔注射细胞，2X105细胞/只，接种2周后，注射L0C101929219特异性siRNA进行治疗， 治疗7-8周后处死小鼠，提取子宫、输卵管组织基因组，建立定量PCR方法，检测组织中人 与小鼠 β2-微球蛋白分子拷贝数之比，以此计为肿瘤细胞的卵巢癌转移率。统计结果显 示：注射L0C101929219特异性siRNA的实验组小鼠转移率显著低于对照组。由此可知： L0C101929219可以显著地促进0VCAR-3细胞的体内转移能力。
[0029] 3.收集肝癌细胞系Huh7和H印3B，乳腺癌细胞系MUF-7,卵巢癌细胞系0VCAR-3和 SK0V-3以及一定数量的卵巢癌及癌旁组织样本，抽提RNA并反转录为cDNA。设计荧光定 量PCR方法分析L0C101929219的表达水平，研究发现：L0C101929219在卵巢癌细胞系中特 异性高表达，且在恶性程度高的0VCAR-3细胞系中表达水平高于恶性程度低的SK0V-3细胞 系。另外，L0C101929219在卵巢癌组织中的表达水平远远高于卵巢癌癌旁组织。由此可见 L0C101929219可以成为治疗卵巢癌尤其是卵巢细胞癌-较好的药物靶点，提高卵巢癌的靶 向治疗水平。
[0030] 因此，L0C101929219具有促进肿瘤细胞转移能力的作用，在卵巢癌细胞中特异 性高表达，L0C101929219可以成为卵巢癌治疗，尤其是抗转移治疗中的药物靶点；我们所 构建的RNA干扰序列可以在以L0C101929219为靶点的卵巢癌治疗中发挥有效作用；对 L0C101929219基因进行转录调控也可以用于卵巢癌生物治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1 :不同癌细胞系中L0C101929219的含量检测；
[0032] 图2 :卵巢癌和癌旁组织中L0C101929219的含量检测；
[0033] 图3 :疑似EOC患者中手术确诊者和手术排除EOC者样本组织中
[0034] L0C101929219 的含量检测；
[0035] 图4 :L0C101929219表达的RNA干扰分析；
[0036] 图5 :改变L0C101929219表达水平对0VCAR-3细胞穿膜的影响，其中右上图为阴 性对照组细胞穿膜情况，右下图为转染L0C101929219特异性siRNA4的细胞穿膜情况，左边 柱状图为两组细胞穿膜数统计结果。
【具体实施方式】
[0037] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0038] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0039] 实施例1 :
[0040] 本发明收集肝癌细胞系Huh7和H印3B，乳腺癌细胞系MUF-7，卵巢癌细胞系 0VCAR-3和SK0V-3以及一定数量的卵巢癌及癌旁组织样本，抽提RNA并反转录为cDNA，采 用Real-time PCR方法分析L0C101929219的表达水平，具体方法如下：
[0041] 1.采集样本及RNA抽提：
[0042] (1)样品收集
[0043] a、组织样本在上海长海医院病理科采集。剪取适量病人的卵巢癌和癌旁组织，PBS 洗3遍，放入含Iml Trizol的离心管中，用匀浆机将组织匀浆，放置冰上15min。
[0044] b、细胞样本为本实验中心保存。6孔板中培养的细胞用PBS洗3遍，加入Iml Trizol裂解，移入I. 5ml离心管中，放置冰上15min。
[0045] (2)每管加入200 μ 1氯仿（三氯甲烷），剧烈振荡摇晃混匀，静置冰上15min。 12000g 4°C离心20min，离心后样品分为三层，取上层无色水相，水相体积约为所用TRIzol 体积的50-60%。
[0046] (3)加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀5-6次，-20°C放置过夜。12000g 4°C离心 20min，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀。
[0047] (4)小心去上清，用DEPC处理的75 %乙醇（lml/管）重悬RNA沉淀。12000g4°C 离心5min。重复该步骤1次。
[0048] (5)去上清，将留有沉淀的离心管开盖放置于超净台室温自然干燥，直至沉淀变成 半透明状，干燥过程约5-10min。加入适量已温热过的DEPC水（约10-40 μ 1)，冰上静置溶 解lOmin，震荡混匀。
[0049] (6)取少量RNA (I. 5-2. O μ 1)使用Eppendorf紫外分光光度仪测定OD值（0D260 值），RNA纯度为0D260/0D280 = 1. 8-2,以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本 进行下一步反应。
[0050] 2.反转录成cDNA
[0051] 取RNA 500ng为模板，用随机反转录引物进行反转录。使用TaKaRa反转录试剂， 按照下列成分加入体系。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。
[0052]
【权利要求】
1. 一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的 长链非编码RNA是L0C101929219。
2. 根据权利要求1所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，该应用是指L0C1019292191在制备诊断卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，所述的试剂为检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂。
4. 根据权利要求2所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂。
5. 根据权利要求3或4所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物 中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中L0C1019292191表达量的试剂，选自：对 L0C1019292191具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
6. 根据权利要求3或4所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的 应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石 錯包埋组织或细胞、血液或体液。
7. 根据权利要求1所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，该治疗药物是指抑制L0C1019292191表达量的试剂。
8. 根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，所述的抑制L0C1019292191表达量的试剂，为siRNA、shRNA。
9. 根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，该治疗药物是siRNA，其序列如下： 正义链如SEQ ID NO:7所示； 反义链如SEQ ID NO:8所示。
10. 根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应 用，其特征在于，该治疗药物是siRNA，其序列如下： 正义链如SEQ ID NO:9所示； 反义链如SEQ ID NO: 10所示。
【文档编号】A61K48/00GK104388556SQ201410632561
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】刘善荣, 王录美, 刘淑鹏, 程凯, 徐贵霞, 余喜亚, 胡晶晶, 丁秀文 申请人:中国人民解放军第二军医大学