一种肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂及其制备方法与流程

本发明涉及材料技术领域，一种肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂及其制备方法。

背景技术：

光声成像是近年来发展起来的一种新型无损生物医学成像方法。光声成像结合了纯光学成像高对比度特性和纯超声成像高穿透深度特性的优点，从原理上避开了光散射的影响，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”(～1mm)，可实现50mm的深层活体内分子成像。由于肿瘤组织和正常组织对光吸收的差异(在近红外激光的照射下，癌变组织和周围正常组织的光吸收差异至少5倍以上)和不同生理状态的生物组织对光的吸收不同，利用光声成像就可以反映了组织的结构特征，同时还可能反映组织的代谢状态、病变特征、甚至神经活动。因此，光声成像目前生物无损检测技术的研究热点。

碳纳米管(cnts)独特的分子结构决定了它具有优异的力学、热学、光学以及电磁性能，近年来，碳纳米管在生物医学方向的潜在应用逐渐成为新的热点。cnts在近红外光区能有效吸收光，然后产生热，是光声成像良好的造影剂，可以在复杂的生物体环境中被检测，但是要求碳管本身结构完整，同时需要呈单分散，而碳纳米管之间π-π相互作用，易于团聚，难以分散，并且缺乏功能基团，不利于功能化，这就在一定程度上限制了其应用，而且纯的碳纳米管在生物体有一定的毒性。

clic1蛋白在正常组织/细胞，原位胆囊癌组织/细胞及胆囊癌转移组织/细胞中的表达水平依次递增，且与临床预后密切相关，clic1在高转移潜能的胆囊癌细胞及胆囊癌转移灶中高表达，其在在多种肿瘤细胞中也表现出表达异常，并且其可能在肿瘤细胞的发生、演进、异质化、增殖、细胞周期、侵袭转移及耐药性等恶性生物学行为方面扮演重要角色。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是为了克服现有的碳纳米管材料易于团聚、分散度不高，缺乏功能基团，不利于功能化以及对生物体具有一定毒性的缺点，提供了一种肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂及其制备方法。

本发明技术方案之一：一种肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)伴随超声、搅拌，将羧基化多壁碳纳米管(mwcnts)分散体系逐滴加入多胺基阳离子聚合物溶液中，滴加完成后超声10-30min，搅拌30-60min，之后在60℃-90℃保温20-36小时，冷却到15℃-30℃，离心，洗涤并分散沉淀，制得多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系；

(2)向2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中加入n-羟基琥珀酸亚胺溶液，搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液反应，然后加入肿瘤靶向抗体反应，反应产物加入到步骤(1)所得的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系中继续反应，洗涤后重新分散，制得含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇(peg-dspe)溶液逐滴滴加到步骤(2)所得的含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管的分散体系中，伴随超声搅拌反应，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

本发明中，步骤(1)为：伴随超声、搅拌，将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入多胺基阳离子聚合物溶液中，滴加完成后超声10-30min，搅拌30-60min，之后在60℃-90℃保温20-36小时，冷却到15℃-30℃，离心，洗涤并分散沉淀，制得多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系。

步骤(1)中，所述羧基化多壁碳纳米管的羧基含量较佳地为0.5-3％，更佳地为1.23％，所述百分比为质量百分比。所述羧基化多壁碳纳米管的长度较佳地为0.5-2μm，直径较佳地为20-30nm，所述羧基化多壁碳纳米管分散体系的浓度较佳地为0.3-1.3mg/ml，更佳地为0.6mg/ml。所述多胺基阳 离子聚合物为本领域常规的多胺基阳离子聚合物，较佳地为支化聚乙烯亚胺(branched-pei)、聚丙烯胺、聚丙烯酰胺(pam)、四乙烯五胺(tepa)或三乙烯四胺(teta)，更佳地为支化聚乙烯亚胺。所述多胺基阳离子聚合物分子量可以为本领域多胺基阳离子聚合物的常规的分子量，较佳地为mn10000-mn1800。所述多胺基阳离子聚合物的制备方法为本领域常规制备方，或市售可得。所述多胺基阳离子聚合物溶液的浓度较佳地为1-22mg/ml，更佳地为1-5mg/ml，最佳地为1mg/ml。所述羧基化多壁碳纳米管与所述多胺基阳离子聚合物的质量比较佳地为1∶1-1∶50，更佳地为1∶3-1∶20，进一步更佳地为1∶5-1∶10，最佳地为1∶10。

步骤(1)中，所述超声的方法为本领域常规的超声分散方法，所述滴加完成后超声的强度为常规的超声强度，较佳地为200w。所述超声的时间为10-30min，较佳地为30min。所述搅拌的时间为30-60min，较佳地为60min。所述搅拌的速度可以为本领域常规的速度，较佳地为150rpm。所述保温的温度为60℃-90℃，较佳地为65℃-90℃，更佳地为65℃-85℃，进一步更佳地为65℃-75℃，最佳地为65℃。所述保温的时间为20-36小时，较佳地为36小时。所述离心的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为10000r/min。所述离心的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15min。所述洗涤较佳地用去离子水洗涤，更佳地为用去离子水抽滤洗涤。所述分散可以用本领域常规的溶剂进行分散，如用pbs缓冲液或去离子水分散，较佳地用去离子水分散。

本发明中，步骤(2)为：向2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中加入n-羟基琥珀酸亚胺溶液，搅拌，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液反应，然后加入肿瘤靶向抗体进行反应，反应产物加入到步骤(1)所得的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系中继续反应，洗涤后重新分散，制得含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系。

步骤(2)中，所述2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为1mg/ml；所述n-羟基琥珀酸亚胺溶液的浓度可以为 本领域常规的浓度，较佳地为0.5-2mg/ml，更佳地为2mg/ml；所述2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中加入n-羟基琥珀酸亚胺溶液的ph值可以为本领域常规的ph值，较佳地为4.5；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度可以为本领域常规的浓度，较佳地为0.5-2mg/ml，更佳地为1mg/ml；所述肿瘤靶向抗体可以为本领域常规的能够靶向肿瘤的抗体，较佳地为clic1抗体。所述clic1抗体的浓度可以为常规的浓度，较佳地为2.5-10mg/ml，更佳地为5mg/ml。所述多胺基阳离子聚合物-碳纳米管与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶1-10∶1，更佳地为2∶1-8∶1，进一步更佳地为3∶1-6∶1，最佳地为4∶1；所述多胺基阳离子聚合物-碳纳米管与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为1∶1-12∶1，进一步较佳地为2∶1-10∶1，更佳地为3∶1-7∶1，进一步更佳地为4∶1-5∶1，最佳地为4∶1。多胺基阳离子聚合物-碳纳米管与所述肿瘤靶向抗体的质量比可以为本领域常规的比例，较佳地为5∶1-1000∶1，进一步较佳地为10∶1-500∶1，更佳地为20∶1-300∶1，进一步更佳地为50∶1-100∶1，最佳地为50∶1。

步骤(2)中，向2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中加入n-羟基琥珀酸亚胺溶液后的所述搅拌的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为15min；所述加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙酸)碳二亚胺盐酸盐溶液反应的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为5min；所述加入肿瘤靶向抗体进行反应的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为30min；所述加入到步骤(1)所得的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系中继续反应的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为24h。所述洗涤可以为本领域常规的洗涤，较佳地为离心洗涤。所述离心洗涤的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为10000r/min。所述重新分散可以用本领域常规的溶剂进行重新分散，较佳地用去离子水进行重新分散。

本发明中，步骤(3)为：将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴滴加到步骤(2) 所得的含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系中，伴随超声搅拌反应，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

步骤(3)中，所述磷脂化聚乙二醇中的聚乙二醇的分子量可以为本领域常规的分子量，较佳地为0.5-20kda。所述磷脂化聚乙二醇溶液的浓度较佳地为0.05-20mg/ml，更佳地为0.05-0.1mg/ml，最佳地为0.1mg/ml。所述含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系与磷脂化聚乙二醇的质量比较佳地为1∶10-3∶1，更佳地为1∶5-2∶1，进一步更佳地为1∶3-1∶1，最佳地为1∶2。其中所述超声的方法为本领域常规的超声分散方法，所述超声的强度为常规的超声强度，较佳地为200w。所述搅拌的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为45-50h，更佳地为50h。

步骤(3)较佳地还可以包括离心和洗涤，所述离心和洗涤在所述伴随超声搅拌反应后进行。所述离心的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为10000r/min。所述洗涤可以为本领域常规的洗涤方式，只要吸取多余的磷脂化聚乙二醇即可，较佳地为抽滤洗涤。

本发明较佳地还可以包括步骤(4)，所述步骤(4)为将步骤(3)所得的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的分散体系离心洗涤，将所得沉淀干燥。步骤(4)中，所述离心洗涤的转速可以为本领域常规的转速，较佳地为10000r/min。所述干燥可以为本领域常规的干燥方法，较佳地为真空干燥。所述干燥的时间可以为本领域常规的时长，较佳地为24h。

本发明采取的技术方案之二为：一种肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂，其是通过如前所述的制备方法所制得的。

本发明中，所述肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂较佳地是由羧基化多壁碳纳米管、多胺基阳离子聚合物、磷脂化聚乙二醇和肿瘤靶向抗体通过物理吸附结合化学共价结合而成。所述多胺基阳离子聚合物可以为本领域常规的多胺基阳离子聚合物，较佳地为支化聚乙烯亚胺、聚丙烯胺、聚丙烯酰胺、四乙烯五胺或三乙烯四胺，更佳地为支化聚乙烯亚胺。所述羧基化多壁碳纳米管的长度较佳地为0.5-2μm，直径较佳地为20-30nm，羧基含量较佳地为 0.5％-3％，更佳地为0.5％，所述百分比为质量百分比。其中所述磷脂化聚乙二醇中的聚乙二醇的分子量较佳地为0.5-20kda。所述含有肿瘤靶向抗体的多胺基阳离子聚合物-碳纳米管分散体系与所述磷脂化聚乙二醇的质量比较佳地为1∶10-3∶1，更佳地为1∶5-2∶1，进一步更佳地为1∶3-1∶1，最佳地为1∶2。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明公开的制备方法是以碳纳米管、聚乙烯亚胺等多胺基阳离子聚合物、磷脂化聚乙二醇和肿瘤靶向抗体作为原料，采用三步法合成纳米复合材料，该制备方法不仅操作简便，而且具有绿色环保等优点。本发明所述肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂在水中的分散性好，稳定性强，具有良好的生物相容性，易于耦合生物抗体，能够靶向识别肿瘤组织，并能够产生较强的光声信号。

附图说明

图1为本发明肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂制备示意图。

图2为本发明实施例2的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的透射电镜图。

图3为本发明实施例1的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂在pbs缓冲液(ph＝7.4)中稳定性检测结果。

图4为本发明实施例4的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的对肿瘤识别光响应图。

图5为本发明所述相同制备方法但没有包含clic1抗体的碳纳米管光声造影剂的对肿瘤识别光响应图，其中a是未注射造影剂荷瘤裸鼠光声成像，b是注射造影剂后荷瘤裸鼠光声成像。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为常规，若无特别说明为15～35℃。

clic1抗体、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺和支化聚丙烯酰胺购买自sigma公司；羧基化多壁碳纳米管购买自成都有机化学有限公司；磷脂化聚乙二醇购买自加拿大polymersource公司。

5-6周龄裸鼠购自中科院上海实验动物中心；胆囊癌noz细胞株、人肺成纤维细胞hfl1细胞株、人肝细胞qsg-7701细胞株、大鼠心肌h9c2细胞株购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；dmem、rpml1640培养基购买自gibco公司。

光声检测专用opo脉冲激光采用光声检测专用opo脉冲激光器opotekvibrant购自美国opotek公司。

实施例1肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

支化聚乙烯亚胺(pei)溶液(mn＝10000)：将0.5g支化聚乙烯亚胺(pei)溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0322g羧基化多壁碳纳米管分散在100ml去离子水中，该羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为0.5％，直径为20nm，超声20min，搅拌15min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为2μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂化聚乙二醇粉末溶于100ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为0.5kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到支化聚乙烯亚胺溶液溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与支化聚乙烯亚胺的质量比为1∶10。滴加完成后，200w超声10min，搅拌30min使之充分混合，将 得到的混合体系在60℃，下油浴20小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得支化聚乙烯亚胺-碳纳米管(pei-cnts)分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管分散体系中，其中支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与nhs的质量比为4∶1，支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与edc的质量比为5∶1，支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为1000∶1，室温反应24h，10000r/min离心洗涤，以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌反应45小时，其中包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶1，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min转速下离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。具体流程图见图1。

实施例2肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

支化聚乙烯亚胺(mn＝10000)溶液：将2.1508g支化聚乙烯亚胺(pei)溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0644g羧基化多壁碳纳米管分散在50ml去离子水中，所述羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为3％， 直径为30nm，超声30min，搅拌60min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂聚乙二醇粉末溶于50ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为20kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到支化聚乙烯亚胺溶液溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与支化聚乙烯亚胺的质量比为1∶10；滴加完成后，200w超声30min，搅拌60min使之充分混合，将得到的混合体系在65℃下油浴36小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得支化聚乙烯亚胺-碳纳米管(pei-cnts)分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加到(1)中的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与nhs的质量比为6∶1，支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与edc的质量比为7∶1，支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为500∶1，10000r/min离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌，反应50小时，其中包含clic1抗体的支化聚乙烯亚胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶2，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例3肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

四乙烯五胺溶液：将0.5g四乙烯五胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0322g羧基化多壁碳纳米管分散在100ml去离子水中，该羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为0.5％，直径为20nm，超声20min，搅拌15min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为2μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂化聚乙二醇粉末溶于100ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为0.5kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到四乙烯五胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与四乙烯五胺的质量比为1∶5；滴加完成后，200w超声10min，搅拌30min使之充分混合，将得到的混合体系在65℃下油浴20小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得四乙烯五胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的四乙烯五胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中四乙烯五胺-碳纳米管与nhs的质量比为10∶1，四乙烯五胺-碳纳米管与edc的质量比为12∶1，四乙烯五胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为100∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多 余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的四乙烯五胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的四乙烯五胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌，反应45小时，其中包含clic1抗体的四乙烯五胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶3，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-四乙烯五胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例4肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

三乙烯四胺溶液：将2.1508g三乙烯四胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0644g羧基化多壁碳纳米管分散在50ml去离子水中，所述羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为3％，直径为30nm，超声30min，搅拌60min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂聚乙二醇粉末溶于50ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为20kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到三乙烯四胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与三乙烯四胺的质量比为1∶20；滴加完成后，200w超声10min，搅拌30min使之充分混合，将得到的混合体系在65℃下油浴20小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得三乙烯四胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的三乙烯四胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中三乙烯四胺-碳纳米管与nhs的质量比为3∶1，三乙烯四胺-碳纳米管与edc的质量比为4∶1，三乙烯四胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为50∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的三乙烯四胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的三乙烯四胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌，反应50小时，其中包含clic1抗体的三乙烯四胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶5，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-三乙烯四胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例5肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

聚丙烯胺溶液：将0.5g聚丙烯胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0322g羧基化多壁碳纳米管分散在100ml去离子水中，该羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为0.5％，直径为20nm，超声20min，搅拌15min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为2μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂化聚乙二醇粉末溶于100ml去 离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为0.5kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到聚丙烯胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与聚丙烯胺的质量比为1∶3；滴加完成后，200w超声10min，搅拌30min使之充分混合，将得到的混合体系在75℃下油浴20小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得聚丙烯胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的聚丙烯胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中聚丙烯胺-碳纳米管与nhs的质量比为2∶1，聚丙烯胺-碳纳米管与edc的质量比为3∶1，聚丙烯胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为10∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌反应45小时，其中包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶10，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-聚丙烯胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例6肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

聚丙烯胺溶液：将2.1508g聚丙烯胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0644g羧基化多壁碳纳米管分散在50ml去离子水中，所述羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为3％，直径为30nm，超声30min，搅拌60min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂聚乙二醇粉末溶于50ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为20kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到聚丙烯胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与聚丙烯胺的质量比为1∶1；滴加完成后，200w超声30min，搅拌60min使之充分混合，将得到的混合体系在85℃下油浴36小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得聚丙烯胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的聚丙烯胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中聚丙烯胺-碳纳米管与nhs的质量比为8∶1，聚丙烯胺-碳纳米管与edc的质量比为10∶1，聚丙烯胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为5∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌反应50小时，其中包含clic1抗体的聚丙烯胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为1∶3，10000r/min离 心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-聚丙烯胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例7肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

聚丙烯酰胺溶液：将0.5g聚丙烯酰胺胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0322g羧基化多壁碳纳米管分散在100ml去离子水中，该羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为0.5％，直径为20nm，超声20min，搅拌15min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为2μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂化聚乙二醇粉末溶于100ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为0.5kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到三乙烯四胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与聚丙烯酰胺-碳纳米管的质量比为1∶50；滴加完成后，200w超声10min，搅拌30min使之充分混合，将得到的混合体系在90℃下油浴20小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得聚丙烯酰胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的聚丙烯酰胺-碳纳米管分散 体系中，室温反应24h，其中聚丙烯酰胺-碳纳米管与nhs的质量比为2∶1，聚丙烯酰胺-碳纳米管与edc的质量比为1∶1，聚丙烯酰胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为20∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌反应50小时，其中包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为2∶1，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-聚丙烯酰胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

实施例8肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

一、溶液的配制

聚丙烯酰胺溶液：将2.1508g聚丙烯酰胺溶于100ml的去离子水中，超声、搅拌使之溶解；

羧基化多壁碳纳米管分散体系：将0.0644g羧基化多壁碳纳米管分散在50ml去离子水中，所述羧基化多壁碳纳米管的羧基的质量百分比含量为3％，直径为30nm，超声30min，搅拌60min使之分散，分散后体系中的羧基化多壁碳纳米管的长度为0.5μm；

磷脂化聚乙二醇溶液：将0.0052g磷脂聚乙二醇粉末溶于50ml去离子水中，搅拌使之溶解，磷脂化聚乙二醇的分子量为20kda。

二、肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的制备

(1)将羧基化多壁碳纳米管分散体系逐滴加入到聚丙烯酰胺溶液中，伴随超声、搅拌，其中羧基化多壁碳纳米管与聚丙烯酰胺的质量比为1∶5；滴加完成后，200w超声30min，搅拌60min使之充分混合，将得到的混合体 系在65℃下油浴36小时，冷却至室温，在10000r/min转速下离心15min，用去离子水充分抽滤洗涤，去离子水分散，制得聚丙烯酰胺-碳纳米管分散体系；

(2)配制1ml浓度为1mg/ml、ph＝4.5的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液，磁力搅拌分散20分钟后加入0.2ml2mg/mln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液，继续搅拌15分钟，加入0.5ml2mg/ml1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液，反应5分钟后，加入clic1抗体1mg，反应30min，反应结束后，将其滴加入到(1)中的聚丙烯酰胺-碳纳米管分散体系中，室温反应24h，其中聚丙烯酰胺-碳纳米管与nhs的质量比为1∶1，聚丙烯酰胺-碳纳米管与edc的质量比为2∶1，聚丙烯酰胺-碳纳米管与clic1抗体的质量比为300∶1，在10000r/min转速下离心洗涤以除去多余的nhs、edc和clic1抗体，用去离子水重新分散，得到包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管的分散体系；

(3)将磷脂化聚乙二醇溶液逐滴加入到(2)中包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管的分散体系，伴随超声搅拌，反应50小时，其中包含clic1抗体的聚丙烯酰胺-碳纳米管与磷脂化聚乙二醇的质量比为3∶1，10000r/min离心10min，用去离子水充分抽滤洗涤除去多余的磷脂化聚乙二醇后用去离子水重新分散，制得含有clic1抗体的磷脂化聚乙二醇-聚丙烯酰胺-碳纳米管分散体系；

(4)10000r/min离心洗涤，将离心所得沉淀真空干燥24小时，制得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂。

效果实施例1肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂体外毒性检测

于dmem或rpml1640培养基中37℃，5％co2培养胆囊癌noz细胞株、人肺成纤维细胞hfl1细胞株、人肝细胞qsg-7701细胞株和大鼠心肌h9c2细胞株，细胞以96孔密度接种于培养皿，贴壁过夜。

设置对照组与实验组：对照组用pbs溶液作为对照加入各培养的细胞中，实验组将实施例1制备所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂，37℃孵育48 小时，检测细胞存活率。采用梯度稀释实施例1制备的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂，稀释后的浓度分别是0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.001mg/ml、0.0005mg/ml，每个浓度梯度重复5次。结果显示与对照相比，细胞的存活率差异不大。

用实施例2-8所述制得的肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂重复上述试验，结果显示，与对照组相比，细胞的存活率均相差不大。

因此本发明所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂毒性低，有较高的生物安全性。

效果实施例2碳纳米管光声造影剂分散性检测

取羧基化多壁碳纳米管和本发明实施例1-8所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂以25℃，超声分散10分钟，分散到pbs溶剂中，经检测发现，未经修饰的碳纳米管光声造影剂其分散度为0，完全不分散，而本发明所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的分散度为分散性好，其分散性有显著提高，基本上呈单分散状态，其中实施例2的镜检结果具体见图2。从所得实验数据可见，本发明所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂具有分散性好的优点。

效果实施例3肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂体外稳定性检测

取羧基化多壁碳纳米管和本发明实施例1-8制备所得高分散碳纳米管光声造影剂，分散到溶剂中，其中羧基化多壁碳纳米管的浓度是0.3mg/ml，本发明肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的浓度是0.5mg/ml，室温储存96小时，其中未经修饰的碳纳米管光声造影剂在储存24小时后即产生沉淀，而本发明肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂在同样条件下储存24小时，48小时，72小时和96小时后状态仍然十分稳定，其性状均匀，未产生任何沉淀，其中本发明实施例1所制得的高分散碳纳米管光声造影剂的稳定性检测结果见图3。从所得实验数据可见，本发明所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂的有显著的提高。

效果实施例4肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂成像效果检测

(1)饲养5-6周龄裸鼠；

(2)采用尾部静脉方式将实施例4制备所得肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂通过尾部注射方式注入荷瘤裸鼠体内，注射量为0.2ml，对照组注射pbs缓冲溶液和不含clic1抗体的碳纳米管光声造影剂；

(3)注射造影剂后，利用光声成像实验方法检测所得光声造影剂的光声响应信号。采用光声检测专用opo脉冲激光器(美国opotek公司生产。)。以纯水作为对照组，并以200－1000nm波段的连续波长激光辐照试样，通过对透射光的光谱分析，获得试样的光吸收谱。泵浦波长532nm，脉宽<2ns，重复频率10hz；采用的聚焦式超声传感器中心频率为15mhz，带宽80％。其结果显示：在局部注射本发明光声造影剂后荷瘤裸鼠的肿瘤部位出现明显的成像增强效果(见图4)。但是注射pbs缓冲溶液(见图5a)和不含clic1抗体的碳纳米管光声造影剂(图5b)肿瘤成像效果比较差，说明本发明肿瘤靶向的碳纳米管光声造影剂具有肿瘤靶向功能。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。