一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺的制作方法

一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，采用Ｌ９正交设计法，以浸膏得率和总黄酮含量为检测指标优选提取工艺；用ＡＢ-８型大孔吸附树脂柱进行分离，乙酸乙酯、正丁醇萃取纯化，本研究按这些方法提取淫羊藿总黄酮，再经大孔吸附树脂柱分离，得到淫羊藿总黄酮的含量相差不大，为提高淫羊藿总黄酮的含量，实验时采用水提，过大孔吸附树脂柱分离后，再用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取的方法，对提取物进行了精制。结果发现，经萃取后所得淫羊藿总黄酮的含量提高到６１％，表明，大孔吸附树脂柱分离法和萃取法相结合可以达到纯化淫羊藿总黄酮的目的。
【专利说明】一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，属于生物医药【技术领域】。

【背景技术】
[0002]淫羊藿为小檗科植物淫羊藿E p imed iumbrev 1- co rnuMax im、箭叶淫羊藿 Ep imed i u m.s a g i t t a t u m (S e b.e tZucc.) M a x i m、柔毛淫羊藿 Epimedium pu-bescens Maxim
或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶，，味辛甘、
性温，具有补肾阳，强筋骨、祛风湿功效，现代药理学研宄表明，淫羊藿在免疫、生殖、核酸代谢、心血管以及抗衰老方面具有多种药效。


【发明内容】

[0003]本发明的目的是:提供一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，能大大提高总黄酮的得率和含量，以克服现有技术的不足。
[0004]本发明的技术方案
一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，采用L 9正交设计法，以浸膏得率和总黄酮含量为检测指标优选提取工艺；用A B - 8型大孔吸附树脂柱进行分离，乙酸乙酯、正丁醇萃取纯化。
[0005]前述的一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺中，最佳提取工艺为淫羊藿叶的粗粉中加入2 7倍量水，浸泡2 h后，煎煮3次，每次1 h ;淫羊藿提取液上AB - 8型大孔吸附树脂柱分离，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取。
[0006]由于采用上述技术方案，与现有技术相比，现有技术中关于淫羊藿总黄酮提取方法的研宄报道众，常见的方法有水煎煮法、乙醇回流法、索氏提取法、超声提取法，本研宄按这些方法提取淫羊藿总黄酮，再经大孔吸附树脂柱分离，得到淫羊藿总黄酮的含量相差不大，虽然以6 0 %乙醇为溶媒时提取的淫羊藿总黄酮含量较高，但含量均低于5 0 %，为提高淫羊藿总黄酮的含量，考虑到水具有廉价环保等特点，实验时采用水提，过大孔吸附树脂柱分离后，再用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取的方法，对提取物进行了精制，结果发现，经萃取后所得淫羊藿总黄酮的含量提高到6 1 %，表明，大孔吸附树脂柱分离法和萃取法相结合可以达到纯化淫羊藿总黄酮的目的。

【专利附图】

【附图说明】
[0007]附图1为提取工艺因素水平表；
附图2为淫羊藿总黄酮提取工艺正交试验与结果示意图；
附图3为提取工艺方差分析表；
附图4为重现性试验示意图；
附图5为不同洗脱剂对黄酮量的影响示意图；附图6为萃取后的结果图；
附图7为萃取后总黄酮含量示意图。

【具体实施方式】
[0008]下面结合附图对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。
[0009]本发明的实施例:
1仪器及试药
U V - 2 4 0 1型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，日本岛津AY - 1 2 0电子分析天平，日本东京Ν 1 0 0 0 D Ν A旋转蒸发仪，HHS-2 1-6电热恒温水浴锅(杭州艾普仪器设备有限公司)。淫羊藿叶购于贵阳市三桥中药材市场，淫羊藿苷对照品为成都曼斯特生物有限科技公司产品，批号MUS T - 1 0 0 7 0 9 0 1, AB - 8型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)，9 5 %乙醇、乙酸乙酯(AR，上海申博化工有限公司)，正丁醇(A R，上海申博化工有限公司)，甲醇(A R，天津市大茂化工试剂厂)，纯化水(实验室自制)。
[0010]2 方法与结果
2.1提取工艺的优选2.1.1因素水平的选择
为确定淫羊藿总黄酮的最佳提取工艺，以加水量、浸泡时间、煎煮时间和煎煮次数为影响因素，按每个因素3水平，选用L 9(3 4)正交表安排试验，结果见附图1，以浸膏得率和总黄酮含量为考察指标，选取最佳工艺。
[0011]2.1.2 标准曲线的绘制
精密称取淫羊藿苷对照品1 0.0mg，置于1 0 0 m 1量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1 0 0.0mg / L的淫羊藿苷对照品溶液。精密吸取对照品溶液 0.5 0 , 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml 分另U 置于 2 5 m 1 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白对照，用紫外分光光度计在2 7 0 n m处测定吸光度，以吸光度A对淫羊藿苷浓度C进行回归，得到回归方程为:A=0.0 3 6 3 C +0.0707，r = 0.9 9 9 8，结果表明在2.00?20.0 0 m g / L范围内，线性关系良好。
[0012]2.1.3 样品的制备和测定结果
按L 9 ( 3 4)正交表安排试验，称取淫羊藿粗粉5 0 g，按设定方案进行提取，滤过，提取液浓缩至5 Q m 1，加9 5 %乙醇至醇沉浓度为5 Q %，4 °C静置1 2 h，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，用适量乙酸乙酯分次萃取，合并乙酸乙酯层，减压回收，真空干燥，计算浸膏重。按“2.1.2”项下方法测定总黄酮含量，并计算总黄酮得率，结果见附图2和附图3。
[0013]由附图2中极差值R大小可知，RD>RA>RB> R C，各影响因素顺序为D>A>B >C，因此D是影响淫羊藿总黄酮含量的重要因素，因素A、B次之，因素C影响最小；从附图3方差分析可见，因素D对淫羊藿总黄酮的提取具有显著意义(P< 0.0 5)，结合极差值R大小综合分析，最佳提取工艺为A 3 B 3 C 2 D 30
[0014]2.1.4 工艺重现性考察称取3份药材粗粉，每份5 Q g，按最佳提取工艺加入2 7倍量的水，浸泡2 h，回流3次，每次1 h，合并提取液，浓缩、醇沉、加乙酸乙酯萃取，减压回收，真空干燥，测定浸膏得率和总黄酮得率，本工艺重现性良好，见附图4。
[0015]2.2 分离工艺的研宄
2.2.1大孔吸附树脂的优选
AB - 8型大孔吸附树脂是分离纯化淫羊藿中淫羊藿总黄酮的最优树脂，因此本工艺采用AB - 8型大孔吸附树脂对淫羊藿总黄酮提取物进行分离。
[0016]2.2.2 大孔吸附树脂的预处理
采用乙醇湿法装柱(4.8 c m X 25 c m)，用乙醇洗脱，检测乙醇流出液，当乙醇流出液与水(1: 3)混合不呈现白色乳浊现象后，再用大量纯化水反复洗脱，直至无醇味、树脂高度不再下降即可，平行装4根同规格的柱子(4.8 cm X 2 5 cm)。
[0017]2.2.3 洗脱溶剂的选择
称取2 0 0 g淫羊藿粗粉，按最佳工艺提取。提取液浓缩至4 0 0 ml，平均分成4份，分别上样，吸附1 h后，所有柱子用足量纯化水洗脱，当洗脱液接近无色时，再分别用
20 %, 6 0 %, 7 0 %, 9 0 %乙醇洗脱柱子，流速为2 m 1 / m i η，将乙醇洗脱液分别蒸干、称重，测得总黄酮含量，计算总黄酮解析率，结果见附图52.2.4 洗脱溶剂用量的确定
用3个柱体积的2 0 %乙醇可以将大部分杂质除去，再用5个柱体积的6 0 %乙醇洗脱，可将有效成分几乎完全洗脱下来。由表5可知6 0 %乙醇洗脱物中总黄酮含量最高，解析率最佳，所以选用6 0 %乙醇为洗脱剂，同时选用纯化水和2 0 %乙醇为除水溶性杂质的溶剂，为进一步提高总黄酮含量，对6 0 %乙醇的洗脱液再进行萃取处理。
[0018]2.3 萃取纯化工艺研宄2.3.1萃取溶剂的选择
按照最佳提取工艺，提取2批淫羊藿粗粉，每批5 0 g，提取液浓缩至5 Q m 1，加9 5 %乙醇至醇沉浓度为5 0 %, 4 °C静置1 2 h，过滤，取上清液，减压回收乙醇至无醇味，分别上大孔树脂柱分离，分开收集6 0 %乙醇的洗脱液，减压回收乙醇，使每份浓缩至约5 0ml，第一份用乙酸乙酯萃取，第二份用正丁醇萃取，减压回收溶剂，真空干燥，测定浸膏中总黄酮含量，结果见附图6，与附图5比较可知，经萃取后，淫羊藿总黄酮的含量高于未萃取前，但是这两种溶剂均不能彻底将提取液中的淫羊藿总黄酮完全萃取，为保证浸膏得率和总黄酮含量，故对用两种溶剂萃取进行研宄。
[0019]2.3.2 两种溶剂萃取的考察称取5份淫羊藿粗粉，每份5 Q g。按照最优提取，分离工艺进行，得到约5 0 m 1 6 0 %乙醇的洗脱液(5份)后，向每份溶液依次加入9体积倍的乙酸乙酯萃取，然后再加入1 0体积倍的正丁醇萃取，分别减压回收溶剂至稠膏后合并，真空干燥，得浸膏，测定含量，结果见附图7，结果表明，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得到的浸膏得率比只用乙酸乙酯萃取高出约1.5倍，得到的总黄酮含量比只用正丁醇萃取高出约6.2 %。由此可见在保证总黄酮得率和含量的情况下，依次乙酸乙酯、正丁醇萃取是比较理想的。
【权利要求】
1.一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，其特征在于:采用L 9正交设计法，以浸膏得率和总黄酮含量为检测指标优选提取工艺；用A B - 8型大孔吸附树脂柱进行分离，乙酸乙酯、正丁醇萃取纯化。
2.根据权利要求1所述的一种淫羊藿总黄酮的提取和分离纯化工艺，其特征在于:最佳提取工艺为淫羊藿叶的粗粉中加入2 7倍量水，浸泡2 h后，煎煮3次，每次I h ;淫羊藿提取液上A B - 8型大孔吸附树脂柱分离，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取。
【文档编号】A61K36/296GK104435047SQ201410739922
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】敖云霞 申请人:敖云霞