技术领域本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及双歧杆菌和红蝽杆菌两种肠道益生菌的组合物在预防和降低胎儿先天性心脏病等疾病风险的应用，也涉及包含双歧杆菌和红蝽杆菌的组合物及其应用，也涉及双歧杆菌和红蝽杆菌的检测方法。
背景技术：
先天性心脏病(简称先心病)指出生时即存在的心脏、血管结构和功能上的异常，由各种原因引起的心脏、血管组织胚胎发育异常,或是胚胎早期停止发育引起。关于先心病的机制目前取得共识的主要有遗传因素、环境因素及母体方面的因素，但仍没有突破性进展。现有的通过彩色多普勒超声诊断等诊断胎儿先心病的手段有限，且只能在胎儿24-32周阶段进行。如能在孕妇怀孕初期，通过饮食调养或者检测手段提前预防，将可能使先心病胎儿的风险大大降低。因此本领域迫切需要开发更多新的、无副作用、无伤害的胎儿先心病风险的食品、药物组合以及有效检测手段和方法。肠道菌群被誉为人体另一器官，并已证实与人体过敏反应、自身免疫病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、自闭症、神经系统等都有明确的关系。近期的突破性研究表明正常孕妇(NW组)与怀有先心病胎儿的孕妇(PW组)肠道菌群中的双歧杆菌和红蝽杆菌的丰度在两种组别中有着显著差异。该两种细菌均为肠道益生菌，参与人体的营养代谢、免疫调节、自身保护等各个环节。尤其双歧杆菌是肠道菌群稳定与否的风向标。虽然不预期受理论束缚，益生菌的显著减少，可能意味着无关菌群或者恶性菌群的增加，势必会影响到人体许多代谢进程。先心病胎儿的发生可能与孕妇肠道益生菌的减少密切相关，其中双歧杆菌和红蝽杆菌在先心病的预防方面可能有重要作用。中国发明CN200980116112.0中公开了双歧杆菌等益生菌在增强怀孕个体及其后代出生后免疫性之新用途；中国发明CN98812842.X公开了红蝽杆菌与其他厌氧微生物在用于动物饲料添加剂及降解单端孢菌毒素之新用途。但是上述专利仅分别提及了双歧杆菌在增强怀孕个体及其后代出生后免疫性、红蝽杆菌在降解单端孢菌毒素之新用途。因此，提供一种双歧杆菌和红蝽杆菌益生菌组合物在预防和降低胎儿先心病风险之新用途具有现实意义。16SrDNA是细菌染色体上编码rRNA的DNA序列，全长约1540bp。在结构上分为可变区和保守区,其中可变区在不同微生物间核酸序列不同并与进化距离相一致,是细菌系统分类最常用的分子钟，可用于对细菌进行属种分类鉴定。新一代测序技术包括IlluminaGA、Roche454或IonProton等高通量测序技术，具有测序通量大、序列读取长、成本低的优点。Illumina测序技术DNA序列读长可达到200bp,并可以进行Pair-end(PE)双向测序，其准确率可达到98.5％以上。利用新一代测序技术无需通过细菌培养，可直接通过细菌DNA提取进行16SrDNA的PCR扩增、测序，用于细菌种属的分类和鉴定。Illumina测序技术曾应用于人类肠道元基因组的深度测序，从人肠道菌群共鉴定出1000-1150种细菌，具有检测速度快、检测率高、检测结果可靠准确等特点。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种益生菌组合物，及其用于预防和降低胎儿先心病等疾病风险的用途。该益生菌组合由双歧杆菌和红蝽杆菌组成，可参与人体的营养代谢、免疫调节、自身保护等各个环节，从而降低胎儿先心病的风险。本发明还在于提供一种预防胎儿先心病风险的检测方法，通过检测双歧杆菌和红蝽杆菌在孕妇肠道和粪便中的丰度，用于预测胎儿先心病的风险。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：在本发明的第一方面，提供了一种用于预防和/或降低胎儿先天性心脏病风险的益生菌组合物，其由双歧杆菌和红蝽杆菌组成。优选的，所述双歧杆菌含量为1.0×107～1.0×1012CFU/g，所述红蝽杆菌含量为1.0×107～1.0×1012CFU/g。优选的，本发明提供的益生菌组合，所述的双歧杆菌和红蝽杆菌活菌数比为1：1。所述双歧杆菌为双歧杆菌科物种，优选的选自乳双歧杆菌CNCMI-3446、长双歧杆菌ATCCBAA-999、长双歧杆菌CNCMI-2170、长双歧杆菌CNCMI-2618、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Bb-03、短双歧杆菌M-16V、短双歧杆菌R0070、和它们的混合物，所述红蝽杆菌为红蝽杆菌科物种，优选的选自红蝽杆菌DSM11798。在本发明的第二方面，提供一种食物组合物，其特征在于，所述食物组合物含有有效量的双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)和红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)两种肠道益生菌组合和/或其代谢产物，以及其他的食品上可接受的载体。在本发明的一些实施例中，所述的食物组合物的剂型选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、悬浮液制品。在本发明的第三方面，提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有有效量的双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)和红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)两种肠道益生菌组合和/或其代谢产物，以及药学上可接受的载体。在本发明的一些实施例中，所述药物组合物剂型为：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、乳剂。在本发明的第四方面，提供一种预测胎儿先心病的细菌检测方法。包括：1)提取一个或多个样本中的细菌DNA；2)利用细菌16srDNA的通用引物扩增所述细菌DNA，获得PCR产物，其中所述引物优选是扩增细菌16srDNA高可变区V4的引物，更优选是：16sV4-520F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGCTAYTGGGYDTAAAGNG16sV4-803R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATCC3)将所述PCR产物利用新一代测序技术进行测序,读取其序列，所述新一代测序技术优选IlluminaGA、Roche454或IonProton；更优选IlluminaMiseq，其中测序方式可以采用SingleEnd或Pair-End的方法；4)通过与已有的所有细菌的16SrDNA参考序列比对，确定每个样本中存在的细菌种类；5)在最佳分类水平统计各样品中同一细菌的序列数以及百分比，通过比较同一细菌在不同样品中的丰度差异，用于预测胎儿先心病的风险。在本发明的第四方面，其中所述细菌为双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)和红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)两种肠道益生菌。在本发明的第四方面，其中所述细菌或肠道益生菌存在于孕妇结肠、直肠、粪便中。在本发明的第四方面，其中所述双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)在正常孕妇(NW组)中的丰度平均值为6.91％，但在怀有先心病胎儿孕妇(PW组)中的丰度平均值为1.48％。其中所述红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)在正常孕妇(NW组)中的丰富平均值为4.76％，但在怀有先心病胎儿孕妇(PW组)中的丰度平均值为0.33％。传统的彩色多普勒超声诊断等诊断胎儿先心病的手段有限，且只能在胎儿24-32周阶段进行。如能在孕妇怀孕初期，通过饮食调养或者检测手段提前预防，将可能使先心病胎儿的风险大大降低。本发明提供了一种预测胎儿先心病的细菌检测方法，无需通过细菌培养，具有无副作用、无伤害等特点，可直观反映孕妇肠道菌群的丰度特征，在怀孕早期可对胎儿先心病进行预测。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式本发明公开了一种益生菌组合物，以及其在制备用于预防和降低胎儿先心病风险的组合物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明的一些实施例中，优选的，所述双歧杆菌含量为1.0×107～1.0×1012CFU/g，所述红蝽杆菌含量为1.0×107～1.0×1012CFU/g。在本发明的一些实施例中，优选的，本发明提供的益生菌组合，所述的双歧杆菌和红蝽杆菌活菌数比为1：1。在本发明的一些实施例中，所述双歧杆菌为双歧杆菌科物种，优选的选自乳双歧杆菌CNCMI-3446、长双歧杆菌ATCCBAA-999、长双歧杆菌CNCMI-2170、长双歧杆菌CNCMI-2618、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Bb-03、短双歧杆菌M-16V、短双歧杆菌R0070、和它们的混合物，所述红蝽杆菌为红蝽杆菌科物种，优选的选自红蝽杆菌DSM11798。本发明所述的益生菌可直接从经销商处购买，但是也可直接从粪便中分离，经识别、鉴定和生产。更优选的，乳双歧杆菌CNCMI-3446可购于丹麦ChristianHansen公司、长双歧杆菌ATCCBAA-999可购于日本MorinagaMilk工业有限公司、长双歧杆菌CNCMI-2170和长双歧杆菌CNCMI-2618可购于澳大利亚Probiomics公司、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)Bb-03可购于丹麦Danisco公司、短双歧杆菌M-16V可购于日本Morinaga公司、短双歧杆菌R0070可购于加拿大InstitutRosell(Lallemand)公司，红蝽杆菌DSM11798可购于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)。本发明提供了一种食物组合物，所述组合物包括有效量的双歧杆菌和红蝽杆菌两种肠道益生菌组合和/或其代谢产物，以及其他的食品上可接受的载体。在本发明的一些实施例中，食物组合物剂型可选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、悬浮液制品。在本发明的一些实施例中，食物组合物可包括普通食品、孕妇配方食品、特殊配方食品。在本发明的一些实施例中，本发明提供的食物组合物中还可以包括低聚果糖和/或低聚半乳糖等益生元、复合维生素、复合常微量元素、脱脂奶粉、麦芽糊精、甜味剂或水果粉中的一种或两者以上的混合物。在本发明的一些实施例中，益生菌组合可按照任何适宜方法培养，并通过例如冻干或喷雾干燥制备以加入到普通食品、孕妇配方食品、特殊配方食品中。本发明还提供了一种药物组合物。所述组合物包括有效量的双歧杆菌和红蝽杆菌两种肠道益生菌组合和/或其代谢产物，以及其他的药物上可接受的载体。在本发明的一些实施例中，药品组合物剂型可选自：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、乳剂。所述双歧杆菌和红蝽杆菌组合和/或其代谢产物可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合双歧杆菌和红蝽杆菌组合和/或其代谢产物特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。此外，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药物组合物可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药物组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。另外，本发明的微生物可以常规方法制备的胶囊形式使用。例如，标准赋形剂和本发明的冷干微生物混合制成小球药丸，然后将药丸装填入明胶胶囊中。本发明的药物组合物可制成肠衣片供口服使用。本申请中的术语“肠衣”，包括所有常规药物允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。将本发明组合物施用给所述个体，每天给药1次或多次。给药剂量单位表示其形式上能分开且适用于人类或其他所有哺乳动物个体的剂量。每一单位含有药物允许的载体和有效治疗量的本发明微生物。给药量随病人的体重、所包括的补充活性组份和所使用的微生物而变化。此外如可能，可分开给药，并且如需要可连续给药。因此，所述给药量不会对本发明造成限制。此外，本发明中的“组合物”不仅意味着药品而且表示可作为功能性食品和健康补充食品。本发明还提供一种预测胎儿先心病的细菌检测方法。包括：1)提取一个或多个样本中的细菌DNA；2)利用细菌16srDNA的通用引物扩增所述细菌DNA，获得PCR产物，其中所述引物优选是扩增细菌16srDNA高可变区V4的引物，更优选是：16sV4-520F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGCTAYTGGGYDTAAAGNG16sV4-803R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATCC3)将所述PCR产物利用新一代测序技术进行测序，读取其序列，所述新一代测序技术优选IlluminaGA、Roche454或IonProton；更优选IlluminaMiseq，其中测序方式可以采用SingleEnd或Pair-End的方法；4)通过与已有的所有细菌的16SrDNA参考序列比对，确定每个样本中存在的细菌种类；5)在最佳分类水平统计各样品中同一细菌的序列数以及百分比，通过比较同一细菌在不同样品中的丰度差异，用于预测胎儿先心病的风险。在上述方法的步骤1)中，所述样品可来自孕妇结肠、直肠、粪便中。提取样本DNA的方法是本领域技术人员已知的，并且容易获得的。可以使用许多市售的试剂盒，例如Tiangen细菌基因组试剂盒等。任选地，可用Nanodrop检测DNA量，A260nm/A280nm比值在1.8～2.0。在上述方法的步骤2)中，本领域技术人员可以按照常规的PCR扩增方法进行PCR扩增。对于具体的DNA扩增，本领域技术人员可以根据扩增目的核酸、引物以及其他条件选择PCR扩增条件。在上述方法的步骤2)中，PCR产物纯化方式优选胶回收纯化，但是也可选磁珠纯化方式。在上述方法的步骤3)中，所述新一代测序技术是本领域技术人员已知的，优选IlluminaGA、Roche454或IonProton；更优选IlluminaMiseq，其中测序方式可以采用SingleEnd或Pair-End的方法，但不仅限于这两种方式。在上述方法的步骤4)中，通过与现有细菌的16SrDNA序列进行比对，确定每个样本中存在的细菌种类。序列的比对的方法是本领域技术人员已知的，也可以使用软件完成，例如BLASTN。所有注释结果仅输出e值小于1e-5的比对结果，并根据众数原则挑选最佳分类结果作为物种注释信息。没有比对上数据库的序列则用NA进行注释。在上述方法的步骤5)中，通过统计各个物种分类水平上可注释的序列数量，选择最多可注释序列数量的等级为最佳物种分类水平。随着注释等级的降低(如从属到种)，能够注释到下一等级的序列条数总是呈下降趋势。在最佳分类水平上，统计各样品中同一细菌的序列数量以及百分比。在上述方法的步骤5)中，根据以下公式计算细菌序列数量百分比：p=XiΣnXi,n=1,2......n]]>Xi代表某样品中细菌i在最佳分类水平上可注释的序列数量，其中所述双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)在正常孕妇(NW组)中的丰度平均值为6.91％，但在怀有先心病胎儿孕妇(PW组)中的丰度平均值为1.48％。其中所述红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)在正常孕妇(NW组)中的丰富平均值为4.76％，但在怀有先心病胎儿孕妇(PW组)中的丰度平均值为0.33％。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1益生菌组合的制备双歧杆菌CNCMI-34463g红蝽杆菌DSM117983g混合后，即得益生菌组合，双歧杆菌和红蝽杆菌的含量介于1.0×107～1.0×1012CFU/g之间。实施例2降低胎儿先心病风险的孕妇奶粉实施例1制得的益生菌组合1.0×107CFU/g实施例3降低胎儿先心病风险的药物实施例1制得的益生菌组合1.0×1011CFU/g混合后，加入辅料适量，制粒、压片、包衣、分装，即得片剂。实施例4预测胎儿先心病风险的细菌检测方法收集17例怀有先心病胎儿孕妇的粪便标本命名为PW组，收集15例怀有正常胎儿孕妇的粪便标本命名为NW组。两组孕妇孕前体重、身高、和年龄经两独立样本t检验，均没有明显差别(p>0.05)。入选孕妇均来自中国南方，以广东居多，饮食习惯较为类似。且近三个月之内未使用过抗生素，无不良嗜好，不抽烟、不喝酒，没有药物滥用史，家族没有先心病遗传病史，没有高血压、糖尿病、乙肝等常见病。采集和运送样本过程严格按照无菌操作规程进行。按试剂盒说明书使用细菌基因组提取试剂盒(Tiangen公司)制备细菌DNA。所提取DNA经过Nanodrop检测，所有样品A260nm/A280nm比值均在1.8～2.0。对合格的DNA样品采用细菌16srDNA的V4区通用引物进行PCR扩增，扩增片段长度为283bp左右。引物序列如下：16sV4-520F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACGATGCTAYTGGGYDTAAAGNG16sV4-803R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACCRGGGTATCTAATCC采用Illumina系统的MiSeq平台对所有样品的PCR产物进行PE250测序。去除接头污染和低质量数据后，通过重叠关系对测序结果进行成对拼接和序列组装，得到用于下一步分析的原始序列。表1为用于分析的原始序列的数据总量表1各样本原始序列数据总量*Number：指对所有重叠序列去引物后得到的序列总数；**Dataproduction：为序列的总长。采用BLASTN将所有序列与现有细菌的16SrDNA序列进行比对，确定每个样本中存在的细菌种类。所有注释结果仅输出e值小于1e-5的比对结果，并根据众数原则挑选最佳分类结果作为物种注释信息。没有比对上数据库的序列则用NA进行注释。通过统计各个物种分类水平上可注释的序列数量，选择最多可注释序列数量的等级为最佳物种分类水平。随着注释等级的降低(如从属到种)，能够注释到下一等级的序列条数总是呈下降趋势。在最佳分类水平上，统计各样品中同一细菌的序列数以及百分比。32个样品均有多于59％的Tag序列能够注释到“科”的水平，而能够注释到“属”的水平的序列低于19％，这种情况下我们选择“科”作为32个样品的最佳分类水平。在该水平上物种的等级与注释到的序列数量这两个因素达到了平衡。在“科”分类水平上，统计双歧杆菌和红蝽杆菌益生菌序列数量百分比，并比较两组间细菌的分布差异。在最佳分类水平上，两组所含菌种大致相同。通过Wilcoxon秩和检验得出双歧杆菌(Bifidobacteriaceae)在NW组孕妇的丰度平均值为6.91％，在PW孕妇的平均值为1.48％，多远方差分析F＝10.78(P＝0.002)；红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)在NW组孕妇的丰度平均值为4.76％，在PW组孕妇的丰度平均值为0.33％，多远方差分析F＝13.48(P<0.001)。因此，NW组孕妇两科细菌的含量要显著高于PW组孕妇。由此可以推论双歧杆菌和红蝽杆菌两种益生菌的检测可用于预测胎儿先心病的风险。