青口贝水提物在具有抗氧化和神经保护作用的保健食品中的应用的制作方法

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种青口贝提取物及其制备方法与应用。

背景技术：

随着全球人口老龄化趋势的加剧，以特定神经细胞和组织逐渐衰退乃至死亡为主要特征的神经退行性疾病已经成为严重危害人类生命健康和生活质量的重大疾病，并引起国际生物医药领域的关注。由于神经退行性疾病具有复杂的病理过程，受氧化应激和蛋白质异常聚集等多种因素的影响，因此当机体处于氧化胁迫环境时，其内源性活性氧聚集增加，使得胞内抗氧化代谢失衡，抗氧化酶的活性降低，同时损伤脂质、蛋白质和dna等生物大分子物质，造成细胞内酶活性变化、代谢紊乱、dna损伤和细胞凋亡。此外，蛋白质异常聚集形成的产物也会诱发氧化、炎症等多种胁迫反应，由此导致慢性、持续性神经元的损伤、坏死并导致神经退行性病变。因此，通过抑制活性氧的产生和疾病蛋白质的异常聚集是研究神经保护作用的重要策略。

传统医学对延年益寿和神经保护有悠久的研究历史，而丰富的海洋生物资源种类则为之提供了庞大的资源库。自20世纪70年代以来，人们已经从海洋生物中分离出数万种新型化合物，包括肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等类型。其中，肽类是海洋生物活性物质中数量最庞大的一类化合物，达数万种之多，包括海洋肽类毒素与海洋生物活性肽等。多肽类药物具有分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小、活性高等优点。此外，由于海洋生物生存的特定环境，海洋生物多肽的结构与陆生动植物肽(糖肽)有很大不同，多为小分子环肽，含有丰富的d型氨基酸、羟基酸、噻酚、恶唑环，有的还含有烯键与炔键，这大大提高了肽的生物稳定性及生物利用度。研究证实生物活性肽具有多种药理活性，可用于预防和延缓衰老及衰老相关的多种疾病。因此，发掘海洋生物资源中具有抗氧化、延缓衰老、神经保护作用的活性成分有助于促进我国海洋资源的综合开发与利用。

青口贝，属双壳类软体动物，中国北方俗称为海虹，南方俗称为青口。青口贝肉的干制品称作淡菜，是驰名中外的海产食品之一，具有较高的经济和药食价值，其蛋白质含量高达59％，含8种人体必需的氨基酸，营养价值高于一般贝、鱼、虾、肉类等，具有补肝益肾、调经活血的功效。明代医家倪朱谟对其功效赞叹“淡菜，补虚养肾之药也”，是一味补肾填精的药食两用之物；《本草拾遗》记载道：“主虚羸劳损，因产瘦瘠，血气结积，腹冷、肠鸣、下痢，腰疼、带下、疝瘕”。现代医学研究表明，贻贝多肽具有降血压、增强免疫、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等方面的功效。

公开号为cn102952838a、发明名称为“一种免疫增强贻贝酶解多肽的制备方法及其相应片剂的制备方法”的中国专利公开了利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别水解贻贝蛋白后，经脱盐、浓缩和喷雾干燥得免疫增强贻贝酶解多肽，制得的片剂用作老年人和体弱多病者的日常保健产品。公开号为cn103710414a、发明名称为“贻贝寡肽的制备方法及其应用”的中国专利公开了利用碱性冷提法提取贻贝蛋白，经复合酶解和超滤后的贻贝寡肽，并以小鼠和果蝇模型验证其抗氧化和延衰的功效，应用于制备抗氧化活性和延缓衰老作用的食品。然而碱性冷提法条件不够温和，会破坏蛋白的风味和色泽，同时可能造成环境污染。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化和神经保护作用的青口贝提取物及其制备方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种青口贝提取物的制备方法，青口贝去壳取肉加水进行组织匀浆，匀浆液离心取上清，过滤收集滤液。

其中，所述水的加入量为青口贝肉的3倍～10倍。

在一些实施方案中，本发明所述青口贝提取物的制备方法中所述离心为5000g～15000g。

在一些实施方案中，本发明所述青口贝提取物的制备方法中所述离心时间为10min～50min。

在一些实施方案中，本发明所述青口贝提取物的制备方法中所述过滤为0.45μm孔径的滤膜过滤。

在一些优选实施方案中，所述滤膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

进一步的，在一些实施方案中，本发明所述青口贝提取物的制备方法还包括对滤液进行浓缩、干燥的步骤。

优选的，所述干燥为冷冻干燥。

本发明还提供了上述制备方法制得的青口贝提取物。

自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。因此，通过测定对自由基的清除率，可以反映以清除活性氧自由基为主的抗氧化能力。本发明所述青口贝提取物加入dpph溶液，于520nm波长下测定吸光度，以加入等体积水开始计时，于520nm波长下测定空白吸光度，计算dpph自由基清除率。结果显示本发明所述青口贝提取物，能够显著地清除体外dpph自由基，且呈现出剂量依赖性的作用效果。

百草枯是一类电子受体，作用于细胞的氧化还原反应，在细胞内活化为氧自由基是毒作用的基础，所形成的过量超氧化阴离子自由基及过氧化氢(h2o2)等可引起多组织器官细胞膜脂质过氧化，从而造成多系统组织器官的损害。因此，抑制其对细胞的氧化损伤能够有效缓解神经毒性。本发明所述青口贝提取物分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测所述文蛤多肽对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本发明所述青口贝提取物可以显著延长秀丽线虫的氧化胁迫存活率，提高秀丽线虫耐氧化胁迫条件的能力，缓解机体因氧化胁迫而产生早衰的问题。

在秀丽线虫体内，几乎所有与长寿相关的基因表达都与抵抗环境胁迫有关，例如氧化、缺氧、热激、uv辐射和重金属等胁迫条件。除抗氧化胁迫以外，对机体抗热激胁迫的能力也指示着延缓衰老的作用。本发明将所述青口贝提取物加入到l1期的野生型秀丽线虫幼虫中培养后进行反复热激培养直到所有秀丽线虫死亡，检测所述青口贝提取物对热激胁迫的影响。结果显示，本发明所述青口贝提取物能够延长秀丽线虫在热激胁迫条件下的生存时间，提高存活率，具有抗热激胁迫活性，缓解由热激胁迫造成的细胞损伤。

本发明将所述青口贝提取物加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养后定时统计秀丽线虫的存活情况，检测所述青口贝提取物对秀丽线虫寿命的影响。结果显示，本发明所述青口贝提取物能够延长秀丽线虫在自然条件下的存活时间，具有延缓衰老进程的作用。

转基因秀丽线虫ha759可以在ash神经元中表达polyq蛋白。由于polyq蛋白是亨廷顿疾病中的关键致病蛋白，抑制其聚集可有效缓解神经毒性。本发明将所述青口贝提取物加入l1期的转基因秀丽线虫ha759幼虫中，置于16℃培养36h后，于23℃再次培养36h后收集线虫备用。将趋化板中间用30μl8m甘油划一条直线，将平板分为a和b区。a区距边缘0.5cm处点上2μl1m的nan3，同侧距边缘1cm处点上2μl0.5％的苯甲醛乙醇溶液。在b区距甘油1cm处的平行线上均匀标记4个虫液位点，板子放入23℃培养箱90min后取出，计算a区和b区线虫条数，计算回避指数(avoidanceindex，ai)。结果显示本发明所述青口贝提取物能够提高秀丽线虫ha759的避化率，有效的抑制蛋白质的异常聚集，从而降低疾病蛋白的神经毒性，起到神经保护的作用。

因此，本发明提供了所述青口贝提取物在制备抗氧化或神经保护作用的药物中的应用。

本领域技术人员可将本发明所述青口贝提取物直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。

本发明所述青口贝提取物还可以制备成抗氧化或神经保护作用的保健品。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种青口贝提取物及其制备方法与应用。本发明所述青口贝提取物的制备方法为青口贝去壳取肉加水进行组织匀浆，匀浆液离心取上清，过滤收集滤液。本发明提供的制备方法，能够充分利用青口贝丰富资源得到具有抗衰老和神经保护作用的青口贝提取物。实验结果表明本发明所述制备方法制得的青口贝提取物均具有很好的抗衰老和神经保护作用，可以用于制备成抗衰老和神经保护作用的药物或者抗衰老和神经保护作用的保健品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例4dpph自由基清除率实验中不同浓度的实施例1制备的青口贝提取物的dpph自由基清除率；

图2示实施例5抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中不同浓度的实施例1制备的青口贝提取物对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；

图3示实施例6抗热激胁迫实验中不同浓度的实施例1制备的青口贝提取物对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；

图4示实施例7秀丽线虫寿命实验中不同浓度的实施例1制备的青口贝提取物对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；

图5示实施例8秀丽线虫避化实验中不同浓度的实施例1制备的青口贝提取物对秀丽线虫的避化率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做详细阐述。

实施例1、青口贝提取物的制备

以青口贝为材料，去壳取肉，清水洗净后，以1:3的比例加入水，进行组织匀浆，匀浆液经4℃、5000g离心50min。取上清液，经0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤液经浓缩、冷冻干燥处理，获得青口贝提取物干粉。

实施例2、青口贝提取物的制备

以青口贝为材料，去壳取肉，清水洗净后，以1:10的比例加入水，进行组织匀浆，匀浆液经4℃、15000g离心10min。取上清液，经0.45μm孔径的尼龙膜过滤，将滤液经浓缩、冷冻干燥处理，获得青口贝提取物干粉。

实施例3、青口贝提取物的制备

以青口贝为材料，去壳取肉，清水洗净后，以1:5的比例加入水，进行组织匀浆，匀浆液经4℃、10000g离心20min。取上清液，经0.45μm孔径的硝酸纤维素膜过滤，将滤液经浓缩、冷冻干燥处理，获得青口贝提取物干粉。

实施例4、dpph自由基清除率实验

将实施例1-3制备的青口贝提取物分别加水溶解配制成浓度为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml的样品溶液，对照组为等体积的水，分别依次加入dpph溶液，于520nm波长下测定吸光度，以加入等体积水开始计时，于520nm波长下测定空白吸光度，计算dpph自由基清除率。结果如图1所示。

其中，dpph自由基清除率计算公式如下：

dpph自由基清除率(％)＝[1-(asample-a0sanple)/(acontrol-a0control)]×100％

式中，asample表示青口贝提取物组的吸光度值，acontrol表示对照组的吸光度值，a0sample表示青口贝提取物组的空白吸光度值，a0control表示对照组的空白吸光度值。自由基清除率以mean±sd表示，采用t检验比较多肽组和对照组的差异性。

由图1结果可见实施例1制备的青口贝提取物在0.125mg/ml～4mg/ml的浓度范围内，能够显著地清除体外dpph自由基，且呈现出剂量依赖性的作用效果。

实施例2的青口贝提取物和实施例3制备的青口贝提取物在0.125mg/ml～4mg/ml的浓度范围内，也均能够显著地清除体外dpph自由基，且呈现出剂量依赖性。

实施例5、百草枯氧化胁迫实验

将实施例1-3制备的青口贝提取物以0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、和2mg/ml浓度，分别加至50mm百草枯造模的秀丽线虫培养液中，同时设置：阳性对照组加以2mg/ml的gsh作为阳性受试物，空白对照组加以等体积的s.medium。各组置于20℃培养24h后，定时统计秀丽线虫存活的比率，直至全部虫子死亡。存活率以生存曲线表示，采用kaplan-meier法分析比较青口贝提取物组和空白对照组的差异性。结果如图2所示。

结果显示实施例1制备的青口贝提取物在0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度时能够延长氧化胁迫条件下秀丽线虫的生存时间，提高存活率。

而实施例2的青口贝提取物和实施例3制备的青口贝提取物在0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度时也均能够延长氧化胁迫条件下秀丽线虫的生存时间，提高存活率。

表明本发明所述青口贝提取物能够缓解由氧化胁迫引起的早衰现象。

实施例6、热激存活试验

将实施例1-3制备的青口贝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml浓度分别加至l1期秀丽线虫的培养基中，对照组加入等体积的s.medium，20℃条件下恒温培养至成虫期后，将虫子转移到之前准备好的3cm的空白ngm培养板上，每个给药浓度处理的秀丽线虫转至三个ngm培养板，每板约50条虫子。将转移好虫子的培养板拿至37℃恒温箱进行热激处理1h后取出，快速统计虫子的死亡数目，然后每隔1h再热激1h，持续统计秀丽线虫存活率，直至所有线虫全部死亡。结果如图3所示。

结果显示实施例1制备的青口贝提取物在0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度时能够增加秀丽线虫热激条件下的存活时间。

而实施例2的青口贝提取物和实施例3制备的青口贝提取物在在0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度时也均能够增加秀丽线虫热激条件下的存活时间。表明青口贝提取物能够缓解由于热激造成的细胞损伤。

实施例7、寿命试验

将实施例1-3制备的青口贝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml分别饲喂成虫初期的野生型秀丽线虫，对照组加入等体积的s.medium，将培养板置于20℃进行培养，以给药的时间点记为寿命统计的第0天，之后每隔1天统计一次各组秀丽线虫存活率，直至所有虫子全部死亡。存活率以生存曲线表示，并采用kaplan-meier法分析比较青口贝提取物组和对照组的差异性。结果如图4所示。

结果显示实施例1制备的青口贝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度给药处理后，相较于对照组，各组显著地能够延长秀丽线虫的平均寿命，且在改浓度范围内呈现浓度依赖性。

而实施例2的青口贝提取物和实施例3制备的青口贝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的浓度给药处理后，相较于对照组，各组均能够显著地延长秀丽线虫的平均寿命，且在改浓度范围内呈现浓度依赖性

表明本发明所述青口贝提取物具有延缓衰老进程的作用。

实施例8、避化试验

将实施例1-3制备的青口贝提取物以0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml浓度分别加入l1期的转基因秀丽线虫ha759幼虫中，对照组加入等体积的smedium，置于16℃培养36h后，于23℃再次培养36h后收集线虫备用。将趋化板中间用30μl8m甘油划一条直线，将平板分为a和b区。a区距边缘0.5cm处点上2μl1m的nan3，同侧距边缘1cm处点上2μl0.5％的苯甲醛乙醇溶液。在b区距甘油1cm处的平行线上均匀标记4个虫液位点，板子放入23℃培养箱90min后取出，计算a区和b区线虫条数，并用公式计算回避指数(avoidanceindex，ai)。ai的统计结果以mean±sd表示，采用t检验比较青口组和对照组的差异性。结果如图5所示。

其中，回避指数的计算公式为：

ai＝(a区的线虫数量-b区的线虫数量)/线虫总数量

结果显示实施例1制备的青口贝提取物在1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml浓度时，均能够提高秀丽线虫ha759的避化率。

而实施例2的青口贝提取物和实施例3制备的青口贝提取物在1mg/ml、2mg/ml和4mg/ml浓度时，也均能够提高秀丽线虫ha759的避化率。说明本发明所述青口贝提取物能够有效的抑制蛋白质的异常聚集，从而降低疾病蛋白的神经毒性，起到神经保护的作用。